在全融合微流体平台中增强患者衍生异种移植物的外体 3D 水凝胶培养物的生存能力

摘要

该协议演示了启用患者衍生异种移植 （PDX） 的扩展体外培养的方法。通过直接去除不可行的单细胞，一步提高三维水凝胶中多细胞聚类培养的整体生存能力。辅助步骤演示了在全融合微流体平台中 PDX 培养的最佳实践。

摘要

患者衍生的异种移植物（PDX），当被切除的患者肿瘤组织被直接移植到免疫功能低下的小鼠中时产生，在生物学上保持稳定，从而保留分子、遗传和组织学特征，以及原始肿瘤的异质性。然而，使用这些模型进行大量的实验，包括药物筛选，在成本和时间方面都是令人望而却步的。三维（3D）培养系统被广泛视为癌细胞通过生化相互作用、形态学和建筑保持其生物完整性的平台。我们的团队使用由透明质酸 （HA） 组成的 3D 基质在体外培养 PDX 细胞方面拥有丰富的经验。为了分离与PDX相关的小鼠成纤维细胞，我们使用旋转培养，其中频闪细胞粘附在组织培养治疗板的表面，而分离的PDX肿瘤细胞漂浮和自联成多细胞簇。也漂浮在上流液是单，往往是死细胞，这提出了一个挑战，收集可行的PDX集群下游封装到水凝胶的3D细胞培养。为了将这些单细胞与活细胞簇分离，我们采用了密度步进梯度离心。此处描述的协议允许将不可行的单细胞从细胞群的健康群体中耗尽，这些细胞群将用于进一步的体外实验。在我们的研究中，我们将 3D 培养物融入微流体板中，从而在培养过程中进行介质灌注。在使用纯化细胞与非纯化细胞的荧光图像可行性测定评估结果培养物后，我们的结果表明，这一额外的分离步骤大大减少了来自我们培养物的非活细胞的数量。

引言

在过去的十年中，癌症研究领域已经显示出对患者衍生异种移植（PDX）作为评估癌细胞通路依赖和药物易感性1的工具的新^的热情。最常见的PDX模型通过人类肿瘤细胞的皮下或正畸植入建立——肿瘤片段、分离肿瘤衍生细胞群或分离循环肿瘤细胞样本——进入啮齿动物宿主体内。如果肿瘤"服用"成功，异种移植细胞将增殖，血管化，或以其他方式与宿主组织相互作用，形成肿瘤，可以收获的最佳大小，细分，并重新植入到其他宿主。作为模型系统，PDX在众多优点中通常保留了原生肿瘤细胞种群的异质性，并能够评估人类特异性通路和细胞反应^2,2、3。体内语境允许肿瘤与血管和其他相邻频闪体相互作用，并回顾组织特征，如药物扩散动力学、氧气张力和细胞外基质影响，从而影响肿瘤进展。PDX 的一个负面方面是它们依赖啮齿动物宿主，这既是肿瘤扩张，也是最终的假设检验。由于许多PDX无法适应传统的二维（2D）培养组织培养聚苯乙烯而不失去许多理想的特征，因此，在这种方法相对可控的体外方法与体内PDX使用费用、设施和时间要求显著增加之间，研究人员的中间地带微乎其微。

我们描述了多个体外模型，在支持矩阵中实现3D细胞培养，最近扩展了该工作，以证明多种前列腺癌（PCa）衍生PDX的外活培养，单独和与骨髓衍生的成纤维细胞^44，5联合培养。基于透明质酸 （HA） 水凝胶基质为两种细胞类型提供可定制且与生物学相关的支持，通过水凝胶深度 6 对水凝胶特性和光学清晰度进行^简单控制，用于成像。

