Stimolazione di nicchie di cellule staminali e rigenerazione tissutale nella pelle di topo mediante fotogenerazione commutabile protoporfirina IX-dipendente di specie reattive dell'ossigeno in situ

Riepilogo

Lo scopo di questo protocollo è quello di indurre la produzione transitoria in vivo di livelli non letali di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nella pelle del topo, promuovendo ulteriormente le risposte fisiologiche nel tessuto.

Abstract

Qui, descriviamo un protocollo per indurre la fotogenerazione commutabile in vivo di specie reattive dell'ossigeno endogene (ROS) nella pelle del topo. Questa produzione transitoria di ROS in situ attiva in modo efficiente la proliferazione cellulare nelle nicchie delle cellule staminali e stimola la rigenerazione dei tessuti come fortemente manifestato attraverso l'accelerazione della guarigione delle ustioni e dei processi di crescita del follicolo pilifero. Il protocollo si basa su un trattamento fotodinamico regolabile che tratta il tessuto con precursori del fotosensibilizzatore endogeno protoporfirina IX e irradia ulteriormente il tessuto con luce rossa sotto parametri fisico-chimici strettamente controllati. Nel complesso, questo protocollo costituisce un interessante strumento sperimentale per analizzare la biologia dei ROS.

Introduzione

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono il risultato della riduzione chimica dell'ossigeno molecolare per formare acqua e includono ossigeno singoletto, anione superossido, perossido di idrogeno e il radicale ossidrile ^1,2,3. I ROS hanno una durata molto breve a causa della loro natura estremamente reattiva chimica. Negli organismi aerobici, i ROS si formano incidentalmente all'interno delle cellule come un importante sottoprodotto della respirazione aerobica (catena di trasporto degli elettroni) nei mitocondri. L'accumulo transitorio di alti livelli di ROS nella cellula provoca una condizione di stress ossidativo che può provocare l'inattivazione irreversibile di proteine, lipidi e zuccheri e l'introduzione di mutazioni nella molecola di DNA 2,3,4,5. Il graduale accumulo di danno ossidativo nelle cellule, nei tessuti e negli organismi interi aumenta costantemente con il tempo ed è stato associato all'induzione di programmi di morte cellulare, diverse patologie e il processo di invecchiamento 2,3,4,6.

Gli organismi aerobici hanno costantemente sviluppato meccanismi molecolari efficienti per affrontare l'accumulo di ROS in eccesso nelle cellule e nei tessuti. Questi meccanismi includono membri della famiglia delle proteine superossido dismutasi (SOD), che catalizzano la dismutazione radicalica del superossido in ossigeno molecolare e perossido di idrogeno, nonché diverse catalasi e perossidasi che utilizzano il pool antiossidante (glutatione, NADPH, perossiredossina, tioredossina ^7,8) per catalizzare la successiva conversione del perossido di idrogeno in acqua e ossigeno molecolare.

Tuttavia, diversi rapporti supportano il ruolo dei ROS come componenti chiave dei circuiti molecolari che regolano le funzioni cellulari critiche, tra cui proliferazione, differenziazione e mobilità ^2,3,4. Questo concetto è ulteriormente supportato dall'identificazione iniziale e dalla caratterizzazione di meccanismi dedicati che producono ROS in organismi aerobici, tra cui le lipossigenasi cicloossigenasi e le NADPH ossidasi ^9,10. In questo senso, i ROS mostrano un ruolo attivo durante lo sviluppo embrionale dei vertebrati 11,12,13 e ruoli chiave per queste molecole nella regolazione di specifiche funzioni fisiologiche in vivo sono stati riportati in diversi sistemi sperimentali, tra cui il programma di differenziazione dei progenitori ematopoietici in Drosophila^14, l'induzione di guarigione nel pesce zebra o la rigenerazione della coda nei girini di Xenopus ¹⁵. Nei mammiferi, i ROS sono stati coinvolti nel potenziale di auto-rinnovamento/differenziazione delle cellule staminali neurali in un modello di neurosfera¹⁶ e nella deregolazione della funzione delle cellule staminali intestinali durante l'inizio del cancro del colon-retto¹⁷. Nella pelle, la segnalazione dei ROS è stata associata alla differenziazione epidermica e alla regolazione della nicchia delle cellule staminali cutanee e del ciclo di crescita del follicolo pilifero^18,19.

