החלת הדמיית תאים בשידור חי וטומוגרפיה ממוחשבת כדי לפתור את התכונות הספאטימיות של הלגיונרים האלה מערכת הפרשות

Summary

הדמיה של תאים חיידקיים היא גישה ביולוגיה מערכות מתפתחים התמקדו הגדרת תהליכים סטטיים ודינאמיים המכתיבים את הפונקציה של מכונות macromolecular גדולות. כאן, שילוב של הדמיה תא כמותי לחיות וטומוגרפיה מסוג ההקפאה משמשת לחקר הלגיונרים האלה הפרשת מערכת הפרשה ופונקציות.

Abstract

נקודה/Icm הפרשת מערכת של הלגיונרים משאבה האלה היא סוג מורכב IV הפרשה מערכת (T4SS) nanomachine כי לאתר את הקוטב החיידקי ו סכסוכי את המסירה של חלבונים ו-DNA מצעים כדי למקד את התאים, תהליך בדרך כלל דורש קשר ישיר תא אל התא. לאחרונה פתרנו את המבנה של מנגנון נקודה/Icm על ידי טומוגרפיה ההקפאה-אלקטרון (ההקפאה) והראו כי הוא יוצר מעטפת תא מפורש ערוץ המתחבר למתחם cytoplasmic. החלת שתי גישות משלימות לשימור המבנה היליד של הדגימה, מיקרוסקופ פלורסנט בתאי החיים וההקפאה, מאפשר ויזואליזציה באתרו של חלבונים והטמעה של הסטואיצ'ימטריה והעיתוי של ייצור של כל רכיב מחשב ביחס ליחידות אחרות של נקודה/Icm. כדי לחקור את הדרישות עבור מיצוב קוטבי ולאפיין תכונות דינמיות המשויכות T4SS מחשב biogenesis, יש לנו התמזגו הקידוד הגן הירוק של התיקייה הפלואורסצנט חלבון פלורסנט נקודה/Icm ATPase במיקומים מקוריים שלהם על הכרומוזום. השיטה הבאה משלבת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית כמותי של תאים חיים והקפאה-ET כדי לכמת לוקליזציה קוטבית, דינמיקה, ומבנה של חלבונים אלה בתאים חיידקיים שלמים. החלת גישות אלה עבור לימוד הלגיונרים האלה משאבה T4SS היא שימושית לאפיון הפונקציה של מערכת נקודה/Icm והוא יכול להיות מותאם ללמוד מגוון רחב של פתוגנים חיידקיים המשתמשים T4SS או סוגים אחרים של מכלולי הפרשה חיידקיים.

Introduction

הלגיונרים האלה משאבה (L. משאבה), הסוכן הפרוטולוגי של מחלת הלגיונרים, שוכן מאגרי מים מתוקים, שם החיידקים מופצים על ידי הדבקה ושכפול בתוך מימיים שחיה בחינם פרוטותים. ל. משאבה הגורמת להתפרצויות של מחלות בבני אדם כאשר האינהלציה של חיידקים aerosolized ממקורות מים ראויים לשתייה מתרחשת. בתאים נגועים, החתרנות של מסלולים מארחים מאפשר L. משאבה המרחפת כדי לעכב התבגרות endocytic של החללים שבהם הוא שוכן לקדם biogenesis של תא התא התומך שכפול חיידקי. תהליך זה מונע על ידי סוג חיידקי מיוחדות ivb הפרשה (T4BSS) המכונה נקודה/Icm והרפרטואר שלה של מעל 300 "אפקטור" חלבונים כי הם translocated לתוך מארח ציטוסול במהלך הזיהום כדי להקל על מניפולציה של פונקציות סלולריות^1,2,3,4,5. מוטציות חסרות נקודה תפקודית/Icm מנגנון להיכשל לספק את העריקים לתוך המחשב המארח ציטוסול, פגומים עבור שכפול תאיים, והם avirulent במודלים של בעלי חיים של מחלה^6,7.

