Stimulation de niches de cellules souches et régénération tissulaire dans la peau de souris par photogénération commutable d’espèces réactives de l’oxygène dépendantes de la protoporphyrine IX in situ

Résumé

L’objectif de ce protocole est d’induire une production transitoire in vivo de niveaux non létaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans la peau de souris, favorisant ainsi les réponses physiologiques dans les tissus.

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole pour induire une photogénération in vivo commutable d’espèces réactives endogènes de l’oxygène (ROS) dans la peau de souris. Cette production transitoire de ROS in situ active efficacement la prolifération cellulaire dans les niches de cellules souches et stimule la régénération tissulaire comme en témoigne fortement l’accélération des processus de cicatrisation des brûlures et de croissance des follicules pileux. Le protocole est basé sur un traitement photodynamique réglable qui traite le tissu avec des précurseurs de la protoporphyrine IX photosensibilisante endogène et irradie davantage le tissu avec de la lumière rouge sous des paramètres physico-chimiques étroitement contrôlés. Dans l’ensemble, ce protocole constitue un outil expérimental intéressant pour analyser la biologie ROS.

Introduction

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont le résultat de la réduction chimique de l’oxygène moléculaire pour former de l’eau et comprennent l’oxygène singulet, l’anion superoxyde, le peroxyde d’hydrogène et le radical hydroxyle ^1,2,3. Les ROS ont une durée de vie très courte en raison de leur nature extrêmement réactive chimique. Dans les organismes aérobies, les ROS sont fortuitement formés à l’intérieur des cellules en tant que sous-produit perméable majeur de la respiration aérobie (chaîne de transport d’électrons) dans les mitochondries. L’accumulation transitoire de niveaux élevés de ROS dans la cellule entraîne une condition de stress oxydatif qui peut provoquer l’inactivation irréversible des protéines, des lipides et des sucres et l’introduction de mutations dans la molécule d’ADN 2,3,4,5. L’accumulation progressive de dommages oxydatifs dans les cellules, les tissus et les organismes entiers augmente régulièrement avec le temps et a été associée à l’induction de programmes de mort cellulaire, à plusieurs pathologies et au processus de vieillissement 2,3,4,6.

Les organismes aérobies ont régulièrement développé des mécanismes moléculaires efficaces pour lutter contre l’accumulation excessive de ROS dans les cellules et les tissus. Ces mécanismes comprennent des membres de la famille des protéines superoxyde dismutase (SOD), qui catalysent la dismutation radicalaire superoxyde en oxygène moléculaire et en peroxyde d’hydrogène, ainsi que différentes catalases et peroxydases qui utilisent le pool antioxydant (glutathion, NADPH, peroxyrédoxine, thiorédoxine ^7,8) pour catalyser la conversion ultérieure du peroxyde d’hydrogène en eau et en oxygène moléculaire.

Cependant, plusieurs rapports soutiennent le rôle des ROS en tant que composants clés des circuits moléculaires qui régulent les fonctions cellulaires critiques, y compris la prolifération, la différenciation et la mobilité ^2,3,4. Ce concept est également soutenu par l’identification initiale et la caractérisation de mécanismes dédiés à la production de ROS dans les organismes aérobies, y compris les lipoxygénases cyclooxygénases et les NADPH oxydases ^9,10. En ce sens, les ROS jouent un rôle actif dans le développement des embryons de vertébrés 11,12,13 et des rôles clés pour ces molécules dans la régulation de fonctions physiologiques in vivo spécifiques ont été rapportés dans différents systèmes expérimentaux, y compris le programme de différenciation des progéniteurs hématopoïétiques chez Drosophila^14, l’induction de guérison chez le poisson zèbre ou la régénération de la queue chez les têtards Xenopus ¹⁵. Chez les mammifères, les ROS ont été impliqués dans le potentiel d’auto-renouvellement / différenciation des cellules souches neurales dans un modèle de neurosphère¹⁶ et dans la dérégulation de la fonction des cellules souches intestinales lors de l’initiation du cancer colorectal¹⁷. Dans la peau, la signalisation ROS a été associée à la différenciation épidermique et à la régulation de la niche des cellules souches cutanées et du cycle de croissance du follicule pileux^18,19.

