Aplicando imagens de células vivas e tomografia crio-elétron para resolver características espaciales do Sistema de Secreção Legionella pneumophila Dot/ICM

Resumo

A imagem de células bacterianas é uma abordagem de biologia de sistemas emergentes focada na definição de processos estáticos e dinâmicos que ditam a função de grandes máquinas macromoleculares. Aqui, a integração da imagem quantitativa de células vivas e tomografia crio-elétron é usada para estudar a arquitetura e funções do sistema de secreção legionella tipo IV.

Resumo

O sistema de secreção Dot/ICM da pneumophila Legionella é uma nanomáquina complexa do sistema de secreção tipo IV (T4SS) que localiza no pólo bacteriano e media a entrega de substratos de proteína e DNA às células-alvo, um processo que geralmente requer contato direto entre células. Recentemente, resolvemos a estrutura do aparelho Dot/Icm por tomografia crio-elétron (crio-ET) e mostramos que ele forma um canal de abrangência de envelopes de células que se conecta a um complexo citoplasmático. A aplicação de duas abordagens complementares que preservam a estrutura nativa do espécime, a microscopia fluorescente em células vivas e crio-ET, permite a visualização in situ de proteínas e assimilação da estequiometria e tempo de produção de cada componente da máquina em relação a outras subunidades do Ponto/Icm. Para investigar os requisitos para o posicionamento polar e para caracterizar características dinâmicas associadas à biogênese da máquina T4SS, fundimos uma proteína fluorescente verde de codificação de genes de superpasta para genes Dot/Icm ATPase em suas posições nativas no cromossomo. O método a seguir integra a microscopia quantitativa de fluorescência de células vivas e crio-ET para quantificar a localização polar, a dinâmica e a estrutura dessas proteínas em células bacterianas intactas. A aplicação dessas abordagens para o estudo da Legionella pneumophila T4SS é útil para caracterizar a função do sistema Dot/Icm e pode ser adaptada para estudar uma grande variedade de patógenos bacterianos que utilizam o T4SS ou outros tipos de complexos de secreção bacteriana.

Introdução

Legionella pneumophila (L. pneumophila), o agente etiológico da doença dos Legionários, habita reservatórios de água doce, onde as bactérias se propagam infectando e replicando dentro de protozoários aquáticos de natação livre. L. pneumophila causa surtos de doenças em humanos quando ocorre inalação de bactérias aerossolizadas de fontes de água potável. Nas células infectadas, a subversão das vias hospedeiras permite que a L. pneumophila atrase a maturação endocítica do vacúolo em que reside e promova a biogênese de um compartimento celular que suporta a replicação bacteriana. Este processo é conduzido por um sistema especializado de secreção de tipo bacteriano IVB (T4BSS) conhecido como Ponto/Icm e seu repertório de mais de 300 proteínas "eficazes" que são translocadas no citosol hospedeiro durante a infecção para facilitar a manipulação das funções celulares^1,2,3,4,5. Mutantes sem um aparelho funcional Dot/Icm não conseguem entregar os efeitos no citosol hospedeiro, são defeituosos para replicação intracelular e são aviudores em modelos animais da doença^6,7.

Muitas espécies bacterianas desenvolveram máquinas multicomponentes extremamente complexas e dinâmicas que são necessárias para processos de infecção. Outros T4BSS como o sistema Dot/Icm também são essenciais para a replicação intracelular de patógenos bacterianos como Coxiella burnetii e Rickettsiella grylli. Embora o T4BSS esteja evolutivamente relacionado aos sistemas iva do tipo prototípico, que mediam a transferência de DNA e podem fornecer um repertório limitado de proteínas eficazes, o sistema Dot/Icm tem quase o dobro de componentes da máquina e fornece uma grande variedade de efeitos. Presumivelmente, essa expansão no número de componentes permitiu que o aparelho Dot/Icm acomodasse e integrasse facilmente novos efeitos^8,9.

Recentemente usamos a tomografia crio-elétron (crio-ET) para resolver a estrutura do aparelho Dot/Icm in situ e mostramos que ele forma um canal de abrangência de envelopes de células que se conecta a um complexo citoplasmático. Análises posteriores revelaram que o citosolicatat ATPase DotB associa-se ao sistema Dot/Icm no pólo celular L. pneumophila através de interações com o citosolicatATPase DotO. Descobrimos que o DotB apresenta um movimento citosólico na maioria das células bacterianas, indicando que este ATPase está presente em uma população citossólica dinâmica, mas também se associa aos complexos polares do Dot/Icm. Além disso, DotO forma uma montagem hexamérica de dimers DotO associados com o complexo de membrana interna, e um Hexamer DotB se junta à base deste complexo citoplasmático. A montagem do complexo energético DotB-DotO cria um canal citoplasmático que direciona a translocação de substratos através do T4SS (Figura 1)¹⁰.