זנים חיידקיים רבים פיתחו מכונות רב רכיבי מורכבות ודינמיות מאוד הנדרשות לתהליכי זיהום. אחרים T4BSS כמו מערכת נקודה/Icm חיוניים גם עבור שכפול תאיים של פתוגנים חיידקיים כגון Coxiella בורנתיבי ו ריקטסיאלה grylli. למרות T4BSS הקשורים באבולוצאוסיים מערכות מסוג מערכת ה-DNA, אשר מתווכים העברת דנ א והוא יכול לספק רפרטואר מוגבל של חלבונים אפקטור, מערכת נקודה/Icm יש כמעט פי שניים מרכיבי מחשב ומספק מגוון רחב של מכונות. ככל הנראה, התרחבות זו במספר הרכיבים אפשרה למנגנון הנקודה/Icm להכיל ולשלב בקלות מחדש את האפשרות^8,9.

השתמשנו לאחרונה טומוגרפיה אלקטרון-אלקטרונים (ההקפאה) כדי לפתור את המבנה של מנגנון נקודה/Icm באתרו והראה כי זה יוצר תא מעטפה מפורש ערוץ המתחבר למתחם cytoplasmic. ניתוח נוסף עולה כי ציטוסולוג ATPase DotB מקורביו עם מערכת נקודה/Icm בקוטב התא L. משאבה מנועי באמצעות אינטראקציות עם מיקוד. גילינו כי DotB מציג את התנועה ציטוסולג בתאי חיידקי ביותר, המציין כי ATPase זה קיים באוכלוסייה cytosolic דינאמי אך גם מקורביו עם נקודה קוטבית/מתחמי Icm. בנוסף, הקבוצה מהווה הרכבה של הקסאמרס הקשורה למכלול הממברנה הפנימי, והיא מצטרפת לבסיס של מתחם cytoplasmic זה. ההרכבה של מורכבות DotB-לעשות אנרגיה יוצר ערוץ cytoplasmic המנחה את הטרנסלוקציה של מצעים דרך T4SS (איור 1)¹⁰.

למרות ההתקדמות האחרונה, מעט ידוע על איך מערכת נקודה/Icm פונקציות ואיך כל חלבון מרכיב ליצור מנגנון פעיל⁸. חשיפת המעגלים הרגולטורים של הנקודה/Icm T4SS היא בסיסית כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של אינטראקציות מארח הפתוגן. לכן, אנו דנים כיצד להשתמש במיקרוסקופיה תא לחיות והקפאה-ET כדי לזהות ולאפיין את הרכיבים החיוניים L. משאבה האנטי/Icm המערכת מתויגים עם סופר תיקיית gfp (sfgfp). באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית כמותי, לוקליזציה קוטבי של DotB יוגדר ברקע סוג פראי או כאשר מערכת הרביעי סוג מחיקת. מיקרוסקופ הזמן לשגות ישמש לכמת הבדלים בלוקליזציה ודינמיקה בין הנקודה/Icm ציטוסולטים ATPases.

היישום המשולב של שתי גישות משלימות כגון הדמיה חיה ו-ההקפאה מספק יתרון לעומת אחרים במערכות מבחנה. שתי השיטות מבוצעות בתאים שלמים ושומרות על הסביבה הטבעית של T4BSS, ובכך מזעור השיבוש של המבנה היליד במהלך הכנת המדגם. כי יתר הביטוי של חלבונים עלול לפגוע הסטואיצ'ימטריה של מכשיר הפרשת, sfGFP fusions מוחזרים באמצעות allelic exchange לתוך כרומוזום הלגיונרים , כך שכל היתוך מקודד בעותק אחד והביטוי מונע על ידי מקדם אנדוגני. הדמיה של fusions מקודד כרומוסומלית מאפשרת לכמת את רמת החלבון המדויקת המתבטאת בנקודת זמן מוגדרת. ל-"הקפאה" יש גם יתרונות רבים לקביעת מבנה מערכות הפרשה. היתרון הבולט ביותר הוא שדגימות ההקפאה מורכבות מתאי שלמים קפואים הישמרו על מתחמי מקומיים בהקשר של ארכיטקטורת תאים חיידקיים. כתוצאה מכך, ההקפאה עשויה להיות עדיפה על גישות הטיהור הביוכימי, אשר לחלץ מתחמי ממברנה עשוי להתפשט חלבונים היקפיים ממנגנון הליבה או לשנות את המבנה הכללי. בנוסף, תיוג חלבון של עניין עם חלבון מגושם כגון sfGFP מוסיף מסה שניתן לגילוי על-ידי ההקפאה והוא יכול לסייע עם מיפוי subcomplexes שונים של המנגנון נקודה/Icm על המבנה המתקבל על ידי המקפיא-ET.