Dans cette perspective, une limitation expérimentale majeure pour déterminer les rôles physiologiques des ROS dans les systèmes biologiques, à la fois dans des conditions normales ou pathologiques, est le manque d’outils expérimentaux adéquats pour induire une production contrôlée de ces molécules dans les cellules et les tissus, ressemblant précisément à leur production physiologique en tant que seconds messagers de signalisation. À l’heure actuelle, la plupart des approches expérimentales impliquent l’administration de ROS exogènes, principalement sous forme de peroxyde d’hydrogène. Nous avons récemment mis en œuvre une approche expérimentale pour activer une production in vivo transitoire et non létale de ROS endogènes dans la peau de souris, basée sur l’administration de précurseurs de la protoporphyrine IX photosensibilisante endogène (PpIX; par exemple, l’acide aminolaevulinique ou son dérivé méthylique méthylaminolévulinate) et une irradiation supplémentaire de l’échantillon avec de la lumière rouge pour induire la formation in situ de ROS à partir d’oxygène moléculaire intracellulaire (Figure 1). Cette procédure photodynamique peut être utilisée efficacement pour stimuler les niches de cellules souches résidentes, activant ainsi les programmes de régénération du tissu^19,20 et ouvrant la voie à de nouvelles modalités thérapeutiques en médecine régénérative de la peau. Ici, nous présentons une description détaillée du protocole, montrant des exemples représentatifs de stimulation des niches de cellules souches, mesurée comme une augmentation du nombre de cellules retenant marquées à long terme de la 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) dans la région du renflement du follicule pileux^19,21, et l’activation ultérieure des programmes de régénération (accélération de la croissance des cheveux et processus de guérison des brûlures) induite par transitoire^, production non létale de ROS dans la peau de la souche de souris C57Bl6.

Protocole

Toutes les procédures d’élevage et d’expérimentation de souris doivent être menées conformément à la législation locale, nationale et internationale et aux directives sur l’expérimentation animale.

1. Induction de la croissance des cheveux, induction de brûlures et identification des LRC BrdU à long terme dans l’épithélium de la peau de la queue

REMARQUE : Utilisez des souris C57BL/6 âgées de 10 ou 7 semaines, de préférence des compagnons de portée, pour les plans expérimentaux décrits ci-dessous. Dans toutes les procédures expérimentales, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane à 3% ou euthanasiés par luxation cervicale comme indiqué.