Apesar desses avanços recentes, pouco se sabe sobre como funciona o sistema Ponto/Icm e como cada proteína se reúne para formar um aparelho ativo⁸. Descobrir os circuitos regulatórios do Ponto/Icm T4SS é fundamental para compreender os mecanismos moleculares das interações hospedeira-patógena. Portanto, discutimos como usar a microscopia de células vivas e crio-ET para detectar e caracterizar componentes essenciais do sistema L. pneumophila Dot/Icm que são marcados com a super pasta GFP (sfGFP). Utilizando microscopia quantitativa de fluorescência, a localização polar do DotB será definida em um tipo de fundo selvagem ou quando o sistema tipo IV for excluído. A microscopia de lapso de tempo será usada para quantificar diferenças na localização e dinâmica entre os ATPas citosolic do TT/ICM.

A aplicação combinada de duas abordagens complementares, como imagem ao vivo e crio-ET, proporciona uma vantagem em comparação com outros sistemas in vitro. Ambos os métodos são realizados em células intactas e preservam o ambiente natural do T4BSS, minimizando assim a interrupção da estrutura nativa durante a preparação da amostra. Como a superexpressão das proteínas pode prejudicar a estequiometria do aparelho de secreção, as fusões sfGFP são devolvidas através da troca alélica ao cromossomo Legionella para que cada fusão seja codificada em cópia única e a expressão seja conduzida pelo promotor endógeno. A visualização de fusões codificadas cromossomicamente permite quantificação do nível exato de proteína sendo expressa em um ponto de tempo definido. O Cryo-ET também tem muitas vantagens para determinar a estrutura dos sistemas de secreção. A vantagem mais notável é que as amostras crio-ET são compostas de células intactas congeladas que preservam complexos nativos no contexto da arquitetura celular bacteriana. Consequentemente, o crio-ET pode ser preferível às abordagens de purificação bioquímica, que extraem complexos de membrana e podem retirar proteínas periféricas do aparelho central ou modificar a estrutura geral. Além disso, a marcação de uma proteína de interesse com uma proteína volumosa como o sfGFP adiciona uma massa que é detectável pelo crio-ET e pode auxiliar no mapeamento dos diferentes subcomplexos do aparelho Dot/Icm na estrutura obtida pelo crio-ET.

Esta abordagem é uma poderosa ferramenta para descobrir informações estruturais sobre complexos multimoleculares que se reúnem na membrana celular bacteriana. A interpretação das estruturas elucidadas usando essas técnicas ajudará o campo a entender como funcionam os componentes T4BSS, por que tantos componentes são necessários para a função, como os componentes interagem dentro do complexo maior e quais funções esses subconjuntos funcionam.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos envolvendo o crescimento, manipulação e imagem de L. pneumophila devem ser realizados em um laboratório de segurança biológica nível 2 em conformidade com as diretrizes locais.

1. Inserção de sfGFP no Cromossomo L. pneumophila utilizando a Estratégia de Troca Adélia e Dupla Seleção(Figura 2, Figura 3)

