Estimulação de nichos de células-tronco e regeneração tecidual em pele de camundongo por fotogeração dependente de protoporfirina IX comutável de espécies reativas de oxigênio in situ

Resumo

O objetivo deste protocolo é induzir a produção transitória in vivo de níveis não letais de espécies reativas de oxigênio (EROs) na pele de camundongos, promovendo ainda mais respostas fisiológicas no tecido.

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para induzir fotogeração in vivo comutável de espécies reativas endógenas de oxigênio (ROS) em pele de camundongos. Essa produção transitória de ERO in situ ativa eficientemente a proliferação celular em nichos de células-tronco e estimula a regeneração tecidual, fortemente manifestada através da aceleração dos processos de cicatrização de queimaduras e crescimento de folículos pilosos. O protocolo é baseado em um tratamento fotodinâmico regulável que trata o tecido com precursores do fotossensibilizador endógeno protoporfirina IX e irradia o tecido com luz vermelha sob parâmetros físico-químicos rigorosamente controlados. De modo geral, este protocolo constitui uma ferramenta experimental interessante para analisar a biologia das EROs.

Introdução

As espécies reativas de oxigênio (EROs) são o resultado da redução química do oxigênio molecular para formar água, e incluem o oxigênio singlete, o ânion superóxido, o peróxido de hidrogênio e o radical hidroxila ^1,2,3. As ROS têm uma vida útil muito curta devido à sua natureza extremamente química reativa. Em organismos aeróbios, as ERO são formadas incidentalmente no interior das células como um importante subproduto da respiração aeróbica (cadeia de transporte de elétrons) nas mitocôndrias. O acúmulo transitório de altos níveis de ERO na célula resulta em uma condição de estresse oxidativo que pode provocar a inativação irreversível de proteínas, lipídios e açúcares e a introdução de mutações na molécula de DNA 2,3,4,5. O acúmulo gradual de dano oxidativo em células, tecidos e organismos inteiros aumenta progressivamente com o tempo e tem sido associado à indução de programas de morte celular, diversas patologias e ao processo de envelhecimento 2,3,4,6.

Os organismos aeróbios têm desenvolvido constantemente mecanismos moleculares eficientes para combater o acúmulo excessivo de ERO em células e tecidos. Esses mecanismos incluem membros da família de proteínas superóxido dismutase (SOD), que catalisam a dismutação do radical superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio, bem como diferentes catalases e peroxidases que utilizam o pool antioxidante (glutationa, NADPH, peroxirredoxina, tiorredoxina ^7,8) para catalisar a subsequente conversão de peróxido de hidrogênio em água e oxigênio molecular.

No entanto, vários relatos suportam o papel das ROS como componentes-chave de circuitos moleculares que regulam funções celulares críticas, incluindo proliferação, diferenciação e^{mobilidade2,3,4}. Esse conceito é ainda apoiado pela identificação e caracterização inicial de mecanismos dedicados produtores de ERO em organismos aeróbios, incluindo lipoxigenases ciclooxigenases e NADPH oxidases ^9,10. Nesse sentido, as ERO exibem um papel ativo durante o desenvolvimento embrionário de vertebrados 11,12,13 e papéis fundamentais para essas moléculas na regulação de funções fisiológicas específicas in vivo têm sido relatados em diferentes sistemas experimentais, incluindo o programa de diferenciação de progenitores hematopoéticos em Drosophila^14, indução de cura em zebrafish ou regeneração da cauda em girinos de Xenopus ¹⁵. Em mamíferos, as ROS têm sido envolvidas no potencial de auto-renovação/diferenciação de células-tronco neurais em um modelo de neuroesfera¹⁶ e na desregulação da função das células-tronco intestinais durante o início do câncer colorretal¹⁷. Na pele, a sinalização das ERO tem sido associada à diferenciação epidérmica e à regulação do nicho de células-tronco cutâneas e do ciclo de crescimento dos folículos pilosos^18,19.

Nessa perspectiva, uma grande limitação experimental para determinar os papéis fisiológicos das ROS em sistemas biológicos, tanto em condições normais quanto patológicas, é a falta de ferramentas experimentais adequadas para induzir a produção controlada dessas moléculas em células e tecidos, assemelhando-se com precisão à sua produção fisiológica como mensageiros de segunda sinalização. Atualmente, a maioria das abordagens experimentais envolve a administração de ERO exógenas, principalmente na forma de peróxido de hidrogênio. Recentemente, implementamos uma abordagem experimental para ativar uma produção in vivo transitória e não letal de ROS endógenas na pele de camundongos, baseada na administração de precursores do fotossensibilizador endógeno protoporfirina IX (PpIX; por exemplo, ácido aminolaevulínico ou seu derivado metílico metilaminolevulinato) e posterior irradiação da amostra com luz vermelha para induzir a formação in situ de ROS a partir de oxigênio molecular intracelular (Figura 1). Esse procedimento fotodinâmico pode ser eficientemente utilizado para estimular nichos de células-tronco residentes, ativando os programas regenerativos do tecido^19,20 e abrindo caminho para novas modalidades terapêuticas na medicina regenerativa da pele. Aqui, apresentamos uma descrição detalhada do protocolo, mostrando exemplos representativos de estimulação de nichos de células-tronco, medida como um aumento no número de células de retenção de marcação (LRCs) de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) a longo prazo na região do abaulamento do folículo piloso^19,21, e subsequente ativação de programas de regeneração (aceleração do crescimento do cabelo e processos de cicatrização de queimaduras) induzidos por produção não letal de ERO na pele da linhagem C57Bl6 de camundongos.