1. Induction de la croissance des poils dans la peau arrière des souris dans la deuxième phase télogène (repos) (environ 50e jour post-natal)
   1. Anesthésier les souris par inhalation d’isoflurane à 3%. Confirmer une anesthésie profonde complète par l’absence d’un réflexe de pédale (pincement ferme des orteils). Rasez deux régions indépendantes côte à côte de la peau du dos chez chaque souris à l’aide de tondeuses à cheveux et de crème dépilatoire (Tableau des matériaux). Utilisez le côté gauche pour le contrôle et le côté droit pour le traitement.
      NOTE: Vérifiez que, après le rasage, la peau sous-jacente du dos est rosâtre et non grise/noire, un indicateur de mélanogénèse et d’entrée dans la phase anagène (croissance) chez cette souche de souris.
   2. Laver soigneusement avec du PBS pour éliminer tous les restes de crème et procéder à l’induction de la production transitoire in situ de niveaux de ROS non létaux comme décrit à la rubrique 2.1.
   3. Enregistrez la croissance des follicules pileux grâce à l’acquisition quotidienne d’images haute résolution des zones de la peau du dos contrôlées et traitées chez chaque animal (p. ex., à l’aide d’une caméra HD couplée à une lentille binoculaire 5−20x).
2. Induction de lésions de brûlure au 2e^{degré dans} la peau arrière de souris dans la deuxième phase télogène (repos) (environ 50e jour post-natal)
   1. Anesthésier les souris. Rasez toute la région de la peau du dos chez chaque souris à l’aide de tondeuses à cheveux et de crème dépilatoire et lavez soigneusement avec du PBS pour éliminer tous les restes de crème.
      NOTE: Administrer in situ des injections sous-cutanées de lidocaïne à 0,5% (2 mg / ml) dans une solution saline stérile, ne dépassant pas 7 mg / ml, juste avant la procédure de combustion.
   2. Préchauffer une barre de laiton (1 cm de section) à 95 °C en l’immergeant dans de l’eau bouillante, puis appliquer sur la région centrale de la surface dorsale de la peau dorsale de chaque souris pendant 5 s.
   3. Juste après la génération de la brûlure, injecter par voie intrapéritonéale aux animaux 1 mL de solution physiologique (0,9% NaCl) sur une couverture électrique pour prévenir la déshydratation. Laisser les animaux récupérer pendant 24 h et procéder à l’induction d’une production transitoire in situ de niveaux de ROS non létaux comme décrit à la section 2.3.
   4. Enregistrer la progression de la brûlure grâce à l’acquisition quotidienne d’images haute résolution des zones de la peau du dos témoins et traitées chez chaque animal (p. ex., à l’aide d’une caméra HD couplée à une lentille binoculaire 5−20x).
3. Génération et identification de CRL BrdU à long terme dans l’épithélium cutané de la queue
   1. Injecter des compagnons de portée âgés de 10/14 jours par voie intrapéritonéale (sans anesthésie) une fois par jour pendant 4 jours consécutifs avec 50 mg/kg de poids corporel de BrdU dissous dans du PBS. Après la phase d’étiquetage, laisser les souris se développer pendant 50 à 60 jours avant tout traitement.
      REMARQUE: Utilisez une aiguille fraîche pour chaque injection.
   2. Procéder comme décrit à la rubrique 2.3 pour l’induction d’une production transitoire in situ non létale de ROS dans la peau de la queue à différents moments avant la préparation des tissus entiers.
   3. Pour préparer des montures entières d’épiderme de la queue, euthanasier les souris par luxation cervicale et couper les queues avec des ciseaux chirurgicaux.
      1. Utilisez un scalpel pour faire une incision longitudinale droite tout le long de la queue et pelez toute la peau en une seule pièce de la colonne vertébrale. Incuber la peau pelée dans 5 mM d’EDTA dans du PBS dans des tubes de 5 mL pendant 4 h à 37 °C et séparer soigneusement les feuilles intactes de l’épiderme du derme à l’aide de forceps.
      2. Fixer le tissu dans du formaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant au moins 72 h à température ambiante (RT) et procéder à la détection BrdU à l’aide d’anticorps appropriés.
      3. Utiliser la microscopie à fluorescence/confocale pour identifier et quantifier les CRL dans chaque condition expérimentale, y compris les contrôles de la lumière et les traitements photodynamiques à différents moments avant la préparation des tissus entiers, comme décrit précédemment en détail^19,20.
         REMARQUE : Les feuilles épidermiques fixes peuvent être conservées dans du PBS contenant 0,02 % d’azoture de sodium à 4 °C pendant une période maximale de trois mois. Des feuillets épidermiques fixes peuvent être utilisés pour l’immunolocalisation des protéines requises en suivant les procédures standard des coupes histologiques.

2. Induction de la production transitoire de niveaux de ROS non létaux dans la peau de souris

NOTE: Pour induire une production transitoire de niveaux de ROS non létaux dans la peau de souris, un traitement photodynamique utilisant un précurseur du photosensibilisateur endogène PpIX, dans ce cas, le méthyl-aminolévulinate (mALA), et la lumière rouge sera utilisé.

