קיימות משופרת עבור תרבויות הידרוג'ל 3D Ex vivo של Xenografts נגזר המטופל בפלטפורמה מיקרופלויד perfused

Summary

פרוטוקול זה מדגים שיטות המאפשרות הרחבה בתרבות המבחנה של xenografts נגזר המטופל (PDX). צעד אחד משפר את הכדאיות הכוללת של תרבויות אשכול רב-תאי בהידרוג'לים תלת-מימדיים, באמצעות הסרה פשוטה של תאים בודדים שאינם ברי קיימא. שלב משני מדגים שיטות עבודה מומלצות לתרבות PDX בפלטפורמה מיקרו-נוזלית מנווטה.

Abstract

קסנוגרפטים נגזר החולה (PDX), שנוצר כאשר רקמת הגידול המטופל נותח הוא חרט ישירות לתוך עכברים חיסוניים, להישאר יציב ביולוגית, ובכך שמירה על מולקולרי, גנטי, ותכונות היסטולוגיות, כמו גם הטרוגניות של הגידול המקורי. עם זאת, שימוש במודלים אלה כדי לבצע מספר רב של ניסויים, כולל סינון סמים, הוא אסור הן מבחינת עלות וזמן. מערכות תרבות תלת מימדיות (תלת-ממדיות) נתפסות באופן נרחב כפלטפורמות שבהן תאים סרטניים שומרים על שלמותם הביולוגית באמצעות אינטראקציות ביוכימיות, מורפולוגיה וארכיטקטורה. לצוות שלנו ניסיון רב בהתאגיד תאי PDX במבחנה באמצעות מטריצות תלת-מימד המורכבות מחומצה היאלורונית (HA). על מנת להפריד את תאי סטרומה פיברובלסט העכבר הקשורים PDXs, אנו משתמשים בתרבות סיבוב, שבו תאים סטרומה לדבוק על פני השטח של צלחות שטופלו בתרבות רקמות בעוד תאים סרטניים PDX נותק לצוף ולשייך עצמי לתוך אשכולות רב תאיים. גם צפים supernatant הם יחיד, לעתים קרובות תאים מתים, אשר מציגים אתגר באיסוף אשכולות PDX קיימא עבור אנקלוסציה במורד הזרם לתוך הידרוג'לים עבור תרבות תא 3D. על מנת להפריד תאים בודדים אלה מאשכולות תאים חיים, השתמשנו צנטריפוגציה הדרגתית צעד צפיפות. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר דלדול של תאים בודדים שאינם בר קיימא מהאוכלוסייה הבריאה של אשכולות תאים שישמשו לניסויים נוספים במבחנה. במחקרים שלנו, אנו משלבים את תרבויות 3D צלחות microfluidic המאפשרים עירוי מדיה במהלך התרבות. לאחר הערכת התרבויות הנובעות מכך באמצעות התבססות על הכדאיות המבוססת על תמונה פלורסנטית של תאים מטוהרים לעומת תאים לא מטוהרים, התוצאות שלנו מראות כי צעד הפרדה נוסף זה הפחית באופן משמעותי את מספר התאים שאינם מעשיים מהתרבויות שלנו.