In questa prospettiva, una delle principali limitazioni sperimentali per determinare i ruoli fisiologici dei ROS nei sistemi biologici, sia in condizioni normali che patologiche, è la mancanza di adeguati strumenti sperimentali per indurre una produzione controllata di queste molecole in cellule e tessuti, assomigliando accuratamente alla loro produzione fisiologica come messaggeri di seconda segnalazione. Allo stato attuale, la maggior parte degli approcci sperimentali prevede la somministrazione di ROS esogeni, principalmente sotto forma di perossido di idrogeno. Abbiamo recentemente implementato un approccio sperimentale per attivare una produzione transitoria e non letale in vivo di ROS endogeni nella pelle del topo, basato sulla somministrazione di precursori del fotosensibilizzatore endogeno protoporfirina IX (PpIX; ad esempio, acido aminolaevulinico o il suo derivato metilamminolevulinato) e ulteriore irradiazione del campione con luce rossa per indurre la formazione in situ di ROS dall'ossigeno molecolare intracellulare (Figura 1). Questa procedura fotodinamica può essere efficacemente utilizzata per stimolare nicchie di cellule staminali residenti, attivando così i programmi rigenerativi del tessuto^19,20 e aprendo la strada a nuove modalità terapeutiche nella medicina rigenerativa cutanea. Qui, presentiamo una descrizione dettagliata del protocollo, mostrando esempi rappresentativi di stimolazione di nicchie di cellule staminali, misurata come un aumento del numero di cellule di mantenimento dell'etichetta (LRC) a lungo termine di 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU) nella regione del rigonfiamento del follicolo pilifero^19,21 e successiva attivazione di programmi di rigenerazione (accelerazione della crescita dei capelli e processi di guarigione delle ustioni) indotti da transitori^, produzione non letale di ROS nella cute del ceppo di topo C57Bl6.

Protocollo

Tutte le procedure di allevamento e sperimentazione dei topi devono essere condotte in conformità con la legislazione locale, nazionale, internazionale e le linee guida sulla sperimentazione animale.

1. Induzione della crescita dei peli, induzione delle ustioni e identificazione di LRC BrdU a lungo termine nell'epitelio della pelle della coda wholemounts

NOTA: Utilizzare topi C57BL/6 di 10 giorni o 7 settimane, preferibilmente cucciolate, per i disegni sperimentali descritti di seguito. In tutte le procedure sperimentali, gli animali saranno anestetizzati mediante inalazione di isoflurano al 3% o eutanasia mediante dislocazione cervicale come indicato.