1. Pour activer la production transitoire de ROS en vue de l’induction de la croissance des poils dans la peau du dos, préparer les animaux comme indiqué à la section 1.1.
   1. Appliquer ~25 mg de mALA sous forme de crème topique (Tableau des matériaux) sur la région droite, en gardant le côté gauche comme contrôle interne en évitant les différences interindividuelles. Incuber pendant 2,5 h dans l’obscurité, laver soigneusement l’excès de crème avec du PBS. Pour confirmer la profondeur de l’anesthésie, surveillez les animaux toutes les 10 minutes jusqu’à ce qu’ils soient complètement rétablis.
      NOTE: La production de PpIX dans la peau du dos doit être testée in situ par sa fluorescence rouge sous excitation de lumière bleue (407 nm).
   2. Anesthésiez les animaux.
   3. Irradier toute la peau du dos avec une source de lumière rouge adéquate (tableau des matériaux) pour une dose totale de 2,5−4 J/^cm2. Gardez les souris sur une couverture chauffante jusqu’à leur rétablissement complet et procédez comme décrit à l’étape 1.1.3.
      REMARQUE : L’éclairement énergétique doit être ajusté en manipulant la distance entre la source lumineuse et le tissu et mesuré à l’aide d’un compteur d’énergie de puissance (Tableau des matériaux). L’expérience est considérée comme terminée lorsque la croissance complète des poils est observée dans l’une des régions rasées indépendantes de chaque animal. L’ensemble de la procédure implique un seul traitement photo.
2. Pour activer la production transitoire de ROS pour améliorer la cicatrisation des lésions de brûlure au 2e^degré , préparer les animaux comme indiqué à la rubrique 1.2.
   1. Appliquer ~25 mg de mALA sous forme de crème topique tout le long de la surface brûlée, englobant environ 4 mm de tissu adjacent. Incuber pendant 2,5 h dans l’obscurité, laver soigneusement l’excès de crème avec du PBS. Pour confirmer la profondeur de l’anesthésie, surveillez les animaux toutes les 10 minutes jusqu’à ce qu’ils soient complètement rétablis.
   2. Anesthésiez les animaux.
   3. Irradier toute la peau du dos avec une source de lumière rouge adéquate pour une dose totale de 2,5−4 J/^cm2. Gardez les souris sur une couverture chauffante jusqu’à leur rétablissement complet et procédez comme décrit à l’étape 1.2.4.
      NOTE: La procédure expérimentale pour chaque animal est considérée comme terminée lorsque la guérison complète des brûlures est observée. L’ensemble de la procédure implique un seul traitement photo.
3. Pour activer la production transitoire de ROS dans la peau de la queue, préparer les souris comme indiqué à la rubrique 1.3, appliquer ~25 mg de mALA sous forme de crème topique tout au long de la zone du tissu dorsal et procéder comme décrit à la rubrique 2.1 pour la peau du dos. Effectuer des traitements photographiques et des contrôles de la lumière correspondante 24 h, 48 h ou 72 h avant l’euthanasie des animaux et l’extraction ultérieure des montures entières de peau de queue.
   REMARQUE : Dans tous les modèles expérimentaux, doser la dépendance aux ROS du procédé à l’aide de piégeurs de ROS antioxydants (p. ex., inoculation quotidienne de 100 mg/kg de poids corporel de N-acétyl-cystéine par injection intrapéritonéale d’une solution à 20 mg/mL dans du PBS, pH 7,2, en commençant 5 jours avant les traitements mALA ou, alternativement, deux doses de 100 mg/mL d’acide ascorbique dans de l’éthanol à 50 %, espacé de 30 min, appliqué localement sur la peau dans l’intervalle de temps entre les traitements mALA et l’irradiation à la lumière rouge).

