Misurazione quantitativa delle proteine intratecalliamente sintetizzate nei topi

Riepilogo

Livelli elevati di proteine del fluido spinale possono essere il risultato della diffusione della proteina plasmatica attraverso una barriera emato-encefalica alterata o sintesi intratea. In questo articolo viene presentato un protocollo di test ottimizzato che aiuta a discriminare entrambi i casi e fornisce misurazioni quantitative delle proteine sintetizzate intrathecally.

Abstract

Il liquido cerebrospinale (CSF), un fluido trovato nel cervello e nel midollo spinale, è di grande importanza sia per la scienza di base che clinica. L'analisi della composizione delle proteine CSF fornisce informazioni cruciali nella ricerca sulle neuroscienze di base e sulle malattie neurologiche. Un avvertimento è che le proteine misurate in CSF possono derivare sia dalla sintesi intrateca che dalla trasposizione dal siero, e l'analisi delle proteine del CSF può determinare solo la somma di questi due componenti. Per distinguere tra la trasposizione proteica dal sangue e le proteine prodotte intratelamente nei modelli animali e negli esseri umani, le misurazioni di profilazione delle proteine CSF utilizzando strumenti di analisi delle proteine convenzionali devono includere il calcolo dell'albumina CSF/serum quotient (Q_albumin),un marcatore dell'integrità dell'interfaccia emato-encefalica (BBI), e l'indice proteico_(proteinaQ /Qalbumin ), una stima della sintesi di proteine intrateche. Questo protocollo illustra l'intera procedura, dalla raccolta del CSF e del sangue ai calcoli dei quozienti e degli indici, per la misurazione quantitativa della sintesi delle proteine intrateche e la compromissione della BBI nei modelli murini di disturbi neurologici.

Introduzione

Il liquido cerebrospinale (CSF), un liquido chiaro e incolore che circonda il cervello e il midollo spinale, ha una grande importanza clinica e scientifica di base. Il CSF conserva l'ambiente elettrolitico del sistema nervoso centrale (CNS), bilancia lo stato di base dell'acido sistemico, fornisce nutrienti alle cellule neuronali e gliali, funziona come sistema linfatico per il SNC e trasporta ormoni, neurotrasmettitori, citochine e altri neuropepti in tutto il CNS¹. Così, poiché la composizione csF riflette l'attività del SNC, questo fluido offre un prezioso, anche se indiretto, accesso per caratterizzare lo stato fisiologico e patologico del SNC.

CSF è stato utilizzato per diagnosticare condizioni che colpiscono il SNC per oltre un centinaio di anni, e per la maggior parte di questo tempo, è stato studiato principalmente dai medici come strumento diagnostico. Tuttavia, negli ultimi anni i neurobiologi hanno riconosciuto il potenziale della CSF per studiare la fisiopatologia del SNC. In particolare, nel regno delle neuroscienze sono stati introdotti diversi strumenti di analisi delle proteine ad alto contenuto di velocità, consentendo uno studio dettagliato della composizione delle proteine del CSF, con l'aspettativa che questa analisi possa contribuire a fornire informazioni sui cambiamenti dinamici all'interno del SNC.

Gli sviluppi tecnologici nelle tecniche di immunoanalisi multiplex come le tecnologie Luminex e Simoa^2,3, forniscono ai ricercatori oggi la capacità di rilevare centinaia di proteine a concentrazioni molto basse. Inoltre, queste stesse tecnologie consentono l'uso di piccoli volumi di campioni, promuovendo così studi su piccoli animali, compresi i topi, in cui volumi di campioni limitati di CSF hanno impedito caratterizzazioni dettagliate del fluido fino a poco tempo fa.

Tuttavia, un avvertimento è che le proteine misurate in CSF possono derivare da sintesi intrateca e/o trasuda dal siero a causa di un'interfaccia emato-encefalica danneggiata (BBI). Sfortunatamente, l'analisi delle proteine del CSF da sola può determinare solo la somma di questi due componenti. Per distinguere tra proteine prodotte innodate e intratelamente, le misurazioni delle proteine CSF utilizzando qualsiasi strumento di analisi delle proteine disponibile devono essere regolate per la variabilità individuale nelle concentrazioni di siero e l'integrità delle barriere. Tuttavia, anche se questa regolazione è comunemente utilizzata nella pratica clinica, ad esempio, l'indice CSF IgG, che ha un'elevata sensibilità per rilevare la sintesi intrateca IgG^4,5,6, ad oggi pochissimi studi di ricerca hanno corretto le concentrazioni di proteine CSF per la concentrazione di siero e l'integrità della barriera^7,8.