גישה זו היא כלי רב עוצמה לגילוי מידע מבני על מתחמים רב מולקולריים להרכיב קרום התא חיידקי. הפרשנות של מבנים הובהר באמצעות טכניקות אלה תסייע לשדה להבין כיצד T4BSS רכיבי הפונקציה, מדוע רכיבים רבים כל כך נדרשים לפונקציה, איך הרכיבים אינטראקציה בתוך המתחם הגדול, ומה פונקציות אלה בצע הרכבות משנה.

Protocol

הערה: יש לבצע את כל ההליכים הכרוכים בצמיחה, מניפולציה והדמיה של L. משאבה ברמת בטיחות ביולוגית 2 בהתאם להנחיות המקומיות.

1. החדרת התכנה לתוך כרומוזום L. משאבה באמצעות Allelic Exchange ואסטרטגיית בחירה כפולה (איור 2, איור 3)

1. שיבוט לתוך החלפת גנים וקטור pSR47S¹¹ את הרצף הבא: 1,000 bp במעלה הזרם של העניין, ואז את הרצף sfGFP, ואז 1,000 bp במורד האתר של העניין (איור 2). יש למקם את הרצף sfGFP במסגרת לסוף N-טרמינוס או C-טרמינוס עם מקשר המכיל ארבע עד שמונה חומצות אמינו. הפוך את הווקטור המתקבל לתוך E. coli DH5αλpir. מאוחר יותר, פס ל. משאבה (המטופל) עבור מושבות יחיד על תמצית שמרים פחם (cye) אגר¹² המכיל 100 μg/mL סטרפטומיצין ולגדול 5 ימים ב 37 ° צ' (איור 3).
2. פס ל. משאבה ב-cye-אגר-סטרפטומיצין וגדלים במשך יומיים ב 37 ° צ' (טלאי כבד)¹⁰. רצף E. coli DH5α השתנה עם pRK600 עוזר פלמיד (עוזר)¹³ על ליברות אגר המכיל 25 μg/mL כלוראמנול. רצף את E. coli DH5αλpir (תורם) על LB אגר המכיל 50 μg/mL kanamycin.
3. לבצע הזדווגות הורים: המאכטה מושבה של העוזר, מושבה של התורם, ואת הנמען על ידי הנחת טלאים של שלושה זנים על צלחת באגר CYE ללא בחירה ו הדגירה עבור 4 – 8 h ב 37 ° c. כאשר שולט שלילי משלב המסייע + מערבב זנים של הנמען והתורם + זן הנמען ערבוב עבור אותם פרקי זמן.
4. להשעות את תגובות ההזדווגות ב 500 μL של ddH₂O. צלחת 20 μl ו 50 μl של התגובות על cye אגר המכיל 100 μg/ml סטרפטומיצין ו 10 Μg/ml kanamycin ולגדול 5 ימים ב 37 ° c. פס ארבע של המשובטים שהתקבל על CYE אגר המכיל 100 μg/mL סטרפטומיצין ולגדול 5 ימים ב 37 ° c.
5. פס 16 שיבוטים על CYE אגר המכיל 5% סוכרוז ו-100 μg/mL סטרפטומיצין וגדלים במשך 5 ימים ב 37 ° c. אז, פס 32 של שיבוטים אלה על CYE אגר המכיל 100 μg/mL סטרפטומיצין ועל CYE אגר המכיל 100 μg/mL סטרפטומיצין ו 10 μg/mL kanamycin ולצמוח 5 ימים ב 37 ° c.

2. בידוד של המשובטים כי משולב הספגfp לתוך כרומוזום L. משאבה

1. פס שיבוטים שהיו רגישים לקאנאמיצין על CYE-אגר-סטרפטומיצין צלחות ולאשר את החדרת sfGFP לתוך הכרומוזום עם ה-PCR המושבה. השתמש בצבעי היסוד המשלימים את הגן sfGFP ולאזור הכרומוזום של הריבית כדי להגביר את צומת הכניסה.
   1. מערבבים 0.5 μL של כל אחד 10 הפתרונות התחל באמצעות μM ומושבה אחת לכרך הסופי של 12.5 μL ו-1 הספרות עבור 10 דקות ב 95 ° c. קריר על קרח 10 דקות, להוסיף 12.5 μL של פתרון מאסטר 2x PCR, ולבצע ניתוח PCR.
2. הגדל כתמים כבדים של מושבות מבודדות על CYE-אגר-סטרפטומיצין צלחות עבור 2 ימים ב 37 ° c. בדוק את רמות הביטוי והיציבות של הfusions-sfGFP באמצעות נוגדן אנטי-GFP.