1. Induzione della crescita dei peli nella pelle posteriore dei topi nella seconda fase telogen (a riposo) (circa giorno 50 post-natale)
   1. Anestetizzare i topi con inalazione di isoflurano al 3%. Confermare l'anestesia profonda completa per mancanza di un riflesso del pedale (pizzico fermo della punta). Rasare due regioni indipendenti affiancate della pelle posteriore in ogni singolo topo usando tagliacapelli e crema depilatoria (Table of Materials). Utilizzare il lato sinistro per il controllo e il lato destro per il trattamento.
      NOTA: Controllare che, dopo la rasatura, la pelle posteriore sottostante sia rosata e non grigia/nera, indicatore di melanogenesi e ingresso nella fase anagen (crescita) in questo ceppo murino.
   2. Lavare accuratamente con PBS per rimuovere tutti i residui di crema e procedere all'induzione della produzione transitoria in situ di livelli di ROS non letali come descritto nel paragrafo 2.1.
   3. Registra la crescita del follicolo pilifero attraverso l'acquisizione giornaliera di immagini ad alta risoluzione delle aree della pelle posteriore di controllo e trattate in ciascun animale (ad esempio, utilizzando una videocamera HD accoppiata a un obiettivo binoculare 5-20x).
2. Induzione di lesioni da ustione di 2^{° grado nella} pelle posteriore dei topi nella seconda fase telogen (a riposo) (circa giorno 50 post-natale)
   1. Anestetizzare i topi. Rasare l'intera regione della pelle posteriore in ogni singolo topo usando tagliacapelli e crema depilatoria e lavare accuratamente con PBS per rimuovere tutti i resti di crema.
      NOTA: Somministrare in situ iniezioni sottocutanee di lidocaina allo 0,5% (2 mg/ml) in soluzione salina sterile, non superiore a 7 mg/ml, poco prima della procedura di combustione.
   2. Preriscaldare una barra di ottone (1 cm di sezione trasversale) a 95 °C immergendola in acqua bollente e quindi applicare sulla regione centrale della superficie dorsale della pelle dorsale di ciascun topo per 5 s.
   3. Subito dopo la generazione di ustioni, iniettare per via intraperitoneale gli animali con 1 ml di soluzione fisiologica (0,9% NaCl) su una coperta elettrica per prevenire la disidratazione. Lasciare che gli animali si riprendano per 24 ore e procedere all'induzione della produzione transitoria in situ di livelli di ROS non letali, come descritto nel paragrafo 2.3.
   4. Registrare la progressione della ferita da ustione attraverso l'acquisizione giornaliera di immagini ad alta risoluzione delle aree della pelle posteriore di controllo e trattate in ciascun animale (ad esempio, utilizzando una telecamera HD accoppiata a un obiettivo binoculare 5-20x).
3. Generazione e identificazione di LRC BrdU a lungo termine nell'epitelio della pelle della coda
   1. Iniettare compagni di cucciolata di 10/14 giorni per via intraperitoneale (senza anestesia) una volta al giorno per 4 giorni consecutivi con 50 mg/kg di peso corporeo di BrdU sciolto in PBS. Dopo la fase di etichettatura, lasciare crescere i topi per 50-60 giorni prima di qualsiasi trattamento.
      NOTA: Usi un ago nuovo per ogni iniezione.
   2. Procedere come descritto nel paragrafo 2.3 per l'induzione della produzione transitoria di ROS non letale in situ nella pelle della coda in momenti diversi prima della preparazione del tessuto intero.
   3. Per preparare interi monti di epidermide della coda, eutanasia topi per lussazione cervicale e tagliare le code con forbici chirurgiche.
      1. Usa un bisturi per fare un'incisione longitudinale dritta lungo tutta la coda e sbuccia l'intera pelle come un unico pezzo dalla spina dorsale. Incubare la pelle pelata in 5 mM EDTA in PBS in tubi da 5 mL per 4 ore a 37 °C e separare accuratamente i fogli intatti di epidermide dal derma usando una pinza.
      2. Fissare il tessuto in formaldeide al 4% in PBS per almeno 72 ore a temperatura ambiente (RT) e procedere per il rilevamento di BrdU utilizzando anticorpi appropriati.
      3. Utilizzare la microscopia a fluorescenza/confocale per identificare e quantificare le LRC in ogni condizione sperimentale, compresi i controlli della luce e i trattamenti fotodinamici in momenti diversi prima della preparazione del tessuto intero, come precedentemente descritto in dettaglio^19,20.
         NOTA: I fogli epidermici fissi possono essere conservati in PBS contenenti azoturo di sodio allo 0,02% a 4 °C per un massimo di tre mesi. I fogli epidermici fissi possono essere utilizzati per l'immunolocalizzazione delle proteine richieste seguendo le procedure standard delle sezioni istologiche.

2. Induzione della produzione transitoria di livelli di ROS non letali nella pelle del topo

NOTA: Per indurre la produzione transitoria di livelli di ROS non letali nella pelle del topo, verrà utilizzato un trattamento fotodinamico utilizzando un precursore del fotosensibilizzatore endogeno PpIX, in questo caso, metil-amminolevulinato (mALA) e luce rossa.