Introduction

במהלך העשור האחרון, התחום של מחקר סרטן הפגין התלהבות מחודשת עבור xenografts נגזר החולה (PDXs) ככלי להערכת הסתמכות מסלול תא סרטני^{ורגישות לסמים 1}. מודלי PDX הנפוצים ביותר מבוססים על ידי השתלה תת עורית או אורתוטופית של תאים סרטניים אנושיים – שבר גידול, מקבץ של תאים נגזרים גידול תותק, או מדגם של תאים סרטניים מבודדים במחזור (CTCs)- לתוך מארח מכרסם. אם הגידול "לקחת" הוא מוצלח, תאי xenograft יהיה להתרבות, כלי דם, ואחרת אינטראקציה עם רקמת המארח כדי ליצור גידול, אשר ניתן לקצור בגודל אופטימלי, מחולק, מושתל מחדש לתוך מארחים אחרים. בין היתרונות הרבים שלהם כמערכת מודל, PDXs בדרך כלל לשמור על חלק ניכר של הטרוגניות של אוכלוסיית תאי הגידול הילידים ולאפשר את ההערכה של מסלולים ספציפיים לבני^{אדם ותגובות תא 2,,3}. בהקשר vivo מאפשר אינטראקציה גידול עם כלי דם סטרומה סמוכים אחרים ומאפייני רקמות recapitulates כגון דינמיקת דיפוזיה סמים, מתח חמצן, מטריצה חוץ תאית השפעה כי ביולוגית ומכאנית להשפיע על התקדמות הגידול. היבט שלילי של PDXs הוא ההסתמכות שלהם על מארח מכרסמים, הן להרחבת הגידול ובסופו של דבר לבדיקת השערה. מכיוון PDXs רבים לא יכול להסתגל לתרבות דו מימדית מסורתית (2D) על פוליסטירן תרבות רקמות מבלי לאבד רבים מהמאפיינים הרצויים שלהם, יש כבר קרקע ביניים מינימלית עבור חוקרים בין זה מבוקר יחסית בשיטת המבחנה, ואת העלייה המשמעותית בהוצאות, מתקנים, ודרישות זמן לשימוש vivo PDX.

תיארנו מספר מודלים במבחנה המיישמים תרבות תא 3D בתוך מטריצה תומכת, ולאחרונה הרחיבו את העבודה כדי להדגים את תרבות vivo לשעבר של סרטן הערמונית מרובים (PCa)נגזר PDXs, הן לבד והן בתרבות שיתופית עם פיברובלסטים נגזר מח^{עצם 4,5}. מטריצות הידרוג'ל מבוססות חומצה היאלורונית (HA) מספקות תמיכה הניתנת להתאמה אישית ורלוונטית ביולוגית לשני סוגי התאים, עם שליטה שנייה על מאפייני הידרוג'ל ובהירות אופטית להדמיה דרך עומק הידרוג'ל^6.

רקמות גידול PDX בוגרות מהוות תערובת משתנה של תאים סרטניים אנושיים הטרוגניים סטרומה העכבר (פיברובלסטים, תאים אנדותל, וכו '). כדי ללמוד את סוג התא תרומות ספציפיות להתקדמות הגידול במבחנה, זה יכול להיות יתרון לנתק גידולים, להפריד את אוכלוסיות התא, ובאופן ניסיוני לשלב אותם באופן מאורגן לנתח מסלולים של תקשורת בין תאית. אוכלוסיות תאים מעורבים בתוך עיכול רקמות יש תאימות דיפרנציאלית עם תנאי תרבות ספציפיים. לדוגמה, הכדאיות פיברובלסט הקשורים לגידול מחייבת דבקות פני השטח או מטריצות תלת-מידור פונקציונליות עם ליגנדים אינטגריים, בעוד תאי PDX נגזר אפיתל אין בדרך כלל דרישות אלה, במקום להעדיף אינטראקציות תא. הבדלים אלה ניתן לנצל כדי להשיג הפרדה יעילה של תאי PDX מתאי סטרומה עכבר מזהמים. תרבות סיבוב של עיכול רקמות מאפשרת דבקות תא סטרומה על פני השטח של תרבות הרקמה בעוד הדבקות תא כונן תאי PDX מרחפים מעל פני השטח של התרבות מסתובבת כדי ליצור אשכולות רב-תאיים supernatant ב 24-48 שעות. המאפיינים הספציפיים של אשכולות אלה משתנים בהתאם ל-PDX (לדוגמה, אשכולות גדולים, הדוקים, כדוריים מאוד או אגרגטים קטנים ורופפים יותר הדומים לאגמים של ענבים), אך הם בדרך כלל בגדלים רלוונטיים ביולוגית (קוטר 50-250 μm), מספיקים להערכת אינטראקציות תאיות המסתמכות על אנשי קשר בין-תאיים.

