גירוי נישות תאי גזע והתחדשות רקמות בעור עכבר על ידי פוטוגנרציה תלוית פרוטופורפירין IX ניתנת להחלפה של מיני חמצן תגובתי באתרם

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא לגרום לייצור חולף in vivo של רמות לא קטלניות של מיני חמצן תגובתי (ROS) בעור העכבר, ולקדם עוד יותר תגובות פיזיולוגיות ברקמה.

Abstract

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להשראת פוטוגנרציה ניתנת להחלפה in vivo של מיני חמצן תגובתי אנדוגני (ROS) בעור עכבר. ייצור חולף זה של ROS באתרו מפעיל ביעילות את התפשטות התאים בגומחות תאי גזע וממריץ התחדשות רקמות המתבטאת בחוזקה באמצעות האצת ריפוי כוויות ותהליכי צמיחת זקיקי שיער. הפרוטוקול מבוסס על טיפול פוטודינמי מווסת המטפל ברקמה עם קודמנים של הפוטונסיטייזר האנדוגני פרוטופורפירין IX ומקרין עוד יותר את הרקמה באור אדום תחת פרמטרים פיסיקוכימיים מבוקרים היטב. בסך הכל, פרוטוקול זה מהווה כלי ניסויי מעניין לניתוח הביולוגיה של ROS.

Introduction

מיני חמצן תגובתי (ROS) הם תוצאה של חיזור כימי של חמצן מולקולרי ליצירת מים, וכוללים חמצן סינגלט, אניון סופראוקסיד, מי חמצן ורדיקל הידרוקסיל ^1,2,3. ל-ROS יש תוחלת חיים קצרה מאוד בשל אופיים הריאקטיבי הכימי ביותר. באורגניזמים אירוביים, ROS נוצרים באופן מקרי בתוך התאים כתוצר לוואי דולף עיקרי של נשימה אירובית (שרשרת הובלת אלקטרונים) במיטוכונדריה. הצטברות חולפת של רמות גבוהות של ROS בתא גורמת למצב של עקה חמצונית שעלולה לעורר השבתה בלתי הפיכה של חלבונים, שומנים וסוכרים והכנסת מוטציות במולקולת הדנ"א 2,3,4,5. ההצטברות ההדרגתית של נזקי חמצון בתאים, רקמות ואורגניזמים שלמים עולה בהתמדה עם הזמן ונקשרה להשראת תוכניות מוות תאי, מספר פתולוגיות ותהליך ההזדקנות 2,3,4,6.

אורגניזמים אירוביים פיתחו בהתמדה מנגנונים מולקולריים יעילים כדי להתמודד עם הצטברות עודפת של ROS בתאים וברקמות. מנגנונים אלה כוללים חברים במשפחת החלבונים סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD), אשר מזרזים את פירוק רדיקלי סופראוקסיד לחמצן מולקולרי ומי חמצן, כמו גם קטלזות ופרוקסידאזות שונות המשתמשות במאגר נוגדי החמצון (גלוטתיון, NADPH, פרוקסירדוקסין, תיורדוקסין ^7,8) כדי לזרז את ההמרה הבאה של מי חמצן למים ולחמצן מולקולרי.

עם זאת, מספר דוחות תומכים בתפקיד של ROS כרכיבי מפתח של מעגלים מולקולריים המווסתים תפקודי תאים קריטיים, כולל התפשטות, התמיינות וניידות ^2,3,4. תפיסה זו נתמכת גם על ידי זיהוי ואפיון ראשוני של מנגנונים ייעודיים לייצור ROS באורגניזמים אירוביים, כולל lipoxygenases cyclooxygenases ו- NADPH oxidases ^9,10. במובן זה, ROS ממלאים תפקיד פעיל במהלך התפתחות עוברים בעלי חוליות 11,12,13 ותפקידי מפתח עבור מולקולות אלה בוויסות תפקודים פיזיולוגיים ספציפיים in vivo דווחו במערכות ניסוי שונות, כולל תוכנית התמיינות של אבות המטופויטיים בדרוזופילה¹⁴, השראת ריפוי בדגי זברה^, או התחדשות זנב בראשנים של קסנופוס ¹⁵. ביונקים, ROS היה מעורב בפוטנציאל ההתחדשות העצמית / התמיינות של תאי גזע עצביים במודל נוירוספרה¹⁶ ובדה-רגולציה של תפקוד תאי גזע במעי במהלך התחלת סרטן המעי הגס¹⁷. בעור, איתות ROS נקשר להתמיינות אפידרמיס ולוויסות נישת תאי גזע העור ומחזור צמיחת זקיק השערה^18,19.