1. Per attivare la produzione transitoria di ROS per l'induzione della crescita dei peli nella pelle posteriore, preparare gli animali come indicato nel paragrafo 1.1.
   1. Applicare ~ 25 mg di mALA sotto forma di crema topica (Table of Materials) sulla regione destra, mantenendo il lato sinistro come controllo interno evitando differenze interindividuali. Incubare per 2,5 ore al buio, lavare accuratamente la crema in eccesso con PBS. Per confermare la profondità dell'anestesia, monitorare gli animali ogni 10 minuti fino a completo recupero.
      NOTA: La produzione di PpIX nella pelle posteriore deve essere testata in situ mediante la sua fluorescenza rossa sotto eccitazione di luce blu (407 nm).
   2. Anestetizzare gli animali.
   3. Irradiare tutta la pelle della schiena con un'adeguata fonte di luce rossa (Table of Materials) per una dose totale di 2,5−4 J/cm². Tenere i topi su una coperta elettrica fino al loro completo recupero e procedere come descritto al punto 1.1.3.
      NOTA: L'irraggiamento deve essere regolato manipolando la distanza tra la sorgente luminosa e il tessuto e misurato utilizzando un misuratore di energia (Tabella dei materiali). L'esperimento è considerato finito quando si osserva una crescita completa dei peli in una qualsiasi delle regioni rasate indipendenti di ciascun animale. L'intera procedura prevede un solo trattamento fotografico.
2. Per attivare la produzione transitoria di ROS per il miglioramento della guarigione delle lesioni da ustione di 2^{° grado,} preparare gli animali come indicato nella sezione 1.2.
   1. Applicare ~ 25 mg di mALA sotto forma di crema topica lungo tutta la superficie bruciata, comprendendo circa 4 mm di tessuto adiacente. Incubare per 2,5 ore al buio, lavare accuratamente la crema in eccesso con PBS. Per confermare la profondità dell'anestesia, monitorare gli animali ogni 10 minuti fino a completo recupero.
   2. Anestetizzare gli animali.
   3. Irradiare l'intera pelle della schiena con un'adeguata fonte di luce rossa per una dose totale di 2,5−4 J/cm². Tenere i topi su una coperta elettrica fino al loro completo recupero e procedere come descritto al punto 1.2.4.
      NOTA: La procedura sperimentale per ciascun animale è considerata conclusa quando si osserva la completa guarigione delle ustioni. L'intera procedura prevede un solo trattamento fotografico.
3. Per attivare la produzione transitoria di ROS nella pelle della coda, preparare i topi come indicato nel paragrafo 1.3, applicare ~25 mg di mALA sotto forma di crema topica lungo tutta l'area del tessuto dorsale e procedere come descritto nel paragrafo 2.1 per la pelle della schiena. Eseguire trattamenti fotografici e corrispondenti controlli della luce 24 ore, 48 ore o 72 ore prima dell'eutanasia animale e dell'ulteriore estrazione della pelle della coda intere montature.
   NOTA: In tutti i progetti sperimentali, analizzare la ROS-dipendenza del processo utilizzando scavenger antiossidanti ROS (ad esempio, inoculazione giornaliera di 100 mg/kg di peso corporeo N-acetil-cisteina mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione da 20 mg/ml in PBS, pH 7,2, iniziando 5 giorni prima dei trattamenti con mALA o, in alternativa, due dosi di 100 mg/ml di acido ascorbico in etanolo al 50%, distanziato di 30 minuti, applicato localmente sulla pelle nell'intervallo di tempo tra i trattamenti mALA e l'irradiazione a luce rossa).