אחזור גידול ועיבוד באופן בלתי נמנע גורמת במידה מסוימת של מוות בתאים משניים, בין אם בשל נזק לטווח קצר של שיבוש מכני/אנזימטי, או אי-תאימות לטווח ארוך של תת-אוכלוסיות בתנאי התרבות הנבחרים. למרות התועלת של תרבות סיבוב כהפרדה בתפזורת ראשונית, תאים מתים או גוססים מועברים באופן בלתי נמנע עם אשכולות PDX יכול להשפיע על התרבות שנוצרה. תאים מתים אלה הם לעתים קרובות תאי PDX בודדים שלא שולבו באשכול, פיברובלסטים סטרומה עכבר שלא יכול לשרוד בתנאי תרבות נבחרים, או תאים אנדותל שביר במיוחד. תאים גוססים כאלה יכולים להשפיע על תוצאות ניסיוניות של "ניצולים" ויכולים להשפיע באופן משמעותי על כימות, למשל, באמצעות בדיקות ההקרנה מבוססות התדמית של פלורסנט. כדי לשפר את הבחירה של תאי PDX חיים משיטה זו, התאמנו שיטות צנטריפוגציה עם שלבי צפיפות כדי להסיר בקלות תאים מתים/ גוססים בודדים מתערובות PDX ולשמור בעיקר אשכולות רב-תאיים חיים.

כדי לשפר את המחקר של אשכולות נגזר PDX תוצאות בתרבות 3D, השתמשנו בפלטפורמת תרבות פרייז'יה מבוססת מיקרו-נוזלים, OrganoPlate (איור 1), שהיא פלטפורמת איבר-על-שבב בתפוקה גבוהה המאפשרת תרבות בו-זמנית של עד 96 תרבויות בודדות, תלת-מית-מיוד, על בסיס צלחת מיקרוטיטר 384 באר(איור 1A)^7,,8. בצלחת מיקרו-נוזלת דו-מסלולית, שבב רקמה יחיד מחובר באמצעות שני ערוצים מיקרופלוידיק(איור 1B,ערוץ ג'ל: אדום, ערוץ זלב: כחול) המשתרעים על פני ארבע בארות ברציפות. שני הערוצים המיקרו-נוזלים מופרדים על ידי רכס פלסטיק קצר הנקרא Phaseguide המונע גלישה של ערוץ אחד לתוך ערוץ השכן הסמוך לו, ובו זמנית מאפשר ממשק ללא קרום בין תכולת הג'ל לערוץ^{הזבר 9}. מכיוון שתחתית הלוח המיקרוסקופי מורכבת מזכוכית ברמת מיקרוסקופ, ניתן לצפות בתרבויות בחלון התצפית דרך תחתית הצלחת עם מיקרוסקופ סטנדרטי או אוטומטי. התזתה מבוססת בצלחת microfluidic עם נדנדה לתכנות, באמצעות כוח המשיכה כדי להניע את המדיה דרך הערוצים microfluidic, בין בארות מאגר(איור 1C). זרימת העירוי-לחקות באופן הדוק יותר recapitulates microenvironment הגידול מאשר תרבות סטטית, המאפשר התאגדות של מתח גיזר והפצה משופרת של גזים וחומרים מזינים. היתרונות של שמירה על תרבות תאים סרטניים מנוון בצלחת microfluidic תוארו בעבר כתרביות סרטן השד חדורים הפגינו קיימות אופטימלית לעומת תרבות 3D סטטי של אותם תאים⁷.

הדו"ח הנוכחי מתאר שיטת צנטריפוגציה הדרגתית מותאמת של צפיפות לבידוד אשכולות PDX רב-תאיים חיים ומדגים את כלי הפעולה שלה בהקמת תרבויות PDX תלת-מימדיות בתוך לוחות מיקרו-נוזלים חד-תכליתיים. מכיוון שמספר גדל והולך של מעבדות מחקר מחפשות שיטות להקל על השימוש ב-PDX, אנו צופים כי הפרוטוקולים המוצגים כאן יהיו של תועלת מיידית.

Protocol

רקמת הגידול הושגה בהסכמת המטופל ועל פי פרוטוקול ועדת הביקורת המוסדית (IRB) שאושרה. Xenografts הושתלו, גדלו, ונקצרו על פי פרוטוקול מקובל לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC).

הערה: כל העבודה תבוצע בקבינט בטיחות ביולוגי סטרילי כדי לשמור על עקרות. יש לבצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.