מנקודת מבט זו, מגבלה ניסיונית עיקרית לקביעת התפקידים הפיזיולוגיים של ROS במערכות ביולוגיות, הן בתנאים נורמליים והן בתנאים פתולוגיים, היא היעדר כלים ניסיוניים מתאימים כדי לגרום לייצור מבוקר של מולקולות אלה בתאים וברקמות, הדומות במדויק לייצור הפיזיולוגי שלהן כשליחי איתות שני. כיום, רוב הגישות הניסיוניות כוללות מתן ROS אקסוגני, בעיקר בצורה של מי חמצן. לאחרונה יישמנו גישה ניסיונית להפעלת ייצור invivo ארעי ולא קטלני של ROS אנדוגני בעור העכבר, המבוססת על מתן מבשרי הפוטוגנזה פרוטופורפירין IX (PpIX; למשל, חומצה אמינולאבולינית או נגזרת המתיל שלה מתילאמינולבולינאט) והקרנה נוספת של הדגימה באור אדום כדי לגרום להיווצרות באתרו של ROS מחמצן מולקולרי תוך-תאי (איור 1). הליך פוטודינמי זה עשוי לשמש ביעילות כדי לעורר נישות תאי גזע תושבים, ובכך להפעיל את תוכניות ההתחדשות של הרקמה^19,20 ולפתוח את הדרך לשיטות טיפוליות חדשות ברפואה רגנרטיבית של העור. כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של הפרוטוקול, המציג דוגמאות מייצגות של גירוי של נישות תאי גזע, שנמדדו כעלייה במספר התאים השומרים על תווית 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) לטווח ארוך (LRCs) באזור הבליטה של זקיק השערה^19,21, ולאחר מכן הפעלה של תוכניות התחדשות (האצת צמיחת שיער ותהליכי ריפוי כוויות) המושרה על ידי חולף^, ייצור ROS לא קטלני בעור של זן עכבר C57Bl6.

Protocol

כל הליכי גידול העכבר והניסויים חייבים להתבצע בהתאם לחקיקה המקומית, הלאומית, הבינלאומית ולהנחיות בנושא ניסויים בבעלי חיים.

1. השראת צמיחת שיער, השראת כוויות וזיהוי של BrdU LRCs ארוכי טווח באפיתל עור הזנב

הערה: יש להשתמש בעכברי C57BL/6 בני 10 ימים או 7 שבועות, רצוי כעכברי המלטה, עבור התכנונים הניסיוניים המתוארים להלן. בכל הליכי הניסוי, בעלי חיים יורדמו על ידי שאיפת איזופלורן 3% או יעברו המתת חסד על ידי פריקת צוואר הרחם כפי שצוין.

