Fare Derisinde Kök Hücre Nişlerinin Uyarılması ve Doku Rejenerasyonu, Değiştirilebilir Protoporfirin IX'a Bağlı Reaktif Oksijen Türlerinin Fotojenerasyonu ile Yerinde

Özet

Bu protokolün amacı, fare derisinde öldürücü olmayan seviyelerde reaktif oksijen türlerinin (ROS) geçici in vivo üretimini indüklemek ve dokudaki fizyolojik tepkileri daha da teşvik etmektir.

Özet

Burada, fare derisinde endojen reaktif oksijen türlerinin (ROS) değiştirilebilir in vivo fotojenerasyonunu indüklemek için bir protokol açıklıyoruz. Bu geçici ROS in situ üretimi, kök hücre nişlerinde hücre proliferasyonunu etkili bir şekilde aktive eder ve yanık iyileşmesinin ve saç folikülü büyüme süreçlerinin hızlanmasıyla güçlü bir şekilde ortaya çıktığı gibi doku yenilenmesini uyarır. Protokol, dokuyu endojen ışığa duyarlılaştırıcı protoporfirin IX'un öncülleri ile tedavi eden ve ayrıca sıkı bir şekilde kontrol edilen fizikokimyasal parametreler altında dokuyu kırmızı ışıkla ışınlayan düzenlenebilir bir fotodinamik tedaviye dayanmaktadır. Genel olarak, bu protokol ROS biyolojisini analiz etmek için ilginç bir deneysel araç oluşturmaktadır.

Giriş

Reaktif oksijen türleri (ROS), moleküler oksijenin su oluşturmak üzere kimyasal indirgenmesinin sonucudur ve singlet oksijen, süperoksit anyonu, hidrojen peroksit ve hidroksil radikali 1,2,3'ü içerir. ROS, son derece kimyasal reaktif yapıları nedeniyle çok kısa bir ömre sahiptir. Aerobik organizmalarda, ROS, mitokondrideki aerobik solunumun (elektron taşıma zinciri) önemli bir sızdıran yan ürünü olarak hücrelerin içinde tesadüfen oluşur. Hücrede yüksek seviyelerde ROS'un geçici olarak birikmesi, proteinlerin, lipitlerin ve şekerlerin geri dönüşümsüz inaktivasyonunu ve DNA molekülünde^{mutasyonların ortaya} çıkmasına neden olabilecek oksidatif bir stres durumuna neden olur 2,3,4,5. Hücrelerde, dokularda ve tüm organizmalarda oksidatif hasarın kademeli birikimi zamanla istikrarlı bir şekilde artar ve hücre ölüm programlarının, çeşitli patolojilerin ve yaşlanma sürecinin^indüksiyonu ile ilişkilendirilmiştir 2,3,4,6.

Aerobik organizmalar, hücrelerde ve dokularda aşırı ROS birikiminin üstesinden gelmek için sürekli olarak verimli moleküler mekanizmalar geliştirmiştir. Bu mekanizmalar, süperoksit radikal dismutasyonunu moleküler oksijen ve hidrojen peroksite katalize eden süperoksit dismutaz (SOD) protein ailesinin üyelerini ve ayrıca hidrojen peroksitin daha sonra suya ve moleküler oksijene dönüşümünü katalize etmek için antioksidan havuzu (glutatyon, NADPH, peroksiredoksin, tioredoksin ^7,8) kullanan farklı katalazları ve peroksidazları içerir.

Bununla birlikte, birkaç rapor, ROS'un proliferasyon, farklılaşma ve hareketlilik^dahil olmak üzere kritik hücre fonksiyonlarını düzenleyen moleküler devrelerin temel bileşenleri olarak rolünü desteklemektedir ^2,3,4. Bu kavram, lipoksijenazlar, siklooksijenazlar ve NADPH oksidazlar ^9,10 dahil olmak üzere aerobik organizmalarda özel ROS üreten mekanizmaların ilk tanımlanması ve karakterizasyonu ile daha da desteklenmektedir. Bu anlamda, ROS omurgalı embriyo gelişimi sırasında aktif bir rol sergiler 11,12,13 ve bu moleküllerin spesifik in vivo fizyolojik fonksiyonların düzenlenmesinde kilit rolleri^, Drosophila^14'te hematopoietik progenitörlerin farklılaşma programı, zebra balıklarında iyileşme indüksiyonu veya Xenopus kurbağa yavrularında kuyruk rejenerasyonu ¹⁵ dahil olmak üzere farklı deneysel sistemlerde bildirilmiştir . Memelilerde ROS, bir nörosfer modelinde¹⁶ nöral kök hücrelerin kendi kendini yenileme / farklılaşma potansiyelinde ve kolorektal kanser başlangıcı sırasında bağırsak kök hücre fonksiyonunun deregülasyonunda¹⁷ rol oynamıştır. Deride, ROS sinyalizasyonu epidermal farklılaşma ve cilt kök hücre nişinin ve saç folikülü büyüme döngüsünün^{düzenlenmesi ile ilişkilendirilmiştir 18,19}.