1. הכנת חומרים לעיבוד PDX

1. מפסים Autoclave וידית אזמל או סכיני גילוח.
2. להפשיר תמיסת אנזים ניתור ב 4 מעלות צלזיוס בלילה או בטמפרטורת החדר באותו היום כמו ניתיקות רקמות.
   הערה: הפשרה ב- 37 °C אינה מומלצת, מכיוון שדרך זו יכולה להשבית אנזימי דיסוציאציה מסוימים.
3. להכין לפחות 100 מ"ל של תרבות PDX בינוני (תערובת הנשר שונה של Dulbecco בינוני-מינון F-12 [DMEM-F12] עם 100 U /mL פניצילין סטרפטומיצין ו 30% סרום בשר עוברי [FBS]), ולפחות 25 מ"ל של PDX עיבוד בינוני (DMEM-F12 עם 100 U /mL פניצילין סטרפטומיצין ללא FBS). לאחסן ב- 4 °C עד מוכן לשימוש.

2. דיסוציאציה PDX וטיהור ראשוני של רכיב סטרומה

1. לאסוף כלים autoclaved, מסנני תא μm μm (2-3), 60 מ"מ סביב רקמות תרבות מנות (2), 6-באר רקמה תרבות צלחות, סטרילי 50 מ"ל צנטריפוגות חרצות, ו תמיסת מלח סטרילית 1x פוספט buffered (PBS). תרבות חמה בינונית עד 37 °C ולאפשר פתרון אנזים דיסוציאציה להגיע לטמפרטורת החדר.
2. כאשר רקמת PDX הגיעה קוטר של 1.0-1.5 ס"מ במארח עכבר, להסיר בניתוח את הגידול מהעכבר על ידי אמצעים סטנדרטיים (למשל, תחת הרדמה מקובלת) ולאחסן על קרח בצינור 50 מ"ל עם מדיום תרבות PDX(איור 2A). לעבד את הרקמה מיד, באמצעות השלבים הבאים, כדי למקסם את הכדאיות של התא, רצוי בתוך 1-2 שעות לאחר הקציר.
3. להעביר רקמת גידול לצינור סטרילי 50 מ"ל שנשקל מראש. לשטוף 6x עם 30 מ"ל של PBS סטרילי כדי להסיר דם ומזהמים. להסיר נוזל רב ככל האפשר ולשקול את רקמת הגידול.
4. להעביר רקמת הגידול לצלחת תרבות רקמות עגולה 60 מ"מ וטחינה לתוך ~ 1 מ"מ^{3 חתיכות} באמצעות סכין גילוח סטרילי או אזמל.
5. להוסיף 5 מ"ל של PDX עיבוד בינוני לאסוף slurry גידול ולעבור צינור סטרילי חדש 50 מ"ל. לשטוף את צלחת התרבות עם עוד 5 מ"ל של PDX עיבוד בינוני, אז עם תמיסת אנזים דיסוציאציה (10 מ"ל / g גידול, לפחות 5 מ"ל), הוספת כל שטיפה צינור 50 מ"ל.
6. דגירה 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד עדין. מערבבים את הצינור בעדינות באמצע זמן הדגירה.
7. פיפטה למעלה ו למטה בעדינות עם פיפטה סרולוגית כדי לשבור גושים. לסנן תאים עם מסננת תא 70 μm ממוקם מעל צינור סטרילי חדש 50 מ"ל.
   הערה: ייתכן שיהיה צורך ביותר ממסננת אחת.
8. צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות לתאי גלולה. הסר supernatant וssuspend ב- 2-3 מ"ל של תרבות PDX בינוני. לספור תאים באמצעות מד המיוציטומטר או מונה תא אוטומטי.
9. השתמש בטבלה 1 כדי להעריך את המספר הנדרש של תאים המופקים מ- PDX התנתקות הדרושים להשגת צפיפות התא הרצויה לכל שבב.
   הערה: הערכים בטבלה 1 מיועדים להיות נקודת התחלה. הערכים בפועל ישתנו עקב קתיות רקמות / תאיות ואובדן תאים מהקפאה / התאוששות. גידולים PDX הם אנשים אפילו בתוך סוג סרטן נתון כך ערכים אלה יש להתאים אמפירי.
10. מתוך המספר המחושב בשלב 2.9, לוח 1-2 x^{10 6 תאים} ב 5 מ"ל של PDX תרבות בינוני לכל באר של צלחת תרבות רקמות 6-באר. דגירה (37°C, 5% CO₂, 95% לחות) ל-48 שעות עם טלטול עדין (50-55 סל"ד) לקידום היווצרות אשכול(איור 2B). לאחר הקמת האשכול, המשך לסעיף 3 עבור צנטריפוגציה.
11. Cryopreserve תאי PDX שאינם נמצאים שימוש מהניתיקה הראשונית ב- 50% FBS + 40% DMEM-F12 + 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) או מדיום הקפאה ראשי זמין מסחרית.
    הערה: תאי סטרומה עכבר Adherent ניתן גם לשחזר מפני השטח צלחת רקמה, אם תרצה, על ידי שטיפה קצרה עם תרבות בינונית והרחבה על ידי אמצעים סטנדרטיים.
12. לשימוש מאוחר יותר של תאים סרטניים PDX cryopreserved / סטרומה עכבר, להפשיר תאים באמבט מים 37 מעלות C במשך 2 דקות. ספירה וצלחת בצלחת תרבות רקמות 6-באר כמתואר בשלב 2.10 לפני שממשיך לסעיף 3. הגדל את מספר תאי PDX ב- ~ 20% כדי להתאים להפסדים קיימים מהקפאה.