Attualmente, l'approccio Reibergram è il modo migliore per determinare la funzione di barriera e la sintesi intratecala delle proteine. Si tratta di una valutazione grafica nei diagrammi quoziente CSF/siero che analizza, in modo integrato, sia la barriera (di)funzione che la sintesi delle proteine intrateche, riferendosi a una proteina esclusivamente derivata dal sangue^9,10. L'abbondante albumina proteica è solitamente scelta come proteina di riferimento perché è prodotta solo nel fegato e perché la sua dimensione, circa 70 kDa, è intermedia tra proteine piccole e grandi¹¹. Il diagramma di analisi è stato definito per la prima volta da Reiber e Felgenhauer nel 1987 per le principali classi di immunoglobuine (Igs)¹¹, essendo empiricamente basate sui risultati ottenuti dall'analisi di migliaia di campioni umani⁹. L'approccio è stato successivamente confermato dall'applicazione delle due leggi di diffusione dei due Fick nella teoria della diffusione molecolare/velocità di flusso¹². Tale teoria dimostra la diffusione di una proteina attraverso la barriera ha una distribuzione iperbolica e può spiegare quantitativamente la dinamica delle proteine nel CNS^9,13. Nel complesso, il vantaggio di utilizzare il Reibergram per dimostrare la sintesi delle proteine intratecali è che identifica contemporaneamente la frazione proteica che entra nel CSF dal siero e la quantità di proteine presenti nel CSF a causa della produzione locale.

Il presente articolo e il relativo protocollo descrivono l'intera procedura, dalla raccolta del CSF e del sangue ai calcoli finali che correggono i livelli di proteine CSF, per la misurazione quantitativa della sintesi delle proteine intrateche in modelli murini di neurologia Disturbi. Questa procedura fornisce una linea di base rispetto alla quale valutare (1) l'origine patofisiologica di qualsiasi proteina CSF e (2) la stabilità e il significato funzionale dell'integrità della barriera. Questa procedura e questo protocollo non sono solo utili per valutare campioni di CSF dei topi, ma sono anche utili nell'analisi della CSF in una moltitudine di modelli animali di malattie neurologiche e pazienti umani.

Protocollo

Tutto il lavoro sugli animali utilizza protocolli esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Geisel School of Medicine di Dartmouth.

1. Raccolta di fluidi

NOTA: sono necessari sia il siero che il CSF. Due protocolli per ogni raccolta di fluidi sono necessari per la sopravvivenza e necropsia.

