Стимуляция ниш стволовых клеток и регенерация тканей в коже мышей с помощью переключаемой протопорфирина IX-зависимой фотогенерации активных форм кислорода in situ

Резюме

Целью этого протокола является индуцирование транзиторной in vivo продукции нелетальных уровней активных форм кислорода (АФК) в коже мышей, что способствует дальнейшему развитию физиологических реакций в тканях.

Аннотация

В данной статье мы опишем протокол индуцирования переключаемой фотогенерации in vivo эндогенных активных форм кислорода (АФК) в коже мышей. Эта транзиторная продукция АФК in situ эффективно активирует пролиферацию клеток в нишах стволовых клеток и стимулирует регенерацию тканей, что сильно проявляется через ускорение процессов заживления ожогов и роста волосяных фолликулов. Протокол основан на регулируемом фотодинамическом лечении, которое обрабатывает ткань предшественниками эндогенного фотосенсибилизатора протопорфирина IX и далее облучает ткань красным светом при строго контролируемых физико-химических параметрах. В целом, этот протокол представляет собой интересный экспериментальный инструмент для анализа биологии АФК.

Введение

Активные формы кислорода (АФК) являются результатом химического восстановления молекулярного кислорода с образованием воды и включают синглетный кислород, супероксид-анион, перекись водорода и гидроксильный радикал ^1,2,3. АФК имеют очень короткий срок службы из-за их чрезвычайно химически активной природы. У аэробных организмов АФК случайно образуются внутри клеток как основной побочный продукт аэробного дыхания (цепь переноса электронов) в митохондриях. Временное накопление высоких уровней АФК в клетке приводит к окислительному стрессу, который может спровоцировать необратимую инактивацию белков, липидов и сахаров и введение мутаций в молекулу ДНК 2,3,4,5. Постепенное накопление окислительных повреждений в клетках, тканях и целых организмах неуклонно возрастает с течением времени и связано с индукцией программ клеточной гибели, некоторыми патологиями и процессом старения 2,3,4,6.

Аэробные организмы неуклонно развивают эффективные молекулярные механизмы для борьбы с избыточным накоплением АФК в клетках и тканях. Эти механизмы включают членов семейства белков супероксиддисмутазы (СОД), которые катализируют радикальную дисмутацию супероксида в молекулярный кислород и перекись водорода, а также различные каталазы и пероксидазы, которые используют антиоксидантный пул (глутатион, НАДФН, пероксиредоксин, тиоредоксин ^7,8) для катализа последующего превращения перекиси водорода в воду и молекулярный кислород.

Тем не менее, в нескольких отчетах подтверждается роль АФК в качестве ключевых компонентов молекулярных цепей, регулирующих важнейшие функции клеток, включая пролиферацию, дифференцировку и подвижность ^2,3,4. Эта концепция также подтверждается первоначальной идентификацией и характеристикой специализированных механизмов, продуцирующих АФК в аэробных организмах, включая липоксигеназы, циклооксигеназы и НАДФН-оксидазы ^9,10. В этом смысле АФК играют активную роль в развитии эмбрионов позвоночных 11,12,13, и ключевые роли этих молекул в регуляции специфических физиологических функций in vivo были описаны в различных экспериментальных системах, включая программу дифференцировки гемопоэтических предшественников у дрозофилы^14, индукцию заживления у рыбок данио или регенерацию хвоста у головастиков Xenopus ¹⁵. У млекопитающих АФК участвуют в потенциале самообновления/дифференцировки нейральных стволовых клеток в нейросферной модели¹⁶ и в дерегуляции функции кишечных стволовых клеток во время инициации колоректального рака¹⁷. В коже передача сигналов АФК связана с эпидермальной дифференцировкой и регуляцией ниши стволовых клеток кожи и циклом роста волосяных фолликулов^18,19.