成熟的PDX肿瘤组织包括异质人类癌细胞和小鼠频闪（成纤维细胞、内皮细胞等）的可变混合物。研究细胞型对体外肿瘤进展的具体贡献，有利于分离肿瘤，分离细胞群，并以有组织的方式进行实验合并，以解剖细胞间交流的通路。组织消化中的混合细胞群与特定培养条件具有差异性相容性。例如，肿瘤相关的成纤维细胞生存能力需要表面粘附或3D基质与整黄素配体功能化，而上皮衍生PDX细胞通常没有这些要求，而是倾向于细胞-细胞相互作用。这些差异可以被利用，以实现PDX细胞与污染小鼠频闪细胞的有效分离。组织消化的旋转培养允许频闪细胞粘附于组织培养表面，而细胞粘附驱动PDX细胞漂浮在旋转培养表面之上，在24~48小时内在上半部分形成多细胞簇。这些聚类的具体特性因 PDX 而异（例如，大、紧、高球形聚类或类似葡萄束的更小、更松散的聚集体），但通常具有生物相关尺寸（直径为 50–250 μm），足以评估依赖于细胞间接触的细胞相互作用。

肿瘤检索和处理不可避免地导致某种程度的附带细胞死亡，要么是由于机械/酶中断造成的短期损害，要么是亚细胞与所选培养条件的长期不相容。尽管旋转培养作为初始批量分离的效用，但死细胞或垂死的细胞不可避免地会随着PDX簇而转移，并会影响由此产生的培养。这些死细胞通常是单个PDX细胞，没有集成到一个集群，小鼠频闪成纤维细胞，不能在选定的培养条件下生存，或特别脆弱的内皮细胞。这种垂死的细胞可以影响"幸存者"的实验结果，并可以极大地影响定量，例如，通过荧光图像的生存能力筛查测定。为了改进从此方法中选择活的PDX细胞，我们采用离心方法，采用密度步骤，以轻松去除PDX混合物中的单个死/死细胞，并保留主要活体多细胞簇。

为了加强对3D培养中PDX衍生聚类的研究，我们利用了一个基于微流体的灌注培养平台，即有机板（图1），这是一个高通量的有机体片平台，允许在384孔微刺激板基上同时培养多达96个个体灌注、3D培养基（图^,81A）7。⁷在双通道微流体板中，单个组织芯片通过两个微流体通道（图1B，凝胶通道:红色，灌注通道:蓝色）连接，连续跨越四个孔。两个微流体通道由一个称为相位导的短塑料脊隔开，防止一个通道溢出到相邻的相邻通道中，同时允许在凝胶的内容和灌注通道9之间实现无膜^接口。由于微流体板的底部由显微镜级玻璃组成，因此可以通过标准或自动显微镜在观察窗口通过检查窗口查看。灌注是在微流体板与可编程摇臂，利用重力驱动介质通过微流体通道，在储层井之间（图1C）。灌注流模仿比静态培养更密切地概括肿瘤微环境，允许合并剪切应力和增强气体和营养物质的分布。与相同细胞的静态3D培养物相比，在微流体板中维持高融合癌细胞培养的好处以前被描述为高融合乳腺癌培养物表现出最佳的^生存能力。

本报告介绍了一种用于隔离活多细胞PDX聚类的适应密度梯度离心方法，并展示了其在可测量微流体板内建立3D PDX培养物的效用。由于越来越多的研究实验室正在寻求促进 PDX 使用的方法，我们预计此处介绍的协议将立即具有实用价值。

研究方案

肿瘤组织是在患者同意后根据经批准的机构审查委员会 （IRB） 协议获得的。Xenograft 根据公认的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 协议进行植入、种植和收获。

注:所有工作将在无菌生物安全柜中进行，以保持无菌。除非另有说明，否则所有步骤应在室温下执行。

1. 为PDX加工准备材料

1. 自用钳和手术刀手柄或剃须刀刀片。
2. 解冻分离酶溶液在4°C过夜或在室温下，与组织分离的同一天。
   注:不建议在37°C下解冻，因为这样会灭活一些分离酶。
3. 准备至少 100 mL 的 PDX 培养基（Dulbecco 的改良鹰培养素混合物 F-12 [DMEM-F12] 与 100 U/mL 青霉素和链霉素 和30%的胎儿牛血清[FBS]），以及至少25mL的PDX处理介质（DMEM-F12与100U/mL青霉素和链霉素，没有FBS）。储存在4°C，直到准备使用。