3. הדמיה של תא חי של L. משאבה עם שתייגת פלואורוסקופים נקודה/Icm רכיבים

1. הכנת רפידות צמח
   1. הפוך כ-30 מ ל של 1% להמיס מצומצם של פתרון במים. מיקרוגל בבקבוקון זכוכית עבור כ 90 s, מתערבל מדי פעם, עד הצמח הוא התפרקה לחלוטין.
   2. מקום 2 22 x 22 x 0.15 mm³ שקופיות זכוכית על קצה של 25 x 75 x 1.1 mm³ זכוכית שקופית, אחד על גבי השני. מחסנית 2 יותר 22 x 22 x 0.15 מ"מ³ שקופיות זכוכית על הקצה השני.
   3. פיפטה בערך 1 מ ל של agarose מותכת לתוך השקופית המרכז בין שתי שקופיות הזכוכית העליונה, ואז מניחים עוד 25 x 75 x 1.1 מ"מ³ השקופית על גבי agarose מותכת. נסה להימנע היווצרות בועות אוויר. לצנן את השקופיות ב 4 ° c עבור 15 דקות.
   4. באמצעות אזמל או סכין גילוח, בעדינות לחתוך את הלוח לריבועים קטנים, ~ 5 x 5 מ"מ². לתקן דבק דו צדדי 17 x 28 x 0.25 מ"מ³ מסגרת על 25 x 75 x 1.1 mm³ שקופית זכוכית ומניחים מספר רפידות בשקופית.
2. רכישת תמונה
   הערה: השלבים הבאים מתוארים עבור מיקרוסקופ כי הוא תחת השליטה של SlideBook 6.0 ומצויד המוארים המדינה מוצק, CCD מצלמה חד-צבעית, ועדשת היעד 100x (1.4 מפתח נומרי). במידת הצורך, השתמש בהתקני מיקרוסקופ חלופיים עם תצורות חומרה ותוכנה מתאימות שניתן להתאים אישית בהתאם להגדרות הפרוטוקול.
   1. התמוססות טלאי כבד של L. משאבה בתוך 1 מ ל של ddh₂O, מערבולת ו pipet 2 – 3 μl של הדילול על הרפידות. מקום 50 x 24 x 0.15 מ"מ³ שמיכות בעדינות מעל מסגרת דבק.
   2. בחלון הלכידה התאימו את ה-ND ל-180. להתאים את binning ל 2 × 2 ולהשתמש בערוץ 488 ננומטר לחשוף את המדגם בין 500-1000 ms. לאמת את הספציפיות של האות הפלואורסצנטית על ידי הדמיה לא מתויגים L. משאבה עם אותם הפרמטרים (איור 4).

4. קוונפיקציה של לוקליזציה קוטבית דינמיקה של רכיבי נקודה/Icm

הערה: השלבים הבאים מיועדים לתמונות עם 0.129 יקרומטר לכל פיקסל שנרכשו עם 2 x 2 binning.