1. Raccolta di siero e CSF con procedure di sopravvivenza
   NOTA: Per la raccolta dei fluidi di sopravvivenza, la raccolta del siero dovrebbe precedere la raccolta di CSF in quanto è una procedura meno invasiva. Il CSF deve essere ottenuto entro una settimana dall'estrazione del siero.
   1. Procedura di sanguinamento retroorbitale per la raccolta del siero.
      NOTA: Questa procedura è per la sopravvivenza del sanguinamento dei topi¹⁴. La procedura descritta si applica a qualsiasi età, sesso e sforzo di topi. Poiché le regole Di IACUC impongono che un volume di sangue massimo dell'1% del peso corporeo possa essere rimosso come un singolo prelievo di sangue, si raccomanda che la procedura venga eseguita solo su topi che pesano più di 15 g.
      1. Spostare le gabbie contenenti topi dal rack in un'area di lavoro appropriata. Preparare la macchina del gas per anestesia attivando il misuratore di flusso di ossigeno a 1 L/min.
      2. Posizionare l'animale nella camera di induzione e chiudere saldamente il coperchio. Accendere il vaporizzatore isoflurano al 3,5% e monitorare l'animale fino a reclinata.
      3. Togliere l'animale dalla camera e valutare il livello di anestesia mediante riflesso pedale, cioè un pizzico fermo del piede. Garantire un'adeguata profondità di anestesia prima di eseguire la procedura: la mancanza di risposta a un pizzico fermo indica un'anestesia adeguata.
      4. Restringere il topo anetizzato afferrando la pelle sciolta dietro le orecchie con il pollice e l'indice della mano non dominante. Fai scorrere gli occhi usando l'indice per ritrarre la pelle sopra l'occhio e il pollice per riportare la pelle sotto gli occhi.
      5. Posizionare la punta di una pipetta Pasteur nella presa oculare sotto il bulbo oculare (Figura 1, pannello sinistro), dirigendo la punta a circa 45 gradi verso il centro della presa oculare (Figura 1, pannello destro). Ruotare la pipetta tra le dita durante il passaggio in avanti. Applicare una leggera pressione e poi rilasciare fino a quando il sangue sta entrando nella pipetta.
         NOTA: La quantità massima di sangue che può essere prelevata in una sola volta da questa posizione è di circa l'1% del peso corporeo, ad esempio 0,2 mL da un mouse da 20 g.
      6. Rimuovere delicatamente il capillare per prevenire lesioni all'occhio e posizionare il sangue raccolto in un tubo di centrifuga di 1,5 ml. Chiudere la palpebra e applicare una leggera pressione con garza per evitare ulteriori sanguinamento. Una volta completamente vigile e mobile (di solito 3,5 min), riporta il mouse alla sua gabbia di detenzione.
      7. Lasciare che il sangue si coaguli per 30-60 min a temperatura ambiente (RT), quindi centrizzare il sangue per 10 min a 2.000 g in una centrifuga refrigerata a 4 gradi centigradi. Utilizzando una tecnica di pipetta pulita, raccogliere il siero in una nuova fiala da 0,5 mL. Congelare immediatamente fiala di siero a -80 gradi centigradi.
   2. Raccolta CSF con procedura di sopravvivenza
      NOTA: Questa procedura è per la chirurgia di sopravvivenza, e si basa sul protocollo pubblicato da Liu e Duff nel 2008¹⁵. I topi sono anestesizzati da un cocktail di Ketamina (20 mg/mL), xilazina (0,5 mg/mL) e acepromazina (0,5 mg/mL) somministrato per via peritonea.
      1. Spostare le gabbie contenenti topi dal rack ad un'area di lavoro interventistica designata. Preparare lo spazio chirurgico in un ambiente sterile. Assicurarsi che tutti gli strumenti e i materiali utilizzati siano sterilizzati prima dell'intervento chirurgico.
      2. Pesare il mouse e calcolare il volume di anestesia necessario (0,1 mL di cocktail di anestesia per un mouse da 20 g). Iniettare anestesia intraperitamente¹⁶. Dopo alcuni minuti, provare il mouse pizzicando il piede per garantire un'adeguata anestesia. Se è necessaria più anestetico, iniettare ulteriormente 0,01-0,03 mL del cocktail anestetico.
      3. Utilizzare forbici o un rasoio per radere una piccola area della testa, sull'estremità caudale, mediale sul cranio, per esporre un'area di lavoro abbastanza grande per la raccolta CSF. Posizionare il mouse nella posizione prona sullo strumento stereotaxic e stabilizzare la testa utilizzando le barre dell'orecchio (Figura 2A).
         NOTA: Il mouse è disposto in modo che la testa formi un angolo di quasi 135 gradi con il corpo (Figura 2A). Una volta che l'animale è posizionato, un drappo chirurgico viene utilizzato per mantenere un campo sterile presso il sito chirurgico. Per la raccolta di FILE CSF nei topi sono preferiti chiaramente le tende adesive, in quanto consentono una visualizzazione diretta e più mirata dell'animale.
      4. Swab il sito chirurgico con 30% clorhexidine diacetate. Utilizzando un bisturi sterile, fare un'incisione sagittale della pelle inferiore all'occipite per esporre i muscoli sovrastanti la magna della cisterna.