Protocolo

Todos os procedimentos de criação e experimentação de camundongos devem ser conduzidos em conformidade com a legislação local, nacional, internacional e diretrizes sobre experimentação animal.

1. Indução do crescimento de pelos, indução de queimaduras e identificação de LRCs de BrdU a longo prazo no epitélio da pele da cauda íntegra

NOTA: Utilizar camundongos C57BL/6 com 10 dias ou 7 semanas de idade, preferencialmente ninhadas, para os planejamentos experimentais descritos abaixo. Em todos os procedimentos experimentais, os animais serão anestesiados por inalação de isoflurano a 3% ou eutanasiados por luxação cervical conforme indicado.

1. Indução do crescimento de pelos na pele posterior de camundongos na segunda fase telógena (repouso) (cerca de 50 dias pós-natal)
   1. Anestesiar camundongos com inalação de isoflurano a 3%. Confirme a anestesia profunda completa pela falta de um reflexo pedal (pinça firme do dedo do pé). Faça a barba de duas regiões independentes lado a lado da pele posterior em cada mouse usando cortadores de cabelo e creme depilatório (Tabela de Materiais). Use o lado esquerdo para o controle e o lado direito para o tratamento.
      NOTA: Verifique se, após o barbear, a pele subjacente do dorso está rósea e não acinzentada/preta, um indicador de melanogênese e entrada na fase anágena (crescente) nesta cepa de camundongo.
   2. Lavar cuidadosamente com PBS para remover todos os restos de creme e proceder à indução da produção transitória in situ de níveis não letais de ROS, conforme descrito na secção 2.1.
   3. Registre o crescimento do folículo piloso através da aquisição diária de imagens de alta resolução das áreas de controle e da pele das costas tratadas em cada animal (por exemplo, usando uma câmera HD acoplada a uma lente binocular de 5 a 20x).
2. Indução de lesões de queimadura de^2º grau na pele posterior de camundongos na segunda fase telógena (repouso) (cerca de 50 dias pós-natal)
   1. Anestesiar camundongos. Faça a barba em toda a região da pele das costas em cada rato usando cortadores de cabelo e creme depilatório e lave bem com PBS para remover todos os restos de creme.
      OBS: Administrar injeções subcutâneas in situ de lidocaína a 0,5% (2 mg/ml) em soro fisiológico estéril, não excedendo 7 mg/ml, imediatamente antes do procedimento de queimadura.
   2. Pré-aqueça uma barra de latão (1 cm em secção transversal) a 95 °C imergindo em água fervente e, em seguida, aplique na região central da superfície dorsal da pele dorsal de cada rato durante 5 s.
   3. Logo após a geração da queimadura, injetar intraperitonealmente os animais com 1 mL de solução fisiológica (NaCl a 0,9%) em manta elétrica para evitar a desidratação. Deixar que os animais se recuperem durante 24 h e proceder à indução da produção transitória in situ de níveis não letais de ROS, conforme descrito no ponto 2.3.
   4. Registre a progressão da ferida por queimadura por meio da aquisição diária de imagens de alta resolução das áreas de pele das costas controladas e tratadas em cada animal (por exemplo, usando uma câmera HD acoplada a uma lente binocular de 5 a 20 vezes).
3. Geração e identificação de LRCs de BrdU de longa duração no epitélio cutâneo da cauda
   1. Injetar ninhadas de 10/14 dias por via intraperitoneal (sem anestesia) uma vez por dia durante 4 dias consecutivos com 50 mg/kg de peso corporal BrdU dissolvido em PBS. Após a fase de marcação, permita que os ratos cresçam durante 50 a 60 dias antes de qualquer tratamento.
      NOTA: Use uma agulha nova para cada injeção.
   2. Proceder como descrito na secção 2.3 para a indução da produção transitória de ROS não letais in situ na pele da cauda em diferentes momentos antes da preparação de montagens inteiras de tecido.
   3. Para preparar montagens inteiras da epiderme da cauda, eutanasie camundongos por deslocamento cervical e prenda a cauda com tesoura cirúrgica.
      1. Use um bisturi para fazer uma incisão longitudinal reta ao longo de toda a cauda e descasque toda a pele como uma única peça da espinha dorsal. Incubar a pele descascada em EDTA 5 mM em PBS em tubos de 5 mL por 4 h a 37 °C e separar cuidadosamente as folhas intactas da epiderme da derme usando pinças.
      2. Fixar o tecido em formaldeído a 4% em PBS por pelo menos 72 h à temperatura ambiente (TR) e proceder à detecção de BrdU usando anticorpos apropriados.
      3. Utilizar fluorescência/microscopia confocal para identificar e quantificar LRCs em cada condição experimental, incluindo controles de luz e tratamentos fotodinâmicos em diferentes momentos antes da preparação dos tecidos inteiros, como descrito anteriormente em detalhes^19,20.
         NOTA: As folhas epidérmicas fixas podem ser armazenadas em PBS contendo azida sódica a 0,02% a 4 °C por até três meses. Lâminas epidérmicas fixas podem ser usadas para imunolocalização das proteínas necessárias seguindo procedimentos de cortes histológicos padrão.