Bu perspektifte, hem normal hem de patolojik koşullarda biyolojik sistemlerde ROS'un fizyolojik rollerini belirlemek için önemli bir deneysel sınırlama, bu moleküllerin hücrelerde ve dokularda kontrollü üretimini indüklemek için yeterli deneysel araçların bulunmamasıdır. Şu anda, çoğu deneysel yaklaşım, çoğunlukla hidrojen peroksit formunda eksojen ROS uygulamasını içermektedir. Yakın zamanda, endojen ışığa duyarlılaştırıcı protoporfirin IX'un öncüllerinin uygulanmasına dayanan fare derisinde geçici, öldürücü olmayan bir in vivo endojen ROS üretimini açmak için deneysel bir yaklaşım uyguladık (PpIX; ör., aminolaevulinik asit veya metil türevi metilaminolevulinat) ve hücre içi moleküler oksijenden yerinde ROS oluşumunu indüklemek için numunenin kırmızı ışıkla daha fazla ışınlanması (Şekil 1). Bu fotodinamik prosedür, yerleşik kök hücre nişlerini uyarmak için etkili bir şekilde kullanılabilir, böylece dokunun rejeneratif programlarını aktive eder ^19,20 ve cilt^rejeneratif tıbbında yeni terapötik modalitelerin yolunu açar. Burada, saç folikülünün^19,21 çıkıntı bölgesindeki uzun süreli 5-bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) etiket tutucu hücrelerin (LRC'ler) sayısındaki artış olarak ölçülen, kök hücre nişlerinin uyarılmasının temsili örneklerini gösteren protokolün ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz ve ardından geçici olarak indüklenen rejenerasyon programlarının aktivasyonu (saç büyümesinin hızlanması ve yanık iyileşme süreçleri), C57Bl6 fare suşunun derisinde öldürücü olmayan ROS üretimi.

Protokol

Tüm fare yetiştiriciliği ve deney prosedürleri, hayvan deneyleri ile ilgili yerel, ulusal, uluslararası mevzuat ve yönergelere uygun olarak yürütülmelidir.

1. Saç büyümesinin indüksiyonu, yanık indüksiyonu ve kuyruk derisi epitelindeki uzun süreli BrdU LRC'lerin tanımlanması

NOT: Aşağıda açıklanan deneysel tasarımlar için 10 günlük veya 7 haftalık C57BL/6 fareler, tercihen yavrular kullanın. Tüm deneysel prosedürlerde, hayvanlar% 3 izofluran inhalasyonu ile uyuşturulacak veya belirtildiği gibi servikal çıkık ile ötenazi yapılacaktır.