      5. Con la dissezione smussata con pinze, separare il tessuto sottocutaneo e i muscoli per esporre la cisterna magna (Figura 2B). Utilizzare i microtrattini per tenere i muscoli separati (Figura 2B) ed esporre lo strato meningea dura mater sulla cisterna magna.
      6. Lavare delicatamente con la salina sterile con tamponamenti di fosfato (PBS) per rimuovere eventuali contaminazioni del sangue. Asciugare il dura mater con un tampone di cotone sterile e forare delicatamente la membrana che copre la cisterna magna con un ago da 30 G. Inserire rapidamente e delicatamente un piccolo tubo capillare in vetro per raccogliere CSF (Figura 2C).
         NOTA: La pressione intracranica consente a CSF di fluire spontaneamente nel capillare (Figura 2C). A seconda dell'età e delle dimensioni del topo, da ogni topo si ottengono circa 5-12 l di CSF.
      7. Rimuovere con attenzione il tubo capillare dalla membrana. Collegare il tubo a una siringa da 3 mL attraverso un tubo di polietilene (Table of Materials) e iniettare il CSF raccolto in un tubo etichettato da 0,5 mL ( Figura2D). Tenere le fiale nel ghiaccio.
      8. Chiudere l'incisione utilizzando sutura polidioxanone (PDS) con ago usa e getta e utilizzando suture sepolte¹⁷. Pulire l'area di qualsiasi sangue o tessuto essiccato.
      9. Iniettare i topi, sottocutaneamente o intraperitinalmente¹⁶, con 0,05-0,1 mg/kg di cloruro di buprenorfina come trattamento analgesico. Inoltre, iniettare sottocutaneamente 1 mL di salina sterile per prevenire la disidratazione.
      10. Riposizionare il mouse in una gabbia pulita e calda per il recupero. Una volta che il mouse è mobile e in grado di raggiungere il cibo e l'acqua, posizionare la gabbia sul rack.
      11. Centrifuga CSF per 10 min a 1.000 x g in una centrifuga refrigerata a 4 gradi centigradi. Controllare il grado di contaminazione del sangue mediante ispezione visiva per l'identificazione della xantocromia e la presenza di un pellet rosso nella parte inferiore del tubo. Scartare campioni contaminati dal sangue.
          NOTA: La formula utilizzata per la correzione delle quantità di proteine CSF in campioni contaminati dal sangue si basa su parametri di equazione che includono contenuto proteico in CSF e siero, ematocrito (HCT) e globuli rossi (RBC) contano in CSF e sangue¹⁸. Tuttavia, tale strategia di correzione non può essere facilmente applicata ai campioni di CSF del topo a causa del piccolo volume, limitando così la strategia di correzione a un'ispezione visiva.
      12. Utilizzando una tecnica di pipetta pulita, raccogliere la CSF in un nuovo tubo da 0,2 mL, lasciando dietro di sé il pellet con le cellule. Diluire CSF 1:3 con PBS per ridurre la perdita di volume dovuta all'aerosol. Congelare immediatamente la fiala del CSF a -80 gradi centigradi.
2. Raccolta di siero e CSF con procedure di non sopravvivenza
   NOTA: per la raccolta di fluidi non di sopravvivenza, la raccolta CSF precede la raccolta del siero in quanto il mouse deve avere un impulso.
   1. CSF collection presso necropy
      NOTA: Questa procedura è per la chirurgia non di sopravvivenza, e circa 10-20 L di CSF è ottenuto da ogni topo. Un campo chirurgico sterile è raccomandato, ma non richiesto per la chirurgia non di sopravvivenza.
      1. Spostare le gabbie contenenti topi dal rack in un comodo spazio di lavoro. Seguite i passaggi 1.1.2.2, 1.1.2.7 e 1.1.2.11,1.1.2.12 per la raccolta CSF. Procedere alla sezione 1.2.2 per la raccolta del siero.
   2. Raccolta del sangue tramite puntura intracardiaca (approccio aperto)
      NOTA: I volumi di sangue previsti sono circa il 3% del peso corporeo, ad esempio 0,6 mL da un mouse da 20 g.
      1. Dopo la raccolta CSF assicurarsi che il mouse sia ancora sufficientemente afizzato pizzicando il piede. Se si osserva una qualsiasi reazione, somministrare una seconda dose di anestetico. Se non si osserva alcuna reazione, procedere.
      2. Posizionare l'animale sulla schiena e la pelle di tampone sull'addome con il 70% di alcol. Con le forbici chirurgiche, aprire la cavità toracica ed esporre il cuore. Inserire un ago da 25 G (attaccato a una siringa da 3 mL) nel ventricolo sinistro e applicare delicatamente una pressione negativa sullo stantuffo della siringa. Ritirare l'ago dopo che il sangue è stato raccolto.
      3. Eseguire un metodo secondario di eutanasia come decapitazione o dislocazione cervicale per garantire che l'animale è deceduto.
      4. Spingere lo stantuffo della siringa verso il basso e iniettare il sangue raccolto in una fiala da 1,5 mL. Lasciare coagulare il sangue per 30-60 min a RT e quindi centrificarlo per 10 min a 2.000 x g in una centrifuga refrigerata a 4 gradi centigradi.
      5. Utilizzando la tecnica della pipetta pulita, raccogliere il siero in una nuova fiala da 0,5 mL. Congelare immediatamente fiala di siero in un congelatore -80 gradi centigradi.