3. הפרדת צנטריפוגציה מבוססת צנטריפוגציה הדרגתית של אשכולות הנגזרים מ- PDX מתאי יחיד

1. הכן 20 מ"ל של 100% תמיסת מעבר צבע צפיפות על ידי ערבוב יסודי של 18 מ"ל של תמיסת צנטריפוגציה הדרגתית בצפיפות עם 2 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת סטרילית של 10x הנקס (HBSS) בצינור חסין סטרילי של 50 מ"ל. הפוך 10 מ"ל לכל אחד של 20%, 30%, 40%, ו 55% פתרונות הדרגתיים בצפיפות על-ידי דילול פתרון זה של 100% עם HBSS סטרילי 1x ערבוב היטב.
   הערה: אמצעי אחסון אלה מספיקים עבור שני מעברי צבע של 15 מ"ל בהם ניתן להשתמש כדי להפריד כ- 15 x 10⁶ תאים כל אחד. אם הפרדת פחות מ- 15 x^{10 6} תאים, יש להשתמש מעבר הצבע השני כאיזון צנטריפוגציה.
2. הוסף 3 מ"ל של 55% תמיסת מעבר צבע צפיפות לתחתית צינור חסוני 15 מ"ל. מחזיק את הצינור בזווית, בעדינות רבה שכבה 3 מ"ל של 40% תמיסת הדרגתית צפיפות על גבי השכבה 55%, לאט מחלק את הנוזל על הצד הזוויתי של הצינור כדי למנוע ערבוב השכבות. חזור על הפעולה עם תמיסת מעבר הצבע בצפיפות של 30%.
3. אספו את הסופרנטנט של תרביות סיבוב PDX עם פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל, שטיפה בעדינות של משטח לוח. צנטריפוגה ב 200 x g עבור 2 דקות לתאי כדורי.
4. הסר supernatant ולתחות מחדש את גלולת התא ב 3 מ"ל של 20% צפיפות הדרגתית פתרון לפי מספר מעברי צבע הדרושים כדי להפריד את התאים. שכבה בזהירות 20% תמיסת מעבר צבע צפיפות עם תאים על החלק העליון של מעבר הצבע.s. אם משתמשים רק בצינור הדרגתי אחד לתאים, עלו על צינור מעבר הצבע של איזון עם פתרון הדרגתי בצפיפות של 20% ללא תאים.
5. מכסים את הצינורות ואת הצנטריפוגה צנטריפוגה רוטור דלי נדנדה במשך 30 דקות ב 4 ° C, 2,000 x g, ו 0 בלם.
6. לאחר צנטריפוגה, שברים יהיו גלויים(איור 2C). אסוף 2-3 מ"ל של שברים לתוך צינורות 15 מ"ל טריים. הוסף 3-4 אמצעי אחסון של HBSS סטרילי 1 לכל שבר והפוך לערבב ביסודיות.
7. צנטריפוגה ב 1,000 x g עבור 3 דקות לתאי כדורי. הסר supernatant וssuspend את גלולת התא ב 1-2 מ"ל של עיבוד PDX בינוני.
   הערה: אשכולות תאי PDX מעשיים נמצאים בדרך כלל בממשק פתרון הדרגתי בצפיפות של 40%-55%(איור 2D) עםתאים מתים/גוססים בודדים שמצטברים בממשק פתרון הדרגתי בצפיפות של 20%-40% עבור רוב ה- PDXs שנבדקו.
8. הסר aliquot קטן, מייצג (50-100 μL) עבור ניתוב מחדש עם אמצעי אחסון שווה של פתרון אנזים דיסוציאציה כדי להעריך את מספר התא בהשעיית התא מקובצים באשכולות. לספור תאים עם מד המיוציט או מונה תא אוטומטי.