1. İkinci telojen (dinlenme) fazında farelerin arka derisinde saç büyümesinin indüksiyonu (doğumdan yaklaşık 50. gün)
   1. % 3 izofluran inhalasyonu ile fareleri uyuşturun. Pedal refleksi (sert ayak parmağı sıkışması) eksikliği ile tam derin anesteziyi onaylayın. Saç kesme makinesi ve tüy dökücü krem kullanarak her bir farede sırt derisinin yan yana iki bağımsız bölgesini tıraş edin (Malzeme Tablosu). Kontrol için sol tarafı, tedavi için sağ tarafı kullanın.
      NOT: Tıraştan sonra, alt arka derinin pembemsi olduğunu ve gri/siyah olmadığını, bu fare suşunda melanogenezin ve anajen (büyüme) fazına girişin bir göstergesi olduğunu kontrol edin.
   2. Tüm krem kalıntılarını gidermek için PBS ile iyice yıkayın ve bölüm 2.1'de açıklandığı gibi ölümcül olmayan ROS seviyelerinin geçici yerinde üretiminin indüksiyonuna devam edin.
   3. Her hayvanda kontrol ve tedavi edilen arka deri bölgelerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini günlük olarak alarak saç folikülü büyümesini kaydedin (örneğin, 5−20x dürbün merceğe bağlı bir HD kamera kullanarak).
2. İkinci telojen (dinlenme) fazda farelerin arka derisinde 2^{. derece} yanık lezyonlarının indüksiyonu (doğumdan yaklaşık 50. gün)
   1. Fareleri uyuşturun. Saç kesme makinesi ve tüy dökücü krem kullanarak her bir farede tüm arka deri bölgesini tıraş edin ve tüm krem kalıntılarını gidermek için PBS ile iyice yıkayın.
      NOT: Yakma prosedüründen hemen önce 7 mg / ml'yi geçmeyen steril salin içinde% 0.5 (2 mg / ml) lidokain enjeksiyonlarını yerinde uygulayın.
   2. Pirinç bir çubuğu (enine kesiti 1 cm) kaynar suya batırarak 95 °C'de önceden ısıtın ve ardından her farenin sırt arka deri yüzeyinin orta bölgesine 5 saniye boyunca uygulayın.
   3. Yanık oluşumundan hemen sonra, dehidrasyonu önlemek için hayvanlara 1 mL fizyolojik çözelti (% 0.9 NaCl) ile intraperitoneal olarak elektrikli bir battaniyeye enjekte edin. Hayvanların 24 saat boyunca iyileşmesine izin verin ve bölüm 2.3'te açıklandığı gibi ölümcül olmayan ROS seviyelerinin yerinde geçici üretiminin indüksiyonuna devam edin.
   4. Her hayvanda kontrol ve tedavi edilen arka deri bölgelerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini günlük olarak alarak yanık yarası ilerlemesini kaydedin (örneğin, 5−20x dürbün merceğe bağlı bir HD kamera kullanarak).
3. Kuyruk derisi epitelinde uzun süreli BrdU LRC'lerin üretilmesi ve tanımlanması
   1. PBS'de çözünmüş 50 mg / kg vücut ağırlığı BrdU ile art arda 4 gün boyunca günde bir kez 10/14 günlük littermatları intraperitoneal (anestezi olmadan) enjekte edin. Etiketleme aşamasından sonra, herhangi bir tedaviden önce farelerin 50-60 gün büyümesine izin verin.
      NOT: Her enjeksiyon için yeni bir iğne kullanın.
   2. Doku bütünlüklerinin hazırlanmasından önce farklı zamanlarda kuyruk derisinde geçici in situ öldürücü olmayan ROS üretiminin indüksiyonu için bölüm 2.3'te açıklandığı gibi ilerleyin.
   3. Kuyruk epidermisinin tamamını hazırlamak için, fareleri servikal çıkık ile ötenazi yapın ve kuyrukları cerrahi makasla klipsleyin.
      1. Kuyruk boyunca düz bir uzunlamasına kesi yapmak için bir neşter kullanın ve tüm cildi omurgadan tek bir parça olarak soyun. Soyulmuş cildi 37 ° C'de 4 saat boyunca 5 mL tüplerde PBS'de 5 mM EDTA'da inkübe edin ve forseps kullanarak sağlam epidermis tabakalarını dermisten dikkatlice ayırın.
      2. Dokuyu oda sıcaklığında (RT) en az 72 saat boyunca PBS'de% 4 formaldehit içinde sabitleyin ve uygun antikorları kullanarak BrdU tespitine devam edin.
      3. Daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, doku bütünlüklerinin hazırlanmasından önce farklı zamanlarda ışık kontrolleri ve fotodinamik tedaviler dahil olmak üzere her deneysel durumda LRC'leri tanımlamak ve ölçmek için floresan/konfokal mikroskopi kullanın^19,20.
         NOT: Sabit epidermal tabakalar, %0.02 sodyum azid içeren PBS'de 4 °C'de üç aya kadar saklanabilir. Standart histolojik kesit prosedürlerini takiben gerekli proteinlerin immünolokalizasyonu için sabit epidermal tabakalar kullanılabilir.

2. Fare derisinde ölümcül olmayan ROS seviyelerinin geçici üretiminin indüksiyonu

NOT: Fare derisinde ölümcül olmayan ROS seviyelerinin geçici üretimini indüklemek için, endojen ışığa duyarlılaştırıcı PpIX'in bir öncüsü kullanılarak fotodinamik bir tedavi, bu durumda metil-aminolevulinat (mALA) ve kırmızı ışık kullanılacaktır.