2. Analisi delle proteine

1. Utilizzare un metodo preferito, ad esempio la tecnologia Luminex, per quantificare le proteine bersaglio e l'albumina in campioni di siero e CSF corrispondenti.
   NOTA: Qui viene fornito un esempio con la tecnologia magnetica Luminex, ma praticamente qualsiasi tecnica che misura la quantità di proteine, compresi i saggi immunosorbena legati agli enzimi (ELAISA), può essere applicata al protocollo attuale. Idealmente, i campioni di CSF e siero vengono eseguiti sia per l'albumina che per le proteine target sulla stessa piattaforma. Le condizioni di analisi devono essere ottimizzate per fasi cruciali del protocollo, come la concentrazione di accoppiamento antigene-perline, le diluizioni dei campioni di siero e CSF, le curve standard più adatte per ogni analita e la composizione del buffer per ridurre la reattività non specifica. Se un kit commerciale viene utilizzato per la misurazione di proteine, ad esempio il kit di isotipizzazione dell'immunoglobulina (Tabella dei materiali) utilizzato per ottenere i dati presentati inFigura 3, le istruzioni dei produttori devono essere seguite.
   1. Al momento dello scongelamento e prima dell'analisi, centrifugare campioni di CSF e siero (2.000 x g per 10 minuti) e utilizzare il supernatale per prevenire l'intasamento delle piastre filtranti e/o della sonda. Seguire la procedura di valutazione fornita con il kit per le diluizioni di campione appropriate. In caso contrario, determinare la diluizione appropriata per ogni analita e fluido. Diluire i campioni in PBS di conseguenza.
      NOTA: Se non esistono indicazioni o istruzioni specifiche, è necessario stabilire diluizioni per ciascun analita e fluido prima del test di studio, determinando gli intervalli di diluizione appropriati necessari per ottenere stime di concentrazione che rientrano nella maggior parte dei casi gamma affidabile di una curva standard. Conoscere le caratteristiche del campione biologico da analizzare, ad esempio concentrazioni fisiologiche e patologiche nel fluido, permette di provare diverse diluizioni con campioni di basso, medio e alto contenuto di analita. Se l'intervallo previsto di concentrazioni nei campioni è noto a priori, le diluizioni possono essere selezionate dopo aver calcolato quante volte il campione deve essere diluito per essere all'interno dell'intervallo di curve standard scelto.
      AVVISO: Calcolando i fattori di diluizione, ricordate che il CSF è già stato diluito 1:3.
   2. Preparare una curva standard per ogni proteina di interesse, ad esempio albumina e IgG, utilizzata per generare dati nella Figura 3,diluindo serialmente le proteine standard di riferimento. Durante la preparazione delle curve standard, mescolare accuratamente ogni maggiore concentrazione prima di effettuare la diluizione successiva.
      NOTA: Indipendentemente dal metodo di quantificazione scelto, è essenziale includere una curva standard ogni volta che il test viene eseguito per stimare la concentrazione di proteine nei campioni. La scelta migliore per uno standard di riferimento è una concentrazione purificata e nota della proteina di interesse. La scelta delle diluizioni specifiche, nonché il numero di punti dati e repliche utilizzati per definire la curva standard, dipende dal grado di non linearità nella curva standard.
   3. Selezionare i set di perline magnetiche accoppiati con anticorpo appropriati (Tabella dei materiali). Per le singole fiale di perline, sonicare ciascuna fiala per 30 s e vortice per 1 min. Preparare una "miscela di perline di lavoro" diluindo le scorte di perline ad una concentrazione finale di 50 perline di ogni set / s nel tampone di assaggio / lavaggio (PBS, 1% di albumina di siero bovino [BSA]). Aggiungete 50 l di perline miste ad ogni pozzo in una piastra piatta di 96 pozze (Tabella dei materiali).