1. Clone no vetor de substituição genética pSR47S¹¹ a seguinte seqüência: a 1.000 bp upstream do local de interesse, depois a seqüência sfGFP, em seguida, a 1.000 bp downstream do site de interesse(Figura 2). A seqüência sfGFP deve ser colocada no quadro para as extremidades N-terminus ou C-terminus com um linker que contém quatro a oito aminoácidos. Transforme o vetor resultante em E. coli DH5αλpir. Posteriormente, estria L. pneumophila (o receptor) para colônias únicas no extrato de levedura de carvão (CYE) ágar¹² contendo 100 μg/mL de estreptomicina e crescer durante 5 dias a 37 °C(Figura 3).
2. Raia L. pneumofa em CYE-ágar-estreptomicina e crescer por 2 dias a 37 °C (patch pesado)¹⁰. Raia E. coli DH5α transformada com pRK600 assistente plasmid (ajudante)¹³ no ágar LB contendo 25 μg/mL de clorofenicol. Streak o E. coli DH5αλpir (doador) em ágar LB contendo 50 μg/mL de kanamicina.
3. Realizar o acasalamento triparental: incubar uma colônia do ajudante, uma colônia do doador e o receptor sobrepondo manchas das três cepas em uma placa de ágar CYE sem seleção e incubando por 4-8 h a 37 °C. À medida que os controles negativos incubam uma mistura de tensão helper+recipient e uma mistura de cepa doador+receptora pelos mesmos períodos de tempo.
4. Resuspender as reações de acasalamento em 500 μL de ddH₂O. Placa 20 μL e 50 μL das reações no ágar CYE contendo 100 μg/mL de estreptomicina e 10 μg/mL de kanamicina e crescer por 5 dias a 37 °C. Streak quatro dos clones resultantes no ágar CYE contendo 100 μg/mL de estreptomicina e crescem por 5 dias a 37 °C.
5. Estrias de 16 clones no ágar CYE contendo 5% de sacarose e 100 μg/mL de estreptomicina e cresçam por 5 dias a 37 °C. Em seguida, estria 32 desses clones no ágar CYE contendo 100 μg/mL de estreptomicina e em ágar CYE contendo 100 μg/mL de estreptomicina e 10 μg/mL de kanamicina e crescer por 5 dias a 37 °C.

2. Isolamento de Clones que Integraram sfGFP no Cromossomo L. pneumophila

1. Clones de raia que eram sensíveis à kanamicina em placas CYE-ágar-estreptomicina e confirmam a inserção de sfGFP no cromossomo com pcr colônia. Use primers complementares ao gene sfGFP e à região de interesse cromossômica para amplificar a junção de inserção.
   1. Misture 0,5 μL de cada uma das soluções de primers de 10 μM e uma colônia a um volume final de 12,5 μL e desnaturação por 10 min a 95 °C. Esfrie no gelo por 10 min, adicione 12,5 μL de solução master mix 2x PCR e realize uma análise PCR.
2. Cultivar manchas pesadas das colônias isoladas em placas CYE-ágar-estreptomicina por 2 dias a 37 °C. Examine os níveis de expressão e a estabilidade das fusões sfGFP por imunoblotting com um anticorpo anti-GFP.

3. Imagem celular viva de L. pneumofa com componentes de ponto/icm marcados fluorescentemente

1. Preparação de almofadas de agarose
   1. Faça cerca de 30 mL de uma solução de agarose de 1% de baixo derretimento na água. Microondas em um frasco de vidro por cerca de 90 s, girando ocasionalmente, até que a agarose seja completamente dissolvida.
   2. Coloque duas lâminas de vidro 22 x 22 x 22 x 0,15 mm³ na borda de um escorregador de vidro de 25 x 75 x 1,1 mm^3, um em cima do outro. Empilhe mais dois slides de vidro 22 x 22 x 22 x 0,15 mm³ na outra borda.
   3. Pipeta cerca de 1 mL da agarose derretida no deslizamento central entre as duas lâminas de vidro superiores, em seguida, coloque outro deslizamento de 25 x 75 x 1,1 mm³ em cima da agarose derretida. Tente evitar a formação de bolhas de ar. Esfrie os slides a 4 °C por 15 min.
   4. Usando um bisturi ou lâmina de barbear, corte suavemente a almofada em quadrados pequenos, ~5 x 5 mm². Fixar um adesivo de dupla lateral 17 x 28 x 0,25 mm³ quadro em um slide de vidro de 25 x 75 x 1,1 mm³ e coloque várias almofadas no slide.
2. Aquisição de imagens
   NOTA: As seguintes etapas são descritas para um microscópio que está o controle do SlideBook 6.0 e equipado com iluminadores de estado sólido, câmera monocromática CCD e uma lente objetiva de 100x (abertura numérica de 1,4). Se necessário, use dispositivos alternativos de microscopia com configurações adequadas de hardware e software que podem ser personalizadas de acordo com as configurações do protocolo.
   1. Dissolva um pedaço pesado de L. pneumophila em 1 mL de ddH₂O, vórtice e pipeta 2-3 μL da diluição nas almofadas. Coloque um deslizamento de cobertura de 50 x 24 x 0,15 mm³ suavemente sobre a estrutura do adesivo.
   2. Na janela de captura ajuste o ND para 180. Ajuste o binning para 2×2 e use o canal de 488 nm para expor a amostra entre 500-1.000 ms. Valide a especificidade do sinal de fluorescência por imagem não marcada L. pneumófilia com os mesmos parâmetros(Figura 4).