3. Rilevamento ROS nella pelle

1. Valutazione ex vivo della produzione di ROS nella pelle della coda dopo trattamento fotodinamico con idroetidina
   NOTA: L'idroetidina è una molecola non fluorescente che reagisce specificamente con i ROS per produrre colorante fluorescente 2-idrossietidio (hET).
   1. Incubare pelli intere della coda, ottenute come descritto al punto 1.3.3, per 3 ore a 37 °C in 5 mM di EDTA in soluzione PBS (campioni di controllo) o contenenti inoltre 2 mM di mALA (campioni di trattamento fotodinamico).
   2. In tutti i casi, aggiungere idroetidina a una concentrazione finale di 3,2 μM da uno stock di 25 mg/ml in dimetilsolfossido (DMSO) e incubare per 1 ora al buio a RT.
   3. Allungare i campioni di pelle della coda su una superficie di vetro usando la punta delle dita e irradiare con luce rossa a 636 nm con una fluenza di 10 J/cm² .
   4. Procedere immediatamente a separare l'epidermide dal derma e a fissare i fogli epidermici come descritto al paragrafo 1.3.3.
   5. Valutare l'emissione rossa hET al microscopio a fluorescenza/confocale utilizzando la luce verde eccitante, acquisire immagini di alta qualità e procedere con ulteriori analisi.
      NOTA: Utilizzare la colorazione hET dei campioni di tessuto in assenza di trattamento fotodinamico come controllo negativo per l'autossidazione hET.
2. Rilevamento in vivo della produzione di ROS nella pelle posteriore dopo induzione della crescita dei peli e guarigione delle ustioni seguita da trattamento fotodinamico
   NOTA: Questo passaggio viene eseguito utilizzando 2′,7′-diclorodiidrofluoresceina diacetato (DHF-DA), un composto non fluorescente permeato da cellule che, dopo la scissione da parte degli enzimi esterasi intracellulari, reagisce specificamente con i ROS dando il colorante fluorescente 2′,7′-diclorofluoresceina (DCF).
   1. Utilizzare animali preparati per l'induzione della crescita dei peli (paragrafo 1.1) o la guarigione delle ustioni (paragrafo 1.2). Appena prima dei trattamenti topici con mALA crema (vedere paragrafi 2.1 e 2.2), erogare localmente 100 μL di 1 mg/ml in etanolo al 50% di DHF-DA su tutte le aree cutanee di controllo target/trattate, lasciare che la pelle assorba completamente il materiale e procedere con l'applicazione topica della crema mALA.
   2. Incubare gli animali trattati per 4 ore al buio, lavare accuratamente la crema topica mALA dalla pelle con PBS e dispensare una seconda dose di 100 μL di soluzione di DHF-DA sulla pelle. Per confermare la profondità dell'anestesia, monitorare gli animali ogni 10 minuti fino a completo recupero.
   3. Incubare gli animali trattati per 50 minuti al buio, anestetizzare e irradiare tutta la pelle della schiena con una fluenza che va da 2,5 a 4 J/cm² di luce rossa a 636 nm utilizzando una lampada a LED.
   4. Immediatamente dopo l'irradiazione, valutare i livelli di ROS generati nella pelle utilizzando un sistema di imaging in vivo (Table of Materials). Impostare la scatola del filtro per l'eccitazione a 445-490 nm e l'emissione di 515-575 nm, acquisire immagini di alta qualità e procedere con ulteriori analisi.
      NOTA: Utilizzare la colorazione DHF-DA dei campioni di tessuto in assenza di trattamento fotodinamico come controllo negativo per l'autossidazione DHF-DA.

Risultati

La somministrazione topica del precursore mALA nella pelle della schiena e della coda del topo provoca un accumulo significativo di PpIX nell'intero tessuto e, notevolmente, nel follicolo pilifero, come dimostrato dalla fluorescenza rosa-rossastra di questo composto sotto eccitazione di luce blu (407 nm) (Figura 2A,C). La successiva irradiazione del tessuto trattato con luce rossa (636 nm) ad una fluenza di 2,5−4 J/cm 2 promuove la produzione transitoria di ROS ...

Discussione

Qui presentiamo una metodologia che consente un'attivazione transitoria della produzione endogena di ROS in vivo nella pelle di topo con effetti fisiologici. La metodologia si basa su una procedura fotodinamica per indurre una stimolazione controllata e locale del fotosensibilizzatore endogeno PpIX (Figura 1B). Questo approccio sperimentale è uno strumento interessante per studiare la biologia dei ROS in sistemi sperimentali in vivo che costituiscono un progresso significativo rispetto alle...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate	Sigma Aldrich	D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridine	Sigma Aldrich	B5002-500MG
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein	Roche	11202693001
Depilatory cream (e.g., Veet)	Veet
Dihydroethidium	Sigma Aldrich	37291-25MG
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2	Perkin Elmer
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g	Galderma
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D)	ThorLabs
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp	Photocure ASA