      AVVISO: Le perle fluorescenti sono sensibili alla luce. Pertanto, devono essere protetti dall'esposizione prolungata alla luce durante tutta la procedura.
   4. Creare un diagramma della posizione di sfondi, standard ed esempi in un foglio di lavoro mappa benfile.
   5. Aggiungete 50 l di assaggio/lavaggio a ogni po' di fondo e 50 l unpo di ogni standard ai pozze per la curva standard. Caricare 50 mL di ogni campione diluito per ultimo nei pozzi appropriati. Avvolgere la piastra con un foglio e incubare con agitazione (800 rpm) su uno shaker di piastra per 30 min a RT.
   6. Posizionare la piastra su un magnete portatile (Tavolo dei materiali) e appoggiare la piastra sul magnete per s 60 s per consentire la completa impostazione di perline magnetiche. Rimuovere il contenuto del pozzo decantando delicatamente la piastra e toccare la piastra su pastiglie assorbenti per rimuovere il liquido residuo.
   7. Lavare la piastra rimuovendola dal magnete, aggiungendo 200 l di tampone di assaggio/lavaggio, agitando per 30 s, e infine ricollegandola al magnete. Ripetere il lavaggio 3x.
   8. Diluire l'anticorpo di rilevamento biotinylato, cioè l'anticorpo con etichetta biotina allevato contro la specie di ospite di proteine, a 4 g/mL nel tampone di analisi/lavaggio. Aggiungere 50 l dell'anticorpo di rilevamento diluito ad ogni pozzo. Coprire la piastra e incubare per 30 min a RT sullo shaker piastra a 800 rpm. Posizionare la piastra sul magnete e ripetere i passaggi 2.1.6 e 2.1.7.
   9. Dilute phycoerythrin (PE)-coniugato streptavidin (SAPE) a 4 g/mL in assaggio/lavaggio tampone. Aggiungete a ogni pozzo 50 l di SAPE diluita. Coprire la piastra e incubare per 30 min a RT sullo shaker piastra a 800 rpm. Posizionare la piastra sul magnete e ripetere i passaggi 2.1.6 e 2.1.7.
   10. Rimuovere la piastra dal magnete e risospendere le perline in 100 -L di aspetto/lavaggio tampone. Leggere i pozzi con un doppio strumento di rilevamento basato sul flusso laser che consente di rilevare la magnitudine dell'intensità della fluorescenza PE (FI).
       NOTA: Il segnale, ad esempio FI, generato è proporzionale alla quantità di antigene bersaglio attaccato alla superficie delle perline.
   11. Esportare dati grezzi e creare curve standard grafico segnale di rilevamento FI rispetto alle concentrazioni proteiche standard. Utilizzare le curve standard per calcolare la concentrazione degli analiti nei campioni.
       NOTA: L'albume è espresso preferibilmente in g/dL, mentre le proteine di interesse sono espresse preferibilmente in mg/dL.

3. Calcoli dell'indice intratecale

1. Organizzare i valori di concentrazione delle proteine in un foglio di calcolo e analizzare i risultati applicando le seguenti formule.
2. Calcola_albuminaQ :
   
   dove_albumin CSF e_albumin serum sono concentrazioni di albumina in siero abbinato e campioni CSF, rispettivamente.
3. Calcolare la_proteinaQ :
   
   dove la_proteina CSF e la_proteina del siero sono concentrazioni di proteine bersaglio (s) nei campioni di siero e CSF corrispondenti, rispettivamente.
4. Calcolare l'indice proteico:
   

Risultati

Questo esperimento rappresentativo mirava a confrontare la sintesi intratecala di IgG in due modelli di roditori clinicamente rilevanti della sclerosi multipla (MS): il PLP_139-151-indotta recissa sperimentale di encefalomiesi (R-EAE) e la progressiva cronica, La malattia demielinante indotta dal virus dell'encefalomielisi del Telemanolio (TMEV-IDD). R-EAE è un modello utile per comprendere la recidiva delle MS, mentre il modello TMEV-IDD è dotato di MS¹⁹progressivo cronico.