1. השראת צמיחת שיער בעור האחורי של עכברים בשלב הטלוגן השני (מנוחה) (בערך ביום ה-50 לאחר הלידה)
   1. מרדימים עכברים בשאיפה של 3% איזופלורן. יש לוודא הרדמה עמוקה מלאה על ידי היעדר רפלקס דוושה (צביטת בוהן מוצקה). יש לגלח שני אזורים עצמאיים זה לצד זה של העור האחורי בכל עכבר באמצעות קוצץ שיער וקרם אפילטורי (Table of Materials). השתמש בצד שמאל לבקרה ובצד ימין לטיפול.
      הערה: בדקו כי לאחר הגילוח, העור האחורי התת-קרקעי ורדרד ולא אפור/שחור, אינדיקטור למלנוגנזה וכניסה לשלב האנגן (גדילה) בזן עכבר זה.
   2. יש לשטוף היטב עם PBS כדי להסיר את כל שאריות הקרם ולהמשיך להשראת ייצור ארעי באתרו של רמות ROS לא קטלניות כמתואר בסעיף 2.1.
   3. תעד את צמיחת זקיקי השיער באמצעות רכישה יומית של תמונות ברזולוציה גבוהה של אזורי עור הגב המטופלים בכל חיה (למשל, באמצעות מצלמת HD המוצמדת לעדשה דו-עינית של 5-20x).
2. השראת נגעי כוויות^מדרגה שנייה בעור האחורי של עכברים בשלב הטלוגן השני (מנוחה) (בערך ביום ה-50 לאחר הלידה)
   1. מרדימים עכברים. יש לגלח את כל אזור עור הגב בכל עכבר באמצעות קוצץ שיער וקרם מסיר שיער ולשטוף היטב עם PBS כדי להסיר את כל שאריות הקרם.
      הערה: יש לתת זריקות תת עוריות באתרן של לידוקאין 0.5% (2 מ"ג/מ"ל) במי מלח סטריליים, שלא יעלו על 7 מ"ג/מ"ל, ממש לפני הליך הצריבה.
   2. מחממים מוט פליז (1 ס"מ בחתך רוחב) בטמפרטורה של 95°C על ידי טבילה במים רותחים ולאחר מכן מרחו על האזור המרכזי של משטח העור האחורי הגבי של כל עכבר במשך 5 שניות.
   3. מיד לאחר יצירת הכוויה, תוך צפקית להזריק לבעלי החיים 1 מ"ל של תמיסה פיזיולוגית (0.9% NaCl) על שמיכה חשמלית כדי למנוע התייבשות. תן לבעלי החיים להתאושש במשך 24 שעות ולהמשיך להשראת ייצור ארעי באתרו של רמות ROS לא קטלניות כמתואר בסעיף 2.3.
   4. תיעוד התקדמות פצעי הכוויה באמצעות רכישה יומית של תמונות ברזולוציה גבוהה של אזורי עור הגב המטופלים בכל חיה (למשל, באמצעות מצלמת HD המוצמדת לעדשה דו-עינית של 5-20x).
3. יצירה וזיהוי של BrdU LRCs ארוכי טווח באפיתל עור הזנב
   1. יש להזריק ליטרמטים בני 10/14 יום תוך צפקית (ללא הרדמה) פעם ביום במשך 4 ימים רצופים עם משקל גוף של 50 מ"ג/ק"ג BrdU מומס ב-PBS. לאחר שלב ההתוויה, אפשרו לעכברים לגדול במשך 50-60 יום לפני כל טיפול.
      הערה: השתמש במחט טרייה עבור כל הזרקה.
   2. המשך כמתואר בסעיף 2.3 להשראת ייצור ROS לא קטלני באתרו בעור הזנב בזמנים שונים לפני הכנת רקמות סיטונאיות.
   3. כדי להכין שלמים של אפידרמיס זנב, להרדים עכברים על ידי נקע צוואר הרחם לחתוך את הזנבות עם מספריים כירורגיים.
      1. השתמש באזמל כדי לבצע חתך אורכי ישר לאורך כל הזנב ולקלף את כל העור כחתיכה אחת מעמוד השדרה. יש לדגור על העור המקולף ב-5 mM EDTA ב-PBS בצינורות 5 מ"ל למשך 4 שעות ב-37°C ולהפריד בזהירות יריעות שלמות של אפידרמיס מהדרמיס באמצעות מלקחיים.
      2. תקן את הרקמה בפורמלדהיד 4% ב- PBS למשך 72 שעות לפחות בטמפרטורת החדר (RT) והמשך לזיהוי BrdU באמצעות נוגדנים מתאימים.
      3. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי/קונפוקלי כדי לזהות ולכמת LRCs בכל תנאי ניסוי, כולל בקרות אור וטיפולים פוטודינמיים בזמנים שונים לפני הכנת רקמות סיטוניות, כפי שתואר קודם לכן בפירוט^19,20.
         הערה: ניתן לאחסן יריעות אפידרמיס קבועות ב-PBS המכילות 0.02% נתרן אזיד ב-4°C למשך עד שלושה חודשים. ניתן להשתמש ביריעות אפידרמיס קבועות לאימונולוקליזציה של חלבונים נדרשים בעקבות הליכים סטנדרטיים של חתכים היסטולוגיים.

2. השראת ייצור חולף של רמות ROS לא קטלניות בעור עכבר

הערה: כדי לגרום לייצור חולף של רמות ROS לא קטלניות בעור עכבר, טיפול פוטודינמי באמצעות קודמן של photoensitizer אנדוגני PpIX, במקרה זה, methyl-aminolevulinate (mALA), ואור אדום ישמש.