2. PDX 分离和初始纯化的频分量

1. 收集自洗器皿、70 μm 细胞过滤器（2+3）、60 mm 圆形组织培养皿（2）、6 孔组织培养板、无菌 50 mL 锥形离心管和无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。温暖培养基至37°C，让分离酶溶液达到室温。
2. 当PDX组织在小鼠宿主中达到1.0~1.5厘米的直径时，通过标准方法（例如，在接受麻醉下）手术切除小鼠肿瘤，并存放在具有PDX培养培养培养的50 mL管中的冰上（图2A）。通过以下步骤，及时处理组织，以最大限度地提高细胞的生存能力，最好在收获后1~2小时内。
3. 将肿瘤组织转移到预称无菌 50 mL 锥形管。用 30 mL 的无菌 PBS 冲洗 6x 以去除血液和污染物。去除尽可能多的液体，称重肿瘤组织。
4. 使用无菌剃须刀刀片或手术刀将肿瘤组织转移到 60 mm 圆形组织培养皿和薄荷到 +1 mm³ 件中。
5. 加入5 mL的PDX加工介质，收集肿瘤浆料并转移到新的无菌50 mL管中。用另外5 mL的PDX加工介质冲洗培养皿，然后用分离酶溶液（10 mL/g肿瘤，至少5 mL）冲洗，将所有冲洗加入50 mL管中。
6. 在37°C下孵育20分钟，轻轻摇动。在孵育时间进行到一半时轻轻旋转管子。
7. 用血清移液器轻轻地上下移液器来分解团块。将70μm细胞过滤器滤片放置在新的无菌50 mL管上。
   注:可能需要多个过滤器。
8. 在200 x g下离 心5分钟，以产生细胞颗粒。在 2~3 mL 的 PDX 培养介质中去除上一升，然后重新暂停。使用血细胞计或自动细胞计数器计算细胞。
9. 使用 表 1 估计实现每个芯片所需的细胞密度所需的分离 PDX 派生细胞数。
   注:表 1 中的 值旨在成为起点。实际值将因组织生存能力/细胞性和冻结/恢复造成的细胞损失而有所不同。PDX肿瘤是个体，即使在给定的癌症类型，所以这些值应该根据经验调整。
10. 在步骤2.9中计算的数字中，6井组织培养板每井5mL⁶的PDX培养培养中板1+2 x 10 6细胞。孵育（37 °C，5%₂CO 2，95% 湿度）48小时，轻轻摇晃（50~55 rpm），促进聚类形成（图2B）。聚类形成后，继续执行第 3 节进行离心。
11. 冷冻保留未使用的PDX细胞从最初的分离在50%FBS + 40% DMEM-F12 + 10%二甲基硫化物（DMSO）或市售原细胞冷冻介质。
    注:如果需要，也可以从组织板表面恢复粘附小鼠频闪细胞，使用培养基短暂冲洗，并通过标准方法进行扩张。
12. 为以后使用冷冻保存的PDX肿瘤细胞/小鼠频闪，解冻细胞在37°C水浴2分钟。在步骤 2.10 中所述的 6 井组织培养板中计数和板，然后继续第 3 节。将 PDX 细胞数量增加 ±20%，以适应低温保存造成的生存能力损失。