4. הכנת הידרוג'ל וזרעת צלחת מיקרופלויד

1. לשחזר פתרונות הידרוג'ל HA (ת'יול שונה HA, HA-SH; thiol-תגובתי פוליאתילן גליקול diacrylate, PEGDA) על פי הוראות היצרן.
2. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להוסיף 50 μL של HBSS לכל הבארות בעמודות חלון תצפית (עמודה 3, 7, 11, 15, 19, 23) של צלחת מיקרו-נוזלים דו-מסלולית כדי לשמור על לחות תרבות ותנאי הדמיה אופטימליים.
3. לחשב את הנפח של מתלה תא מסעיף 3 הדרוש עבור 50 μL של הידרוג'ל בצפיפות התא הרצויה (כלומר, 5,000 תאים / μL). עבור זריעת צלחת מיקרופלוידית אחת, aliquot את הנפח המחושב לתוך כל 4 צינורות צנטריפוגה סטרילי 1.5 מ"ל.
   הערה: הידרוג'לים HA יש זמן קבוע gelation. להתאים את הנפח של פתרון ג'ל aliquots ליעילות המשתמש בחלוקת אם ג'לציה מוקדמת מתרחשת.
4. התאם את רמת ה-pH של פתרון HA-SH ל- 8.0 עם 1 N NaOH מיד לפני השימוש. לבצע gelation מבחן על ידי ערבוב 40 μL של HA-SH עם 10 μL של PEGDA וניטור gelation לאורך זמן. גלציה מתחילה בדרך כלל 5-8 דקות לאחר ערבוב HA-SH עם crosslinker PEGDA.
5. עלי 2 דקות (200 x גרם,טמפרטורת החדר) לתאי כדורי. הסר בזהירות את תאי supernatant וssuspend בנפח המתאים של HA-SH.
   הערה: הידרוג'ל הסופי הוא 4:1 HA-SH:PEGDA פתרון (על ידי אמצעי אחסון) כך תאים צריך להיות resuspend ב 40 μL של HA-SH עבור 50 μL נפח סופי.
6. להוסיף 10 μL של PEGDA ל aliquot אחד של תאים ב HA. מערבבים היטב והמתינו 1-3 דקות (בהתאם לזמן הג'לציה משלב 4.4) לפני זריעת הלוח המיקרו-נוזל.
   הערה: מתן אפשרות לתגובת הג'לציה של התחלה לפני זריעה עוזר למזער את התא התיישבות.
7. הדבק טיפ לחלק 1.5 אמצעי אחסון μL לערוץ אחד חוזר פיפטה לטעון עם תאים בתמיסת הידרוג'ל HA. זכור לשמור על aliquot הידרוג'ל מעורב היטב כדי להבטיח חלוקת תאים אפילו.
8. כדי לזרוע את הצלחת מיקרופלויד, ליישר קצה פיפטה ניצב לצלחת תוך הנחת בעדינות את הקצה במרכז חדירה ג'ל (עמודות 1, 5, 9, 13, 17, 21) כדי להבטיח מגע אך ללא לחץ בעת חלוקת תמיסת הידרוג'ל. עובד במהירות כדי למנוע התגבשות הידרוג'ל מוקדמת, לוותר 1.5 μL של תמיסת ג'ל לתוך כל לתוך כל צף ג'ל.
9. שימו לב למצב המילוי של הערוצים המיקרוסקופיים על-ידי צפייה מראש הצלחת, מתחתית הצלחת, או לפי מיקרוסקופ, והעריכו את הטעינה, באמצעות איור 3 כמדריך (טעינה מוצלחת באות 3A, הדרכה למיקום צנרת באות 3B, הטעינה שלא נענתה באות 3C, לא מלאה עד לסיום איור 3D, גלישה באות 3E). זהה את כל ההתאמות הדרושות בטכניקה שעשויות לשפר את הצלחת המילוי לסיבוב הבא של השבבים (עיין בדיון לקבלת עצות לפתרון בעיות).
10. חזור על שלבים 4.6-4.9 עם 3 aliquots הנותרים של תאים בפתרון HA. להפוך את הצלחת בעת הכנת aliquot הבא (~ 1 דקות).
    הערה: זמן ההמתנה של דקה אחת והיפוך של הלוח משפרים את התפלגות תלת-מית-מיוד של התאים על-ידי הפחתת התאים בעת התרחשות הג'לציה.
11. לאחר שכל השבבים מלאים, דגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עד להשלמת הג'לציה (כ-45 דקות).
12. באמצעות המדריך שסופק, ודא שנדנדת התבעבה מותקנת באינקובטור של תרבות התא עם הגדרות ההתברבות הנכונות (זווית של 14°, מרווחי זמן של 4 דקות).
13. הוסף 50 μL של תרבות PDX בינוני לכל החדרים הבינוניים (עמודות 2, 6, 10, 14, 18, 22) ולבדוק אם הערוצים התמלאו כראוי על ידי היפוך הלוח. הקש בעדינות על הצלחת על משטח כדי לעודד את הנוזל למלא את הערוצים המיקרו-נוזליים.
14. הוסף 50 μL של DMEM-F12 (10% FBS) עבור כל שקעים בינוניים (עמודה 4, 8, 12, 16, 20, 24). אם בועות אוויר לכודות בערוץ ההתבות, הסר על-ידי הקשה בעדינות על הלוח כנגד משטח.
15. באמצעות מיקרוסקופ וטופס פריסת צלחת(איור משלים 1),שיא מילוי שבב הצלחה. אל תכלול שבבים שלא מולאו כראוי משימוש ניסיוני נוסף.
16. מניחים את הצלחת על נדנדה מוטה הניתנת להטיה של 14° ומחזור של 4 דקות כדי להתחיל בהתחלה. החלף את אמצעי תרבות PDX כל 2 ימים (הראשון 50 μL ב פנימה, לאחר מכן 50 μL בשקע).