1. כדי להפעיל ייצור ROS חולף להשראת צמיחת שיער בעור האחורי, הכינו את בעלי החיים כמצוין בסעיף 1.1.
   1. יש למרוח ~ 25 מ"ג של mALA בצורה של קרם מקומי (טבלה של חומרים) על האזור הימני, תוך שמירה על צד שמאל כבקרה פנימית הימנעות מהבדלים בין אנשים. דוגרים במשך 2.5 שעות בחושך, שוטפים היטב את עודפי הקרם עם PBS. כדי לוודא את עומק ההרדמה, עקוב אחר בעלי החיים כל 10 דקות עד להחלמה מלאה.
      הערה: הייצור של PpIX בעור האחורי צריך להיבדק באתרו על ידי הפלואורסצנטיות האדומה שלו תחת עירור אור כחול (407 ננומטר).
   2. מרדימים את בעלי החיים.
   3. יש להקרין את כל עור הגב עם מקור אור אדום מתאים (טבלת חומרים) למינון כולל של 2.5-4 J/cm². שמור עכברים על שמיכה חשמלית עד להחלמה מלאה שלהם ולהמשיך כמתואר בשלב 1.1.3.
      הערה: יש לכוונן את הקרינה על-ידי מניפולציה של המרחק בין מקור האור לרקמה ולמדוד אותה באמצעות מד אנרגיית הספק (Table of Materials). הניסוי נחשב גמור כאשר צמיחת שיער מלאה נצפתה בכל אחד מהאזורים המגולחים העצמאיים של כל חיה. ההליך כולו כולל טיפול צילום אחד בלבד.
2. כדי להפעיל ייצור ROS חולף לשיפור ריפוי של נגעי כוויות^מדרגה שנייה, הכינו את בעלי החיים כמצוין בסעיף 1.2.
   1. יש למרוח ~ 25 מ"ג של mALA בצורה של קרם מקומי לאורך כל המשטח השרוף, המקיף כ -4 מ"מ של רקמה סמוכה. דוגרים במשך 2.5 שעות בחושך, שוטפים היטב את עודפי הקרם עם PBS. כדי לוודא את עומק ההרדמה, עקוב אחר בעלי החיים כל 10 דקות עד להחלמה מלאה.
   2. מרדימים את בעלי החיים.
   3. להקרין את כל עור הגב עם מקור אור אדום מתאים למינון כולל של 2.5-4 J/cm². שמור את העכברים על שמיכה חשמלית עד להחלמה מלאה שלהם ולהמשיך כמתואר בשלב 1.2.4.
      הערה: ההליך הניסיוני עבור כל בעל חיים נחשב גמור כאשר ריפוי כוויות מלא הוא ציין. ההליך כולו כולל טיפול צילום אחד בלבד.
3. כדי להפעיל ייצור ROS חולף בעור הזנב, הכינו עכברים כמצוין בסעיף 1.3, מרחו ~ 25 מ"ג של mALA בצורה של קרם מקומי לאורך כל אזור הרקמה הגבית והמשיכו כמתואר בסעיף 2.1 לעור הגב. בצע טיפולי צילום ובקרות אור כתב 24 שעות, 48 שעות או 72 שעות לפני המתת חסד של בעלי חיים וחילוץ נוסף של תושבות שלמות עור הזנב.
   הערה: בכל תכנוני הניסוי, בדקו את התלות ב-ROS של התהליך באמצעות נבלות נוגדות חמצון מסוג ROS (למשל, חיסון יומי של 100 מ"ג/ק"ג משקל גוף N-אצטיל-ציסטאין על ידי הזרקה תוך צפקית של תמיסת 20 מ"ג/מ"ל ב-PBS, pH 7.2, החל מ-5 ימים לפני טיפולי mALA או, לחילופין, שתי מנות של 100 מ"ג/מ"ל חומצה אסקורבית באתנול 50%, במרווח של 30 דקות, נמרח באופן מקומי על העור במרווח הזמן שבין טיפולי mALA להקרנת אור אדום).