2. Indução da produção transitória de níveis não letais de ROS na pele de camundongos

OBS: Para induzir a produção transitória de níveis não letais de ROS na pele de camundongos, será utilizado um tratamento fotodinâmico utilizando um precursor do fotossensibilizador endógeno PpIX, no caso, metil-aminolevulinato (mALA), e luz vermelha.

1. Para activar a produção transitória de ROS para a indução do crescimento de pelos na pele posterior, prepare os animais conforme indicado no ponto 1.1.
   1. Aplicar ~25 mg de mALA na forma de creme tópico (Tabela de Materiais) na região direita, mantendo o lado esquerdo como controle interno evitando diferenças interindividuais. Incubar por 2,5 h no escuro, lavar bem o excesso de creme com PBS. Para confirmar a profundidade da anestesia, monitorar os animais a cada 10 minutos até a recuperação total.
      NOTA: A produção de PpIX na pele posterior deve ser testada in situ pela sua fluorescência vermelha sob excitação de luz azul (407 nm).
   2. Anestesiar os animais.
   3. Irradiar toda a pele do dorso com uma fonte de luz vermelha adequada (Tabela de Materiais) para uma dose total de 2,5−4 J/^cm2. Manter os ratinhos numa manta eléctrica até à sua recuperação completa e proceder como descrito no passo 1.1.3.
      NOTA: A irradiância deve ser ajustada manipulando-se a distância entre a fonte de luz e o tecido e medida usando um medidor de energia de potência (Tabela de Materiais). O experimento é considerado terminado quando o crescimento total de pelos é observado em qualquer uma das regiões independentes raspadas de cada animal. Todo o procedimento envolve apenas um único tratamento fotográfico.
2. Para ativar a produção transitória de ROS para melhorar a cicatrização de lesões de queimadura de^2º grau, prepare os animais conforme indicado na seção 1.2.
   1. Aplicar ~25 mg de mALA na forma de creme tópico em toda a superfície queimada, abrangendo cerca de 4 mm de tecido adjacente. Incubar por 2,5 h no escuro, lavar bem o excesso de creme com PBS. Para confirmar a profundidade da anestesia, monitorar os animais a cada 10 minutos até a recuperação total.
   2. Anestesiar os animais.
   3. Irradiar toda a pele do dorso com uma fonte de luz vermelha adequada para uma dose total de 2,5−4 J/^cm2. Manter os ratinhos sobre uma manta eléctrica até à sua recuperação completa e proceder como descrito no passo 1.2.4.
      OBS: O procedimento experimental para cada animal é considerado concluído quando se observa a cicatrização completa da queimadura. Todo o procedimento envolve apenas um único tratamento fotográfico.
3. Para ativar a produção transitória de ROS na pele da cauda, prepare ratinhos conforme indicado na secção 1.3, aplique ~25 mg de mALA sob a forma de creme tópico ao longo de toda a área do tecido dorsal e proceda como descrito na secção 2.1 para a pele posterior. Realizar tratamentos fotográficos e controles de luz correspondentes 24 h, 48 h ou 72 h antes da eutanásia do animal e posterior extração de montagens inteiras da pele da cauda.
   NOTA: Em todos os delineamentos experimentais, testar a dependência de ROS do processo usando removedores de ROS antioxidantes (por exemplo, inoculação diária de 100 mg/kg de peso corporal de N-acetil-cisteína por injeção intraperitoneal de uma solução de 20 mg/mL em PBS, pH 7,2, começando 5 dias antes dos tratamentos com mALA ou, alternativamente, duas doses de 100 mg/mL de ácido ascórbico em etanol a 50%, espaçado 30 min, aplicado topicamente sobre a pele no intervalo de tempo entre os tratamentos com mALA e a irradiação com luz vermelha).