4. Quantificação da Localização Polar e Dinâmica dos Componentes Dot/Icm

NOTA: As seguintes etapas são projetadas para imagens com 0,129 μm por pixel que foram adquiridas com 2 x 2 binning.

1. Quantificação da polaridade para proteínas de fusão sfGFP (Figura 5)
   1. Ajuste o contraste da imagem para que as bactérias sejam claramente visíveis. Use a ferramenta de região para colocar um retângulo de 0,25 x 1,3 μm² começando no pólo e estendendo-se até o citoplasma. O retângulo deve permanecer precisamente dentro das fronteiras bacterianas.
   2. Marque pelo menos 200 bactérias e use o botão Região para Máscara para criar máscaras para as regiões de interesse. Em Estatísticas de máscara e escopo da máscara,escolha objeto. Em seguida, em Características e Intensidade, marque Intensidade média e variância.
   3. Exportar os dados e calcular os escores de polaridade de cada bactéria como a razão entre a variância à intensidade média.
   4. Para aplicações de alto throughput use um objetivo de fase e uma configuração de condensador apropriado para adquirir imagens com a fase e canais de 488 nm. Certifique-se de escolher campos de visão onde as bactérias estão totalmente separadas.
   5. Ajuste o contraste do canal de fase da imagem a um nível onde as bactérias são claramente visíveis. Abra a imagem de canal duplo, inicie a janela Criar máscara de segmento e mude o canal para fase.
   6. Ajuste um limiar apropriado e remova pequenos objetos com o botão Definir objetos. Em Refine Mask, escolha Remover bordas objetos e, posteriormente, máscaras separadas de bactérias adjacentes umas às outras.
   7. Calcule os escores de polaridade do sinal no canal 488 para cada célula, como foi descrito anteriormente nas etapas 4.1.2-4.1.3.
2. Quantificação da dinâmica para proteínas de fusão sfGFP (Figura 6)
   NOTA: Siga as instruções da seção 3 para preparar uma amostra para aquisição de imagens. A dinâmica é definida como mudanças de intensidade ao longo do tempo e as seguintes etapas são projetadas para curtos períodos de imagem (ou seja, vários minutos). Adicione à almofada os suplementos apropriados se forem desejados períodos de imagem mais longos.
   1. Na janela Captura de imagem, marque Timelapse, digite o tempo dos intervalos na caixa de intervalo e digite 2 na caixa # de Pontos de Tempo. Adquira duas imagens sucessivas de L. pneumophila expressando a proteína fluorescente de interesse.
   2. Ajuste o contraste da imagem até que as células fiquem claramente visíveis. Siga a Figura 6A e as descrições abaixo para colocar três máscaras diferentes. Use a ferramenta de região para colocar um quadrado de 0,25 x 0,25 μm no meio de pelo menos 400 células.
   3. Use o botão Região para Máscara para criar uma máscara (máscara 1) dos quadrados de interesse. Crie uma nova máscara vazia (máscara 2) e use a ferramenta pixel ou a ferramenta polígono para marcar toda a área celular de pelo menos 25 células aleatórias, que serão usadas para calcular o branqueamento da fluorescência. Crie uma nova máscara vazia (máscara 3) e use a grande ferramenta de pincel para marcar áreas entre as células, que serão usadas para subtração de fundo.
   4. Em Mask Statistics e Mask Scope, escolha Objeto para máscara 1 e máscara 2. Em seguida, em Características e Intensidade,escolha Intensidade Média e exporte os dados das duas máscaras. Para a máscara 3, exporte a intensidade média de toda a máscara.
   5. Calcule a mudança na intensidade da fluorescência para cada objeto na máscara 1 usando as seguintes fórmulas:

onde a máscara 1 é um 0,25 μm × 0,25 μm quadrado colocado no centro celular, máscara 2 cobre toda a célula, máscara 3 é o fundo entre as células, t1 é a intensidade média no primeiro ponto de tempo, e t2 é a intensidade média no segundo ponto de tempo.