С этой точки зрения, основным экспериментальным ограничением для определения физиологической роли АФК в биологических системах, как в нормальных, так и в патологических условиях, является отсутствие адекватных экспериментальных инструментов для индуцирования контролируемой продукции этих молекул в клетках и тканях, точно напоминающих их физиологическую продукцию в качестве вторичных сигнальных мессенджеров. В настоящее время большинство экспериментальных подходов предполагают введение экзогенных АФК, в основном в виде перекиси водорода. Недавно мы реализовали экспериментальный подход к включению транзиторной, нелетальной in vivo продукции эндогенных АФК в коже мышей, основанный на введении предшественников эндогенного фотосенсибилизатора протопорфирина IX (PpIX; например, аминолаэвулиновой кислоты или ее метилпроизводного метиламинолевулината) и последующем облучении образца красным светом для индуцирования in situ образования АФК из внутриклеточного молекулярного кислорода (рис. 1). Эта фотодинамическая процедура может быть эффективно использована для стимуляции резидентных ниш стволовых клеток, тем самым активируя регенеративные программы тканей^19,20 и открывая путь для новых терапевтических методов в регенеративной медицине кожи. Здесь мы представляем подробное описание протокола, показывающее репрезентативные примеры стимуляции ниш стволовых клеток, измеряемой как увеличение количества долговременных клеток, удерживающих метку 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU) в области выпуклости волосяного фолликула^19,21, и последующей активации программ регенерации (ускорение роста волос и процессов заживления ожогов), индуцированных транзиторными^, нелетальная продукция АФК в коже мышей линии C57Bl6.

протокол

Все процедуры по разведению мышей и экспериментам должны проводиться в соответствии с местным, национальным, международным законодательством и рекомендациями по экспериментам на животных.

1. Индукция роста волос, индукция ожога и идентификация долгосрочных BrdU LRC в эпителии кожи хвоста в целом

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 10-дневных или 7-недельных мышей C57BL/6, предпочтительно однопометников, для экспериментального дизайна, описанного ниже. Во всех экспериментальных процедурах животные обезболиваются ингаляцией 3% изофлурана или эвтаназией при вывихе шейки матки, как показано.

1. Индукция роста волос на задней коже мышей во второй фазе телогена (покоя) (около 50-го дня после рождения)
   1. Обезболивайте мышей ингаляцией 3% изофлурана. Подтвердить полную глубокую анестезию отсутствием педального рефлекса (сильное защемление пальца ноги). Побрейте два независимых участка кожи спины бок о бок у каждой мыши, используя машинку для стрижки волос и крем для депиляции (Таблица материалов). Используйте левую сторону для контроля и правую сторону для лечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что после бритья кожа спины розоватая, а не серо-черная, что является показателем меланогенеза и вступления в фазу анагена (роста) у этой линии мышей.
   2. Тщательно промойте PBS, чтобы удалить все остатки крема, и приступайте к индукции переходного in situ производства нелетальных уровней АФК, как описано в разделе 2.1.
   3. Регистрируйте рост волосяных фолликулов путем ежедневного получения изображений с высоким разрешением контрольных и обработанных участков кожи спины у каждого животного (например, с помощью HD-камеры, соединенной с 5−20-кратным бинокулярным объективом).
2. Индукция ожоговых поражений^2-й степени на коже спины мышей во второй фазе телогена (покоя) (около 50-го дня после рождения)
   1. Обезболивайте мышей. Побрейте всю область кожи спины у каждой мыши с помощью машинки для стрижки волос и крема для депиляции и тщательно вымойте PBS, чтобы удалить все остатки крема.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вводите in situ подкожные инъекции лидокаина 0,5% (2 мг/мл) в стерильном физиологическом растворе, не более 7 мг/мл, непосредственно перед процедурой сжигания.
   2. Латунный брусок (1 см в сечении) разогреть до 95 °C, погрузив в кипящую воду, а затем нанести на центральную область дорсальной поверхности задней поверхности кожи каждой мыши на 5 с.
   3. Сразу после образования ожога животным внутрибрюшинно вводят 1 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) на электрическое одеяло, чтобы предотвратить обезвоживание. Дайте животным восстановиться в течение 24 ч и приступайте к индукции переходного in situ производства нелетальных уровней АФК, как описано в разделе 2.3.
   4. Регистрируйте прогрессирование ожоговой раны путем ежедневного получения изображений с высоким разрешением контрольных и обработанных участков кожи спины у каждого животного (например, с помощью HD-камеры, соединенной с 5−20-кратным бинокулярным объективом).
3. Генерация и идентификация долгосрочных BrdU LRC в эпителии кожи хвоста
   1. Вводить 10/14-дневным однопометникам внутрибрюшинно (без анестезии) один раз в день в течение 4 дней подряд 50 мг/кг массы тела BrdU, растворенного в PBS. После фазы мечения дайте мышам порасти в течение 50−60 дней перед любым лечением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свежую иглу для каждой инъекции.
   2. Действуйте, как описано в разделе 2.3, для индукции переходного in situ нелетального образования АФК в коже хвоста в разное время перед препарированием тканей целиком.
   3. Чтобы препарировать целые эпидермисы хвоста, усыпьте мышей при вывихе шейки матки и обрежьте хвосты хирургическими ножницами.
      1. С помощью скальпеля сделайте прямой продольный надрез вдоль всего хвоста и снимите всю кожу как единый кусок с позвоночника. Инкубируют очищенную кожу в 5 мМ ЭДТА в ПБС в пробирках по 5 мл в течение 4 ч при 37 °С и осторожно отделяют неповрежденные листы эпидермиса от дермы с помощью щипцов.
      2. Зафиксируйте ткань в 4% формальдегиде в PBS в течение не менее 72 ч при комнатной температуре (RT) и приступайте к выявлению BrdU с использованием соответствующих антител.
      3. Используйте флуоресцентную/конфокальную микроскопию для идентификации и количественной оценки LRC в каждом экспериментальном состоянии, включая контроль света и фотодинамическую обработку в разное время перед подготовкой целых тканей, как подробно описано ранее^19,20.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированные эпидермальные листы можно хранить в PBS, содержащем 0,02% азида натрия, при 4 °C до трех месяцев. Фиксированные эпидермальные листы могут быть использованы для иммунолокализации необходимых белков после стандартных процедур гистологических срезов.