1. קוונפיקציה של קוטביות עבור התקני היתוך (איור 5)
   1. התאימו את הניגודיות של התמונה כך שהחיידקים יהיו גלויים בבירור. השתמש בכלי אזור למקום 0.25 x 1.3 יקרומטר² מלבן החל בקוטב והארכת לתוך הציטופלסמה. המלבן חייב להישאר בדיוק בתוך הגבולות החיידקיים.
   2. סמן לפחות 200 חיידקים והשתמש באזור ללחצן מסיכה כדי ליצור מסיכות לאזורי העניין. תחת מסיכת סטטיסטיקה וטווח מסיכות, בחר באפשרות אובייקט. לאחר מכן, תחת תכונות ועוצמה, סמן ממוצע עוצמה וסטיה.
   3. יצא את הנתונים וחשב את תוצאות הקוטביות של כל חיידק כיחס בין השונות לעוצמה הממוצע.
   4. עבור יישומים בעלי תפוקה גבוהה, יש להשתמש במטרת שלב ובכיוונון העבה המתאים לרכישת תמונות עם הפאזה וערוצים 488 ננומטר. הקפד לבחור שדות תצוגה היכן החיידקים מופרדים לחלוטין.
   5. כוונן את הניגודיות של ערוץ הפאזה של התמונה לרמה שבה החיידקים גלויים בבירור. פתחו את תמונת הערוץ הכפול, הפעל את החלון ' צור מסיכת מקטע ' ושנה את הערוץ לשלב.
   6. התאימו את הסף המתאים והסירו עצמים קטנים בעזרת הלחצן ' הגדר עצמים '. תחת ' מקד מסיכה ' בחרו ' הסר אובייקטי קצוות ' ומסכות נפרדות של חיידקים הסמוכים זה לזה.
   7. חשב את ציוני הקוטביות של האות בערוץ 488 עבור כל תא כפי שתואר בעבר בשלבים 4.1.2 – 4.1.3.
2. הכמת של דינמיקה עבור התקני היתוך חלבונים (איור 6)
   הערה: בצע את ההוראות בסעיף 3 כדי להכין מדגם עבור רכישת תמונה. דינמיקות מוגדרות כשינויים באינטנסיביות לאורך זמן והשלבים הבאים מיועדים לתקופות דימות קצרות (כלומר, מספר דקות). הוסף למשטח את תוספי התזונה המתאימים אם יש צורך בתקופות דימות ארוכות יותר.
   1. בחלון לכידת תמונה , סמן אתהזמן הקצוב בתיבה מרווח והזן 2 ב-תיבת נקודות הזמן . להשיג שתי תמונות רצופות של L. משאבה ה, ביטוי חלבון פלורסנט של הריבית.
   2. כוונן את הניגודיות של התמונה עד שהתאים גלויים בבירור. בצע את איור 6A ואת התיאורים הבאים כדי למקם שלושמסיכות שונות. השתמש בכלי האזור כדי למקם 0.25 x 0.25 יקרומטר כיכר באמצע לפחות 400 תאים.
   3. השתמש בלחצן אזור למסיכה כדי ליצור מסיכה (מסיכה 1) של ריבועי הריבית. צרו מסכה ריקה חדשה (מסכה 2) והשתמשו בכלי הפיקסל או בכלי המצולע כדי לסמן את כל שטח התא של לפחות 25 תאים אקראיים, אשר ישמשו לחישוב הלבנת זריחה. צרו מסיכה ריקה חדשה (מסיכה 3) והשתמשו בכלי המברשת הגדול כדי לסמן אזורים בין התאים, שישמשו לחיסור רקע.
   4. תחת מסיכת סטטיסטיקה וטווח מסיכות, בחר אובייקט עבור מסיכה 1 ומסיכה 2. לאחר מכן, תחת תכונות ועוצמה, בחר עוצמה ממוצע ולייצא את הנתונים של שתי המסיכות. למסיכה 3, יצא את העוצמה הממוצע של המסיכה כולה.
   5. חישוב השינוי בעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית עבור כל אובייקט במסיכה 1 באמצעות הנוסחאות הבאות:

כאשר מסכה 1 הוא 0.25 יקרומטר × 0.25 יקרומטר ריבוע ממוקם במרכז התא, מסכה 2 מכסה את התא כולו, מסכה 3 הוא הרקע בין תאים, t1 הוא העוצמה הממוצע בנקודת הזמן הראשונה, ו t2 הוא העוצמה הממוצע בנקודת הזמן השנייה.