3. Detecção de ERO na pele

1. Avaliação ex vivo da produção de ERO na pele da cauda após tratamento fotodinâmico com hidroetidina
   NOTA: A hidroetidina é uma molécula não fluorescente que reage especificamente com ROS para produzir o corante fluorescente 2-hidroxietídio (hET).
   1. Incubar peles inteiras da cauda, obtidas como descrito no ponto 1.3.3, durante 3 h a 37 °C em EDTA 5 mM em solução PBS (amostras de controlo) ou adicionalmente contendo 2 mM mALA (amostras de tratamento fotodinâmico).
   2. Em todos os casos, adicionar hidroetidina a uma concentração final de 3,2 μM a partir de um estoque de 25 mg/mL em dimetilsulfóxido (DMSO) e incubar por 1 h no escuro em TR.
   3. Esticar as amostras de pele da cauda sobre uma superfície de vidro usando as pontas dos dedos e irradiar com luz vermelha de 636 nm a uma fluência de 10 J/cm² .
   4. Proceder imediatamente à separação da epiderme da derme e à fixação das lâminas epidérmicas conforme descrito no ponto 1.3.3.
   5. Avalie a emissão vermelha de hET sob um microscópio de fluorescência/confocal usando luz verde excitante, capture imagens de alta qualidade e prossiga com análises adicionais.
      NOTA: Usar a coloração hET de amostras de tecido na ausência de tratamento fotodinâmico como um controle negativo para a auto-oxidação de hET.
2. Detecção in vivo da produção de ERO na pele posterior após indução do crescimento do cabelo e cicatrização de queimaduras seguida de tratamento fotodinâmico
   NOTA: Esta etapa é realizada usando diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DHF-DA), um composto não fluorescente persignificado celular que, após clivagem por enzimas esterases intracelulares, reage especificamente com ROS dando o corante fluorescente 2′,7′-diclorofluoresceína (DCF).
   1. Utilizar animais preparados para a indução do crescimento de pelos (secção 1.1) ou para a cicatrização de queimaduras (secção 1.2). Imediatamente antes dos tratamentos tópicos com creme de mALA (ver secções 2.1 e 2.2), dispense topicamente 100 μL de 1 mg/ml em etanol a 50% de DHF-DA em todas as áreas de pele alvo de controlo/tratadas, deixe a pele absorver totalmente o material e prossiga com a aplicação tópica de creme de mALA.
   2. Incubar os animais tratados durante 4 h no escuro, lavar bem o creme mALA tópico da pele com PBS e dispensar uma segunda dose de 100 μL de solução de DHF-DA na pele. Para confirmar a profundidade da anestesia, monitorar os animais a cada 10 minutos até a recuperação total.
   3. Incubar os animais tratados por 50 min no escuro, anestesiar e irradiar toda a pele do dorso com uma fluência variando de 2,5 a 4 J/^cm2 de luz vermelha de 636 nm usando uma lâmpada LED.
   4. Imediatamente após a irradiação, avaliar os níveis de ROS gerados na pele usando um sistema de imagem in vivo (Tabela de Materiais). Ajuste a caixa de filtro para excitação de 445−490 nm e emissão de 515−575 nm, capture imagens de alta qualidade e prossiga com análises adicionais.
      NOTA: Utilizar a coloração DHF-DA de amostras de tecido na ausência de tratamento fotodinâmico como controle negativo para a auto-oxidação de DHF-DA.

Resultados

A administração tópica do precursor mALA na pele do dorso e da cauda de camundongos resulta em acúmulo significativo de PpIX em todo o tecido e, visivelmente, no folículo piloso, como demonstrado pela fluorescência vermelho-rósea desse composto sob excitação à luz azul (407 nm) (Figura 2A,C). A irradiação subsequente do tecido tratado com luz vermelha (636 nm) a uma fluência de 2,5−4 J/^cm2 promove a produção transitória de ERO no tecido, particul...

Discussão

Aqui, apresentamos uma metodologia que permite uma ativação transitória da produção endógena de ERO in vivo em pele de camundongo com efeitos fisiológicos. A metodologia baseia-se em um procedimento fotodinâmico para induzir uma estimulação local e controlada do fotossensibilizador endógeno PpIX (Figura 1B). Esta abordagem experimental é uma ferramenta interessante para estudar a biologia de ROS em sistemas experimentais in vivo, constituindo um avanço significativo sobre metodo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate	Sigma Aldrich	D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridine	Sigma Aldrich	B5002-500MG
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein	Roche	11202693001
Depilatory cream (e.g., Veet)	Veet
Dihydroethidium	Sigma Aldrich	37291-25MG
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2	Perkin Elmer
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g	Galderma
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D)	ThorLabs
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp	Photocure ASA