2. Индукция транзиторной продукции нелетальных уровней АФК в коже мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Для индуцирования транзиторной продукции нелетальных уровней АФК в коже мышей будет использоваться фотодинамическая обработка с использованием предшественника эндогенного фотосенсибилизатора PpIX, в данном случае метил-аминолевулината (mALA), и красного света.

1. Чтобы включить переходную продукцию АФК для индукции роста волос на коже спины, подготовьте животных, как указано в разделе 1.1.
   1. Нанесите ~25 мг мАЛК в форме крема для местного применения (Таблица материалов) на правую область, сохраняя левую сторону в качестве внутреннего контроля, избегая межиндивидуальных различий. Выдерживают 2,5 ч в темноте, излишки крема тщательно смывают ПБС. Чтобы подтвердить глубину анестезии, наблюдайте за животными каждые 10 минут до полного выздоровления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выработка PpIX в коже спины должна быть проверена in situ путем его красной флуоресценции при возбуждении синим светом (407 нм).
   2. Обезболивайте животных.
   3. Облучают всю кожу спины адекватным источником красного света (Таблица материалов) в суммарной дозе 2,5−4 Дж/^см2. Держите мышей на электрическом одеяле до их полного выздоровления и действуйте, как описано в шаге 1.1.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность излучения должна регулироваться путем манипулирования расстоянием между источником света и тканью и измеряться с помощью измерителя энергии мощности (Таблица материалов). Эксперимент считается законченным, когда наблюдается полный рост шерсти в любом из независимых выбритых участков каждого животного. Вся процедура включает в себя всего одну фотообработку.
2. Для включения транзиторной продукции АФК для заживления ожоговых повреждений^2-й степени подготавливают животных, как указано в разделе 1.2.
   1. Нанесите ~25 мг мАЛК в виде крема для местного применения по всей обожженной поверхности, охватывая около 4 мм прилегающих тканей. Выдерживают 2,5 ч в темноте, излишки крема тщательно смывают ПБС. Чтобы подтвердить глубину анестезии, наблюдайте за животными каждые 10 минут до полного выздоровления.
   2. Обезболивайте животных.
   3. Облучают всю кожу спины адекватным источником красного света в общей дозе 2,5−4 Дж/^см2. Держите мышей на электрическом одеяле до их полного выздоровления и действуйте, как описано в шаге 1.2.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальная процедура для каждого животного считается завершенной, когда наблюдается полное заживление ожогов. Вся процедура включает в себя всего одну фотообработку.
3. Чтобы включить транзиторную выработку АФК в коже хвоста, подготовьте мышей, как указано в разделе 1.3, нанесите ~25 мг мАЛК в виде крема для местного применения по всей области спинной ткани и действуйте, как описано в разделе 2.1 для кожи спины. За 24 ч, 48 ч или 72 ч до эвтаназии животного и дальнейшего извлечения кожи хвоста целиком проводить фотообработку и соответствующий контроль света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во всех экспериментальных проектах анализируйте АФК-зависимость процесса с помощью антиоксидантных поглотителей АФК (например, ежедневный посев 100 мг/кг массы тела N-ацетил-цистеина путем внутрибрюшинного введения раствора 20 мг/мл в PBS, pH 7,2, начиная за 5 дней до лечения мАЛК или, в качестве альтернативы, две дозы 100 мг/мл аскорбиновой кислоты в 50% этаноле, с интервалом в 30 мин, местно наносится на кожу в промежутке времени между процедурами мАЛК и облучением красным светом.