5. מכתם תאים, הדמיה, וכמת תמונה

1. להכין תמיסת אסא יכולת תא המכילה שלושה צבעי פלורסנט (Hoechst 33342, אתידיום הומודימר-1, calcein acetoxymethyl [AM]).
   1. הכן פתרונות מלאי של כל צבע כדלקמן: Hoechst 33342 ב 1.6 mM (1 מ"ג / מ"ל) במים deionized; calcein AM ב 4 mM ב DMSO anhydrous; אתידיום הומודימר-1 ב- 2 mM ב- DMSO/H₂O (1:4, v/v).
      הערה: הפתרונות של calcein AM ואתידיום הומודימר-1 מסופקים בערכה המצוין בטבלת החומרים.
   2. הכן פתרון עבודה יחיד ב- HBSS או במדיום ללא אדום פנול, המכיל את כל שלושת הצבעים. מטב את ריכוז העבודה הסופי עבור כל סוג תא ומטריצה, בטווחים של 1.6-8.0 μM עבור Hoechst 33342, 0.1-10 μM עבור calcein AM ו- 0.1-10 μM עבור אתידיום הומודימר-1.
2. הסר את אמצעי התרבות ולהחיל את פתרון צבע הכדאיות בעבודה על שבבים מיקרופלויד הרצוי (75 μL ב פנימה, 25 μL בשקע) ולהניא בחזרה על נדנדת זלב באינקובטור תרבות התא במשך 1 שעות.
3. תמונה חלונות התצפית של תרבויות מוכתמות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ידני או אוטומטי(טבלתחומרים) עם מסנני פלורסנט (המפורטים כאורכי גל של העירור/פליטה, ב nm) כדי לצפות בכל הגרעין (Hoechst 33342, 350/461), גרעין תא מת (אתידיום הומודימר-1, 528/617), וציטופלסמה תא חי (calcein AM, 494/517).
4. ללכוד 140 μm Z-stacks עם גודל שלב של ≤1 μm באמצעות יעד אוויר 20x. שלושה שדות תצוגה נדרשים כדי למצוא את כל המיקרו-ערוץ עם כמות קטנה של חפיפה. כדי להימנע מדגום כפול, תמונה היא רק שני שדות תצוגה לכל שבב.
   הערה: יש למטב את תנאי ההדמיה כדי להבטיח דגימה נכונה של NyQuist. מניסיון המחברים, מערכת הדמיה מהירה, המבוססת על דה-פרוולציה של מקור אפינפרו-פלורסנצנטי קונבנציונלי או מצב סריקת תהודה על confocal, יש צורך באופן מלא assay A-stack שלם, עם שלושה צבעי לייזר, על פני 96 שבבים על צלחת בתוך פרק זמן סביר (בערך 3.5 h עם הדמיה אוטומטית, כולל התקנה).
5. באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, אמור את תמונות Z-stack עבור הנתונים המיומתים הרצויים, כגון מורפולוגיה, מצב צבירה או תכונות אחרות. כדי לכמת את הכדאיות של התא, ספרו את מספר התאים המתים (אדום) ואת גרעין התא הכולל (כחול).