5. זיהוי דחיסות המסה של sfGFP עם ההקפאה

1. הכנה לדוגמה, איסוף נתונים ושחזור
   1. לגדל טלאי כבד של L. משאבה האמההילה ביטוי פלואור מתויג נקודה/Icm חלבון על cye-אגר-סטרפטומיצין צלחות עבור 48 שעות ב 37 ° c. השהה מחדש את התאים ב-ddH₂O כדי OD₆₀₀ ~ 0.7. הוסף 5 μL של חלקיקי זהב (BSA מעקב, 10 ננומטר) עד 20 μL של השעיית התא.
   2. פיפטה 5 μl של התערובת של התא אל רשת הזוהר הטרייה משוחררת holey פחמן (R 2/1 על Cu 200 רשת שינוי) ולתת לעמוד 1 דקות למחוק עם נייר סינון להקפיא את אתאן נוזלי באמצעות מנגנון כבידה מונחה בבוכנה כמתואר בעבר^14,15.
   3. התמונה של היצורים קפואים עם מיקרוסקופ הילוכים 300 kV מצויד באקדח פליטת שדה, מסנן אנרגיה, צלחת שלב וולטה, ומכשיר זיהוי ישיר. לאסוף סדרת הטיה חד הציר ב 26, 000x ו-42, 000x המאגרים, אשר התוצאה בגדלים פיקסל ברמת הדגימה של 5.4 Å/פיקסל או 3.4 Å/פיקסל, בהתאמה.
   4. השתמש בחבילת טומוגרפית כדי לאסוף ערימות תמונה ב ~ 0 יקרומטר defocus, עם מגוון של זוויות הטיה בין-60 ° + 60 ° עם התוספת צעד 3 ° ומינון המצטבר של ~ 60 e^-/Å^2,16. יישר את תמונות הסרט משבר המינון בכל מחסנית באמצעות MotionCor2¹⁷. להרכיב ערימות להיסחף מתוקן באמצעות TOMOAUTO¹⁴.
   5. יישר ערימות שתוקנו על-ידי הסחף על-ידי יישור התלוי בסמן IMOD¹⁸. לשחזר tomograms עם שיטה SIRT¹⁹ עבור segmentations וניתוח תמונה ישירה ואת שיטת wbp²⁰.
2. Subtomogram ניתוח של הספגfp fusions דגימות
   1. השתמש בחבילת הטוקסוגרפיות (0.9.9.3) לניתוח subtomogram^14,21,22.
      הערה: היישור מתקדם בצורה המיטבית, כאשר כל איטראציה מורכבת משלושה חלקים בהם נוצרות הפניות ומסיכות סיווג, subtomograms מיושרות ומסווגים, וממוצעים של מחלקה מיושרים זה לזה.
   2. השתמש ב-4 x 4 x 4 שכבות subtomograms עבור יישור ראשוני. מיזוג חלקיקים השייכים לממוצעים מחלקה ומציגים צפיפות אלקטרונים המתאימה ל-sfGFP. לאחר מיון חלקיקים עם sfGFP fusions, להשתמש 2 x 2 x 2 בנימין subtomograms עבור יישור ממוקד של אזור של עניין (כמו נקודה/Icm cytoplasmic ATPase מורכב) כדי להשיג מבנה ברזולוציה גבוהה.

תוצאות

שילוב מחדש של הומוולוגי עם מבחר כפול בשני שלבים שימש לבניית ההכנסה המוגדרת של sfGFP. , בצעד הראשון ההזדווגות triparental ורית בוצעה, שם pRK600 מצונת החומר הנפץ של החיידק הקולי של e. COLI MT616 היה מגוייס החיידק e. coli מאמץ עם וקטור ההתאבדות pSR47S המכיל את הגן sfgfp מוקף על ידי שני אזורים הומולוגיים, מקור ?...

Discussion

להבהיר את הפונקציות של מערכות הפרשה חיידקית הוא המפתח להבנה מלאה של אינטראקציות מארח הפתוגן. מערכות הפרשה הן מכונות מורכבות שיכולות להזריק חלבונים לתוך תאי מחשב מארחים, ובמקרים מסוימים מקדמים את הקמתה של נישה תת-תאית התומכת בשכפול חיידקי. השיטה הנ ל מספקת כלים חדשים חשובים ללימוד נקודה/Icm...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 nm colloidal gold particles	Aurion	25486
100x Plan Apo objective (1.4 NA)	Nikon
ACES	Sigma-Aldrich	A9758
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	C5510
Agaroze GPG/LMP, low melt	American bioanalytical	AB00981
Bacto dehydrated agar	BD	214010
CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera	Photometrics
Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 µL	Fisher Scientific	AB-0578
Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh	Quantifoil	Q225-CR1
Iron(III) nitrate nonahydrate	Sigma-Aldrich	216828
K2 Summit camera for cryo-EM	GATAN
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352
Microscope cover slides 22x22 mm	Fisher Scientific	12-542B
Microscope cover slides 24x50 mm	Fisher Scientific	12-545K
Microscope slides 25x75x1 mm	Globe Scientific	1380
SlideBook 6.0	Intelligent Imaging Innovations
Spectra X light engine	Lumencor
Taq 2X Master Mix	New England BioLabs	M0270
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific
Yeast Extract	BD	212750