1. Arka deride tüylenmenin indüksiyonu için geçici ROS üretimini açmak için, hayvanları bölüm 1.1'de belirtildiği gibi hazırlayın.
   1. ~25 mg mALA'yı topikal krem şeklinde (Malzeme Tablosu) sağ bölgeye uygulayın, sol tarafı iç kontrol olarak tutarak bireyler arası farklılıklardan kaçının. Karanlıkta 2,5 saat inkübe edin, fazla kremayı PBS ile iyice yıkayın. Anestezi derinliğini doğrulamak için, tamamen iyileşene kadar hayvanları her 10 dakikada bir izleyin.
      NOT: Arka deride PpIX üretimi, mavi ışık (407 nm) uyarımı altında kırmızı floresansı ile yerinde test edilmelidir.
   2. Hayvanları uyuşturun.
   3. Tüm sırt derisini toplam 2.5−4 J /^cm2 dozu için yeterli bir kırmızı ışık kaynağı (Malzeme Tablosu) ile ışınlayın. Fareleri tamamen iyileşene kadar elektrikli battaniye üzerinde tutun ve adım 1.1.3'te açıklandığı gibi devam edin.
      NOT: Işınım, ışık kaynağı ile doku arasındaki mesafe manipüle edilerek ayarlanmalı ve bir güç enerji ölçer (Malzeme Tablosu) kullanılarak ölçülmelidir. Her hayvanın bağımsız traş bölgelerinden herhangi birinde tam tüy büyümesi gözlemlendiğinde deney bitmiş sayılır. Tüm prosedür sadece tek bir fotoğraf tedavisini içerir.
2. 2^{. derece} yanık lezyonlarının iyileşmesi için geçici ROS üretimini açmak için, hayvanları bölüm 1.2'de belirtildiği gibi hazırlayın.
   1. Yanmış yüzey boyunca topikal krem şeklinde ~ 25 mg mALA uygulayın ve yaklaşık 4 mm bitişik dokuyu kaplayın. Karanlıkta 2,5 saat inkübe edin, fazla kremayı PBS ile iyice yıkayın. Anestezi derinliğini doğrulamak için, tamamen iyileşene kadar hayvanları her 10 dakikada bir izleyin.
   2. Hayvanları uyuşturun.
   3. Tüm sırt derisini toplam 2.5−4 J /^cm2 dozu için yeterli bir kırmızı ışık kaynağı ile ışınlayın. Fareleri tamamen iyileşene kadar elektrikli battaniye üzerinde tutun ve adım 1.2.4'te açıklandığı gibi devam edin.
      NOT: Tam yanık iyileşmesi gözlendiğinde her hayvan için deneysel prosedür bitmiş sayılır. Tüm prosedür sadece tek bir fotoğraf tedavisini içerir.
3. Kuyruk derisinde geçici ROS üretimini açmak için, fareleri bölüm 1.3'te belirtildiği gibi hazırlayın, dorsal doku alanı boyunca topikal krem şeklinde ~ 25 mg mALA uygulayın ve sırt derisi için bölüm 2.1'de açıklandığı gibi devam edin. Hayvan ötenazisinden 24 saat, 48 saat veya 72 saat önce fotoğraf tedavileri ve ilgili ışık kontrolleri gerçekleştirin ve kuyruk derisinin tüm bağlantılarının daha fazla çıkarılması.
   NOT: Tüm deneysel tasarımlarda, antioksidan ROS tutucular kullanarak işlemin ROS bağımlılığını test edin (ör., PBS'de 20 mg / mL'lik bir çözeltinin intraperitoneal enjeksiyonu ile günlük 100 mg / kg vücut ağırlığı N-asetil-sistein aşılanması, pH 7.2, mALA tedavilerinden 5 gün önce başlayarak veya alternatif olarak,% 50 etanol içinde iki doz 100 mg / mL askorbik asit, 30 dakika aralıklı, mALA tedavileri ve kırmızı ışık ışınlaması arasındaki zaman aralığında cilde topikal olarak uygulanır).