3. Détection des ROS dans la peau

1. Évaluation ex vivo de la production de ROS dans la peau de la queue après traitement photodynamique à l’hydroéthidine
   REMARQUE: L’hydroéthidine est une molécule non fluorescente qui réagit spécifiquement avec les ROS pour produire un colorant fluorescent 2-hydroxyéthidium (hET).
   1. Incuber des peaux entières de queue, obtenues comme décrit à la section 1.3.3, pendant 3 h à 37 °C dans 5 mM d’EDTA dans une solution de PBS (échantillons témoins) ou contenant en outre 2 mM de mALA (échantillons de traitement photodynamique).
   2. Dans tous les cas, ajouter de l’hydroéthidine à une concentration finale de 3,2 μM à partir d’un stock de 25 mg/mL dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) et incuber pendant 1 h dans l’obscurité à TA.
   3. Étirer les échantillons de peau de la queue sur une surface en verre du bout des doigts et irradier avec une lumière rouge de 636 nm à une fluence de 10 J/cm² .
   4. Procéder immédiatement à la séparation de l’épiderme du derme et fixer les feuillets épidermiques comme décrit à la rubrique 1.3.3.
   5. Évaluez l’émission de rouge hET sous un microscope à fluorescence/confocale à l’aide d’une lumière verte excitante, capturez des images de haute qualité et procédez à une analyse plus approfondie.
      REMARQUE : Utiliser la coloration hET des échantillons de tissus en l’absence de traitement photodynamique comme témoin négatif de l’oxydation hET.
2. Détection in vivo de la production de ROS dans la peau arrière après induction de la croissance des cheveux et cicatrisation des brûlures suivie d’un traitement photodynamique
   REMARQUE: Cette étape est réalisée à l’aide de diacétate de 2′,7′-dichlorodihydrofluorescéine (DHF-DA), un composé non fluorescent perméable de cellules qui, après clivage par des enzymes estérases intracellulaires, réagit spécifiquement avec ROS en donnant le colorant fluorescent 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCF).
   1. Utiliser des animaux préparés pour l’induction de la croissance des poils (section 1.1) ou la cicatrisation des brûlures (section 1.2). Juste avant les traitements topiques à la crème mALA (voir rubriques 2.1 et 2.2), distribuer par voie topique 100 μL de 1 mg/mL dans de l’éthanol à 50 % de DHF-DA sur toutes les zones cutanées cibles/traitées, laisser la peau absorber complètement le matériau et procéder à l’application topique de crème mALA.
   2. Incuber les animaux traités pendant 4 h dans l’obscurité, laver soigneusement la crème topique mALA de la peau avec du PBS et distribuer une deuxième dose de 100 μL de solution de DHF-DA sur la peau. Pour confirmer la profondeur de l’anesthésie, surveillez les animaux toutes les 10 minutes jusqu’à ce qu’ils soient complètement rétablis.
   3. Incuber les animaux traités pendant 50 min dans l’obscurité, anesthésier et irradier toute la peau du dos avec une fluence allant de 2,5 à 4 J/^cm2 de lumière rouge 636 nm à l’aide d’une lampe LED.
   4. Immédiatement après l’irradiation, évaluer les niveaux de ROS générés dans la peau à l’aide d’un système d’imagerie in vivo (Tableau des matériaux). Réglez le boîtier de filtre pour une excitation de 445 à 490 nm et une émission de 515 à 575 nm, capturez des images de haute qualité et procédez à une analyse plus approfondie.
      REMARQUE : Utiliser la coloration DHF-DA des échantillons de tissus en l’absence de traitement photodynamique comme témoin négatif pour l’auto-oxydation DHF-DA.

Résultats

L’administration topique du précurseur mALA dans le dos et la peau de la queue de souris entraîne une accumulation significative de PpIX dans l’ensemble du tissu et, en particulier, dans le follicule pileux, comme le démontre la fluorescence rose rougeâtre de ce composé sous excitation en lumière bleue (407 nm) (Figure 2A,C). L’irradiation ultérieure du tissu traité avec une lumière rouge (636 nm) à une fluence de 2,5−4 J/^cm2 favorise la producti...

Discussion

Ici, nous présentons une méthodologie qui permet une activation transitoire de la production endogène de ROS in vivo dans la peau de souris avec des effets physiologiques. La méthodologie est basée sur une procédure photodynamique pour induire une stimulation contrôlée et locale du photosensibilisateur endogène PpIX (Figure 1B). Cette approche expérimentale est un outil intéressant pour étudier la biologie des ROS dans des systèmes expérimentaux in vivo constituant une avancée...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate	Sigma Aldrich	D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridine	Sigma Aldrich	B5002-500MG
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein	Roche	11202693001
Depilatory cream (e.g., Veet)	Veet
Dihydroethidium	Sigma Aldrich	37291-25MG
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2	Perkin Elmer
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g	Galderma
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D)	ThorLabs
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp	Photocure ASA