5. Detecção da densidade de massa sfGFP com Crio-ET

1. Preparação de amostras, coleta de dados e reconstrução
   1. Cultivar um pedaço pesado de L. pneumophila expressando uma proteína Dot/Icm fluorescentemente marcada em placas CYE-ágar-estreptomicina por 48 horas a 37 °C. Resuspender as células em ddH₂O para OD₆₀₀ ~0.7. Adicione 5 μL de partículas de ouro coloidais (BSA Tracer, 10 nm) a 20 μL da suspensão celular.
   2. Pipeta 5 μL da mistura celular na grade de carbono furada recém-descarregada (R 2/1 na malha 200) e deixe ficar por 1 min. Mancha com papel filtro e congelar em etano líquido usando um aparelho de êmbolo acionado pela gravidade como descrito anteriormente^14,15.
   3. Imagem das amostras hidratadas congeladas com um microscópio eletrônico de transmissão de 300 kV equipado com uma arma de emissão de campo, um filtro de energia, placa de fase Volta e um dispositivo de detecção direta. Coletar séries de inclinação de um eixo único em ampliações de 26.000x e 42.000x, que resultam em tamanhos de pixels no nível da amostra de 5,4 Å/pixel ou 3,4 Å/pixel, respectivamente.
   4. Use o pacote tomográfico SerialEM para coletar pilhas de imagem a ~0 μm dedefocus, com uma gama de ângulos de inclinação entre -60° e +60° com incremento de 3° de passo e dose acumulada de ~60 e^-/Å^2,16. Alinhar imagens de filme fracionadas em cada pilha usando MotionCor2¹⁷. Montar pilhas corrigidas à deriva usando TOMOAUTO¹⁴.
   5. Alinhar pilhas corrigidas à deriva pelo alinhamento dependente do marcador IMOD¹⁸. Reconstruir tomogramas com o método SIRT¹⁹ para segmentações e análise direta de imagem e o método WBP²⁰.
2. Análise de subtomograma de amostras de fusões sfGFP
   1. Use o pacote tomográfico I3 (0.9.9.3) para análise de subtomograma^14,21,22.
      NOTA: O alinhamento prossegue iterativamente, com cada iteração composta por três partes nas quais são geradas referências e máscaras de classificação, subtomogramas alinhados e classificados, e as médias de classe alinhadas entre si.
   2. Use 4 x 4 x 4 subtomogramas binados para um alinhamento inicial. Mesclar partículas que pertencem às médias de classe e mostram densidade de elétrons correspondente ao sfGFP. Depois de classificar partículas com fusões sfGFP, use subtomogramas binados 2 x 2 x 2 para um alinhamento focalizado de uma região de interesse (como o complexo ATPase citoplasmático Dot/Icm) para obter uma estrutura de alta resolução.

Resultados

A recombinação homólogo com dupla seleção em duas etapas foi utilizada para construir a inserção definida do sfGFP. Na primeira etapa, foi realizado o acasalamento triparental, onde o plasmídeo conjugado pRK600 (um plasmid IncP) da cepa auxiliar E. coli MT616 foi mobilizado para o doador E. coli cepa com o vetor suicida pSR47S contendo o gene sfGFP ladeado pelas duas regiões homólogas, a origem da transferência oriT e o bacillus subseleção genética Em seguida, o sistema d...

Discussão

Elucidar as funções dos sistemas de secreção bacteriana é a chave para uma compreensão completa das interações hospedeira-patógena. Os sistemas de secreção são máquinas complexas que podem injetar proteínas de efeitos em células hospedeiras, e em alguns casos promovem o estabelecimento de um nicho subcelular que suporta a replicação bacteriana. O método acima fornece novas ferramentas importantes para estudar o sistema de secreção Dot/ICM do patógeno respiratório Legionella pneumophila, dan...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 nm colloidal gold particles	Aurion	25486
100x Plan Apo objective (1.4 NA)	Nikon
ACES	Sigma-Aldrich	A9758
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	C5510
Agaroze GPG/LMP, low melt	American bioanalytical	AB00981
Bacto dehydrated agar	BD	214010
CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera	Photometrics
Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 µL	Fisher Scientific	AB-0578
Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh	Quantifoil	Q225-CR1
Iron(III) nitrate nonahydrate	Sigma-Aldrich	216828
K2 Summit camera for cryo-EM	GATAN
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352
Microscope cover slides 22x22 mm	Fisher Scientific	12-542B
Microscope cover slides 24x50 mm	Fisher Scientific	12-545K
Microscope slides 25x75x1 mm	Globe Scientific	1380
SlideBook 6.0	Intelligent Imaging Innovations
Spectra X light engine	Lumencor
Taq 2X Master Mix	New England BioLabs	M0270
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific
Yeast Extract	BD	212750