3. Deride ROS tespiti

1. Hidroetidin kullanılarak fotodinamik işlemden sonra kuyruk derisinde ROS üretiminin ex vivo değerlendirilmesi
   NOT: Hidroetidin, floresan boya 2-hidroksietidyum (hET) üretmek için spesifik olarak ROS ile reaksiyona giren, floresan olmayan bir moleküldür.
   1. Bölüm 1.3.3'te tarif edildiği gibi elde edilen bütün kuyruk derilerini, PBS çözeltisinde (kontrol numuneleri) 5 mM EDTA içinde 37 °C'de 3 saat inkübe edin veya ek olarak 2 mM mALA (fotodinamik işlem numuneleri) ekleyin.
   2. Her durumda, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 25 mg / mL'lik bir stoktan 3.2 μM'lik bir nihai konsantrasyona hidroetidin ekleyin ve RT'de karanlıkta 1 saat inkübe edin.
   3. Kuyruk derisi örneklerini parmak uçlarınızı kullanarak cam bir yüzey üzerinde gerin ve 10 J/^cm2 akıcılıkta 636 nm kırmızı ışıkla ışınlayın.
   4. Epidermisi dermisten ayırmak ve epidermal tabakaları bölüm 1.3.3'te açıklandığı gibi sabitlemek için hemen devam edin.
   5. Yeşil heyecan verici ışık kullanarak bir floresan/konfokal mikroskop altında hET kırmızı emisyonunu değerlendirin, yüksek kaliteli görüntüler yakalayın ve daha fazla analize devam edin.
      NOT: hET otoksidasyonu için negatif bir kontrol olarak fotodinamik tedavi yokluğunda doku örneklerinin hET boyamasını kullanın.
2. Saç büyümesinin indüklenmesi ve yanık iyileşmesinin ardından fotodinamik tedaviden sonra arka deride ROS üretiminin in vivo tespiti
   NOT: Bu adım, hücre içi esteraz enzimleri tarafından bölünmeden sonra, spesifik olarak 2',7'-diklorofloresein (DCF) floresan boyasını veren ROS ile reaksiyona giren, hücre kaynaklı floresan olmayan bir bileşik olan 2',7'-diklorodihidrofloresein diasetat (DHF-DA) kullanılarak gerçekleştirilir.
   1. Saç büyümesinin indüksiyonu (bölüm 1.1) veya yanık iyileşmesi (bölüm 1.2) için hazırlanmış hayvanları kullanın. Topikal mALA krem uygulamalarından hemen önce (bkz. bölüm 2.1 ve 2.2), 100 μL 1 mg/mL'yi %50 etanol içinde DHF-DA tüm hedef kontrol/tedavi edilen cilt bölgelerine topikal olarak dağıtın, cildin materyali tamamen emmesine izin verin ve topikal mALA krem uygulamasına devam edin.
   2. Tedavi edilen hayvanları karanlıkta 4 saat inkübe edin, topikal mALA kremini PBS ile ciltten iyice yıkayın ve cilde ikinci bir doz 100 μL DHF-DA solüsyonu verin. Anestezi derinliğini doğrulamak için, tamamen iyileşene kadar hayvanları her 10 dakikada bir izleyin.
   3. Tedavi edilen hayvanları karanlıkta 50 dakika kuluçkaya yatırın, bir LED lamba kullanarak 636 nm kırmızı ışığın 2,5 ila 4 J/^cm2'si arasında değişen bir akıcılıkla tüm sırt derisini uyuşturun ve ışınlayın.
   4. Işınlamadan hemen sonra, bir in vivo görüntüleme sistemi (Malzeme Tablosu) kullanarak ciltte üretilen ROS seviyelerini değerlendirin. Filtre kutusunu 445−490 nm uyarma ve 515−575 nm emisyon için ayarlayın, yüksek kaliteli görüntüler yakalayın ve daha fazla analize devam edin.
      NOT: DHF-DA otoksidasyonu için negatif kontrol olarak fotodinamik tedavi yokluğunda doku örneklerinin DHF-DA boyamasını kullanın.

Sonuçlar

Fare sırt ve kuyruk derisinde mALA öncüsünün topikal uygulaması, bu bileşiğin mavi ışık (407 nm) uyarımı altında kırmızımsı-pembe floresansı ile gösterildiği gibi, tüm dokuda ve belirgin şekilde kıl folikülünde önemli bir PpIX birikimine neden olur (Şekil 2A, C). Tedavi edilen dokunun daha sonra kırmızı ışıkla (636 nm) 2.5−4 J /^cm2'lik bir akıcılıkta ışınlanması, dokuda, özellikle saç folikülünün şişkin bölgesinde...

Tartışmalar

Burada, fare derisinde fizyolojik etkilerle in vivo endojen ROS üretiminin geçici aktivasyonuna izin veren bir metodoloji sunuyoruz. Metodoloji, endojen ışığa duyarlılaştırıcı PpIX'in kontrollü ve lokal bir stimülasyonunu indüklemek için fotodinamik bir prosedüre dayanmaktadır (Şekil 1B). Bu deneysel yaklaşım, ROS biyolojisini in vivo deneysel sistemlerde incelemek için ilginç bir araçtır ve harici ROS kaynakları (genellikle hidrojen peroksit) kullanan metodolojiler ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate	Sigma Aldrich	D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridine	Sigma Aldrich	B5002-500MG
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein	Roche	11202693001
Depilatory cream (e.g., Veet)	Veet
Dihydroethidium	Sigma Aldrich	37291-25MG
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2	Perkin Elmer
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g	Galderma
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D)	ThorLabs
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp	Photocure ASA