Discussione

I metodi quantitativi per la valutazione delle maggiori concentrazioni di proteine CSF sono strumenti utili per la caratterizzazione dello stato fisiologico e patologico del SNC. Tuttavia, al di là della quantificazione affidabile dei livelli di proteine CSF, il rilevamento delle proteine CSF richiede un'espressione dei risultati che discriminano tra le frazioni derivate dal sangue e il SNC nel CSF. Tuttavia, ad oggi, i saggi di quantificazione delle proteine comunemente utilizzati non consentono la discriminazione tra ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL insulin syringe	BD	329650
1 mL syringe	BD	329622
25 gauge needle	BD	305122
3 mL syringe	BD	309582
30 gauge insulin needle	BD	305106
Absorbent pads	Any suitable brand
Acepromazine	Patterson Vet Supply Inc
BioPlex Handheld Magnetic Washer	BioRad	171020100	Magnet
BioPlex MAGPIX Multiplex Reader	BioRad	171015001
BioPlex Pro Flat Bottom Plates	BioRad	171025001
Biotinilated detection antibody	Any suitable source		The antibody has to be directed against the species of the protein of interest.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A4503
Buprenorphine hydrochloride	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
Capillary Tubes	Sutter Instrument	B100-75-10	OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller.
Centrifuge tube, 0.2 mL	VWR	20170-012
Centrifuge tube, 0.5 mL	VWR	87003-290
Centrifuge tube, 1.5 mL	VWR	87003-294
Chlorhexidine diacetate	Nolvasan	E004272
Disposable pipettes tips	Any suitable brand
Ear bars	KOPF Instruments	1921 or 1922
Ethanol	Kopter	V1001
Freezer	VWR	VWR32086A
Gauze	Medline	NON25212
Heating pad	Sunbeam		XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch
Induction Chamber	VETEQUIP
Isoflurane	Patterson Vet Supply Inc	NDC 14043-704-06
Ketamine (KetaVed)	Patterson Vet Supply Inc
MagPlex Microspheres (antibody-coupled)	BioRad		Antibody-coupled magnetic bead
Microplate Shaker	Southwest Scientific	SBT1500
Microretractors	Carfill Quality	ACD-010	Blunt - 1 mm
Microsoft Office (Excel)	Microsoft
MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel	EMD Millipore	MGAMMAG-300K	Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids.
Mouse Albumin capture ELISA kit	Novus Biological	NBP2-60484	Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids.
Multichannel pipette	Eppendorf	3125000060
Non-Sterile swabs	MediChoice	WOD1002	Need to be autoclaved for sterility
Oxygen	AIRGAS	OX USPEA
Pasteur Pippettes	Fisher	13-678-20A	5 & 3/4"
PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen	Patterson Vet	8695G	P-3 Reverse Cutting, 18"
PE-Streptavidin	BD Biosciences	554061
Pipetters	Eppendorf	Research seriers
Polyethylene tubing
Refrigerated Centrifuge	Beckman Coulter	ALLEGRA X-12R
Scale	Uline	H2716
Scalpel	Feather	EF7281
Shaver	Harvard Apparatus	52-5204
Standard proteins	Any suitable source		The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest.
Stereotaxic instrument	KOPF Instruments	Model 900LS	Standard Accessories
Sterile 1 x PBS	Corning Cellgro	21-040-CV
Sterile saline	Baxter	0338-0048-02	0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP
Surgical Forceps Curved, 7 (2)	Fine Science Tools	11271-30	Dumont
Surgical Scissors	Fine Science Tools	14094-11	Stainless 25x
Vaporizer + Flow meter	Moduflex Anhestesia Instruments
Vortex	Fisher	02-215-414
Warming pad	Kent Scientific Corporation	RT-JR-20
Water Sonicator	Cole Parmer	EW-08895-01
Xylazine	Patterson Vet Supply Inc