תוצאות

נדנדת זלבנית ניתנת לתכנות הוכנה באינקובטור סטנדרטי של תרבות תא עם שתי נתיבים, וצלחות מיקרו-נוזליות דו-מסלוליות הוכנו בארונות אבטחה ביולוגית סטנדרטייםלהעמסה (איור 1). גידול PDX MDA-PCA-118b הורחב vivo, נקטף כאשר הגיע לגודל מרבי, נותקו כמתואר בפרוטוקול סעיף 2 כדי ליצור השעיה slurry של תאי...

Discussion

כאן אנו מתארים שיטה לעיבוד ולתחכות תאים סרטניים הנגזרים מ-PDX בתפוקה גבוהה, מערכת תרבות תלת-מית-מיומת. בעוד פרוטוקול זה מנצל רקמת PCa PDX, זה יעיל באותה מידה עבור גידולים אחרים נגזר אפיתל. מאפייני הגידול משתנים בין קווי PDX בודדים גם בתוך אותה רקמה של מקור (ערמונית, שד, וכו '). קווי PDX מסוימים PCa הם פי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1N NaOH			any suitable tissue culture grade
60 mm round tissue culture dishes			any suitable
6-well tissue culture plates			any suitable
70 µm cell strainers	Corning	431751	or equivalent
Centrifuge	Eppendorf	5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes	or equivalent
Density gradient centrifugation solution	Millipore Sigma	P1644	Percoll
Dimethylsulfoxide			any suitable tissue culture grade
Dissociation enzyme solution	StemCell Technologies	07921	ACCUMAX
DMEM-F12	ThermoFisher Scientific	11039021	or equivalent
Forceps			any suitable
HA hydrogel kit	ESI BIO	GS311	HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)
Hanks Balanced Salt Solution	Lonza	10-527F	or equivalent
Heat-inactivated fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B Hausser BrightLine	or equivalent
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H1398	or equivalent
Image processing software	Oxford Instruments	Imaris 9.3	or equivalent
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)	ThermoFisher Scientific	L3224	or equivalent
Microfluidic culture plate	Mimetas	9603-400-B	2-lane OrganoPlate
Microscope	Nikon	A1R	or equivalent
Multichannel pipette	Eppendorf	3125000036	or equivalent
PDX-derived tumor tissue			obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122	or equivalent
Perfusion rocker	Mimetas	OrganoPlate Perfusion Rocker Mini
pH strips (pH 5-9)			any suitable
Phosphate-buffered saline solution	Lonza	17-516F	or equivalent
Razor blades			any suitable
Rotating xy-shaker	VWR	Advanced 3500 Orbital Shaker	or equivalent
Scalpel handle			any suitable
Single channel repeating pipette	Eppendorf	22260201
Sterile, 15mL conical centrifuge tubes			any suitable
Sterile, 50mL conical centrifuge tubes			any suitable