3. Обнаружение АФК в коже

1. Оценка ex vivo продукции АФК в коже хвоста после фотодинамической обработки гидроэтидином
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гидроэтидин представляет собой нефлуоресцентную молекулу, которая реагирует специфически с АФК с образованием флуоресцентного красителя 2-гидрокситидия (hET).
   1. Инкубируют целые шкурки хвоста, полученные в соответствии с разделом 1.3.3, в течение 3 ч при 37 °С в 5 мМ ЭДТА в растворе ПБС (контрольные образцы) или дополнительно содержащие 2 мМ мАЛК (образцы фотодинамической обработки).
   2. Во всех случаях добавляют гидроэтидин до конечной концентрации 3,2 мкМ из запаса 25 мг/мл в диметилсульфоксиде (ДМСО) и инкубируют в течение 1 ч в темноте при RT.
   3. Натяните образцы кожи хвоста на стеклянную поверхность кончиками пальцев и облучите красным светом 636 нм с флюенсом 10 Дж/^см2 .
   4. Немедленно приступайте к отделению эпидермиса от дермы и фиксации эпидермальных листов, как описано в разделе 1.3.3.
   5. Оцените красное излучение hET под флуоресцентным/конфокальным микроскопом с использованием зеленого возбуждающего света, сделайте высококачественные изображения и приступайте к дальнейшему анализу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте hET-окрашивание образцов тканей при отсутствии фотодинамической обработки в качестве отрицательного контроля для hET-автоокисления.
2. Выявление in vivo продукции АФК в коже спины после стимуляции роста волос и заживления ожогов с последующим фотодинамическим лечением
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется с использованием диацетата 2′,7′-дихлордигидрофлуоресцеина (DHF-DA), клеточного нефлуоресцентного соединения, которое после расщепления внутриклеточными ферментами эстеразы специфически реагирует с АФК с образованием флуоресцентного красителя 2′,7′-дихлорфлуоресцеина (DCF).
   1. Используйте животных, подготовленных для индукции роста волос (раздел 1.1) или заживления ожогов (раздел 1.2). Непосредственно перед процедурой местного применения крема с мАЛК (см. разделы 2.1 и 2.2) местно распределите 100 мкл 1 мг/мл 50% этанола DHF-DA на все целевые контрольные/обработанные участки кожи, дайте коже полностью впитать материал и приступайте к местному нанесению крема с мАЛК.
   2. Инкубируйте обработанных животных в течение 4 ч в темноте, тщательно смывайте с кожи крем для местного применения mALA с помощью PBS и наносите на кожу вторую дозу 100 мкл раствора DHF-DA. Чтобы подтвердить глубину анестезии, наблюдайте за животными каждые 10 минут до полного выздоровления.
   3. Инкубировать обработанных животных в течение 50 мин в темноте, обезболить и облучать всю кожу спины флюенсом от 2,5 до 4 Дж/^см2 красного света 636 нм с помощью светодиодной лампы.
   4. Сразу после облучения оцените уровни АФК, образующиеся в коже, с помощью системы визуализации in vivo (таблица материалов). Настройте фильтр-бокс на возбуждение 445−490 нм и излучение 515−575 нм, сделайте снимки высокого качества и приступайте к дальнейшему анализу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте окрашивание образцов тканей DHF-DA при отсутствии фотодинамической обработки в качестве отрицательного контроля для автоокисления DHF-DA.

Результаты

Местное введение предшественника мАЛК в кожу спины и хвоста мыши приводит к значительному накоплению PpIX во всей ткани и, что заметно, в волосяном фолликуле, о чем свидетельствует красновато-розовая флуоресценция этого соединения при возбуждении синим светом (407 нм) (рис. 2

Обсуждение

В данной работе мы представляем методологию, которая позволяет осуществлять транзиторную активацию продукции эндогенных АФК in vivo в коже мышей с физиологическими эффектами. Методика основана на фотодинамической процедуре индуцирования контролируемой и локальной стимуляции эндогенн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate	Sigma Aldrich	D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridine	Sigma Aldrich	B5002-500MG
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein	Roche	11202693001
Depilatory cream (e.g., Veet)	Veet
Dihydroethidium	Sigma Aldrich	37291-25MG
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2	Perkin Elmer
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g	Galderma
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D)	ThorLabs
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp	Photocure ASA