3. זיהוי ROS בעור

1. הערכת Ex vivo של ייצור ROS בעור הזנב לאחר טיפול פוטודינמי באמצעות הידרואתידין
   הערה: הידרואתידין היא מולקולה לא פלואורסצנטית שמגיבה באופן ספציפי עם ROS כדי לייצר צבע פלואורסצנטי 2-הידרוקסיאתידיום (hET).
   1. לדגור על עורות זנב שלמים, המתקבלים כמתואר בסעיף 1.3.3, למשך 3 שעות ב-37°C ב-5 mM EDTA בתמיסת PBS (דגימות בקרה) או בנוסף מכילים 2 mM mALA (דגימות טיפול פוטודינמיות).
   2. בכל המקרים, יש להוסיף הידרואתידין לריכוז סופי של 3.2 מיקרומטר ממלאי של 25 מ"ג/מ"ל בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) ולדגור במשך שעה אחת בחושך ב-RT.
   3. מתחו את דגימות עור הזנב על משטח זכוכית באמצעות קצות האצבעות והקרינו באור אדום של 636 ננומטר בשטף של 10 J/cm² .
   4. המשך באופן מיידי להפרדת האפידרמיס מהדרמיס ולתיקון יריעות האפידרמיס כמתואר בסעיף 1.3.3.
   5. הערך את הפליטה האדומה של hET תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי/קונפוקלי באמצעות אור ירוק מרגש, צלם תמונות באיכות גבוהה והמשך בניתוח נוסף.
      הערה: השתמש בצביעת hET של דגימות רקמה בהיעדר טיפול פוטודינמי כבקרה שלילית לאוטוקסידציה של hET.
2. זיהוי In vivo של ייצור ROS בעור הגב לאחר השראת צמיחת שיער וריפוי כוויות ואחריו טיפול פוטודינמי
   הערה: שלב זה מבוצע באמצעות 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DHF-DA), תרכובת לא-פלואורסצנטית של התא, שלאחר פיצול על-ידי אנזימי אסטראז תוך-תאיים, מגיבה באופן ספציפי עם ROS המעניק את הצבע הפלואורסצנטי 2′,7′-dichlorofluorescein (DCF).
   1. השתמש בבעלי חיים שהוכנו להשראת צמיחת שיער (סעיף 1.1) או ריפוי כוויות (סעיף 1.2). רגע לפני טיפולי קרם mALA מקומיים (ראה סעיפים 2.1 ו-2.2), יש לפזר 100 מיקרוליטר של 1 מ"ג/מ"ל באתנול 50% של DHF-DA על כל אזורי העור המטופלים/בקרת המטרה, לתת לעור לספוג את החומר במלואו ולהמשיך הלאה עם מריחת קרם mALA מקומי.
   2. יש לדגור על בעלי חיים מטופלים במשך 4 שעות בחושך, לשטוף היטב את קרם mALA המקומי מהעור עם PBS ולהוציא מנה שנייה של 100 μL של תמיסת DHF-DA על העור. כדי לוודא את עומק ההרדמה, עקוב אחר בעלי החיים כל 10 דקות עד להחלמה מלאה.
   3. לדגור על בעלי חיים מטופלים במשך 50 דקות בחושך, להרדים ולהקרין את כל העור האחורי עם פלואנס הנע בין 2.5 ל 4 J / cm² של 636 ננומטר אור אדום באמצעות מנורת LED.
   4. מיד לאחר ההקרנה, יש להעריך את רמות ה-ROS הנוצרות בעור באמצעות מערכת הדמיה in vivo (טבלת חומרים). הגדר את תיבת המסנן לעירור של 445-490 ננומטר ולפליטה של 515-575 ננומטר, צלם תמונות באיכות גבוהה והמשך בניתוח נוסף.
      הערה: השתמש בצביעת DHF-DA של דגימות רקמה בהיעדר טיפול פוטודינמי כבקרה שלילית עבור אוטוקסידציה של DHF-DA.

תוצאות

מתן מקומי של קודמן mALA בעור הגב והזנב של העכבר גורם להצטברות משמעותית של PpIX בכל הרקמה, ובאופן ניכר, בזקיק השערה, כפי שמודגם על-ידי הפלואורסצנטיות הוורודה-אדמדמה של התרכובת הזו תחת עירור אור כחול (407 ננומטר) (איור 2A,C). הקרנה עוקבת של רקמה מטופלת באור אדום (636 ננומטר) בשט?...

Discussion

כאן, אנו מציגים מתודולוגיה המאפשרת הפעלה חולפת של ייצור ROS אנדוגני in vivo בעור עכבר עם השפעות פיזיולוגיות. המתודולוגיה מבוססת על הליך פוטודינמי לגרימת גירוי מבוקר ומקומי של הפוטונסיטייזר האנדוגני PpIX (איור 1B). גישה ניסויית זו היא כלי מעניין לחקר הביולוגיה של ROS במערכות ניסויי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate	Sigma Aldrich	D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridine	Sigma Aldrich	B5002-500MG
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein	Roche	11202693001
Depilatory cream (e.g., Veet)	Veet
Dihydroethidium	Sigma Aldrich	37291-25MG
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2	Perkin Elmer
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g	Galderma
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D)	ThorLabs
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp	Photocure ASA