3. 基于PDX衍生聚类从单细胞分离的密度梯度离心

1. 在无菌的 50 mL 锥形管中，将 18 mL 的密度梯度离心溶液与 2 mL 无菌 10 倍汉克斯平衡盐溶液 （HBSS） 彻底混合，准备 20 mL 的 100% 密度梯度溶液。通过无菌 1x HBSSS 稀释这种 100% 溶液并混合良好，使 10 mL 各生产 20%、30%、40% 和 55% 密度梯度溶液。
   注:这些体积足以满足两个 15 mL 梯度，可用于分别分离 ±15 x 10⁶ 个单元格。如果分离小于 +15 x 10⁶ 细胞，应使用第二个梯度作为离心的平衡。
2. 在 15 mL 锥形管的底部加入 3 mL 的 55% 密度梯度溶液。以一定角度握住管子，非常轻柔地将层3 mL的40%密度梯度溶液放在55%层的顶部，慢慢地将液体分配到管子的倾斜侧，以避免混合层。使用 30% 密度梯度解决方案重复。
3. 使用 5 mL 血清移液器收集 PDX 旋转培养物的上一个上流水液，轻轻冲洗板表面。在200 x g下离 心2分钟，以产生细胞颗粒。
4. 去除上一层，根据分离细胞所需的梯度数，在 3 mL 的 20% 密度梯度溶液中重新填充细胞颗粒。小心地将 20% 密度梯度溶液分层，将细胞分层到梯度的顶部。如果只使用一个梯度管的细胞，顶部的平衡梯度管与无细胞20%密度梯度溶液。
5. 在 4 °C、2，000 x g和 0 制动器下，将管和离心机盖住，在回转桶转子离心机中安装 30 分钟。
6. 离心后，分数将可见（图2C）。将2~3 mL的馏分收集到新鲜的15 mL管中。将 3~4 卷无菌 1x HBSS 添加到每个分数中，并反转以彻底混合。
7. 在 1，000 x g 下离心 3 分钟，以产生细胞颗粒。去除上一除水，在1~2 mL的PDX处理介质中重新暂停细胞颗粒。
   注: 可行的PDX细胞簇通常位于40~55%密度梯度解接口（图2D），对于大多数D PDX测试，单死/死细胞聚集在20~40%密度梯度解接口上。
8. 去除一个小的、具有代表性的等分（50~100 μL），用等量的分离酶溶液重新分离，以评估聚类细胞悬浮液中的细胞数。使用血细胞计或自动细胞计数器计算细胞。

4. 水凝胶制备和微流体板播种

1. 根据制造商的说明重组HA水凝胶溶液（硫醇改性HA、HA-SH;硫醇反应聚乙烯二醇二醇二氧化硅酸酯、PEGDA）。
2. 使用多通道移液器，在 2 通道微流体板的观察窗口柱（第 3、7、11、15、19、23）的所有孔中添加 50 μL 的 HBSS，以保持培养湿度和最佳成像条件。
3. 在所需的细胞密度（即 5，000 个细胞/μL）下计算 50 μL 水凝胶所需的第 3 节的细胞悬浮量。对于播种一个微流体板，将计算的体积分成4个无菌1.5 mL离心管。
   注:HA 水凝胶有固定的凝胶时间。在过早进行凝胶化时，调整凝胶溶液等分的体积，提高用户在点胶的效率。
4. 使用前，使用 1 N NaOH 将 HA-SH 溶液的 pH 调整为 8.0。通过将 40 μL 的 HA-SH 与 10 μL 的 PEGDA 混合并监测凝胶，执行测试凝胶。凝胶通常从 HA-SH 与 PEGDA 交联器混合后 5~8 分钟开始。
5. 离心细胞悬浮液2分钟（200 x g，室温）到颗粒细胞。小心地取出上一级细胞，并在适当的HA-SH体积中重新暂停。
   注:最终水凝胶是一个4:1的HA-SH:PEGDA溶液（按体积），因此细胞应重新以40μL的HA-SH来重新产生，最终体积为50μL。
6. 在HA中的一个细胞中加入10μL的PEGDA。混合好，等待1~3分钟（取决于步骤4.4的凝胶时间），然后再播种微流体板。
   注:在播种前允许开始凝胶反应有助于最大限度地减少细胞沉降。
7. 将用于将 1.5 μL 体积分配到单个通道的尖端，重复移液器，并在 HA 水凝胶溶液中用电池进行加载。请记住保持水凝胶等分素混合良好，以确保均匀的细胞分布。
8. 要播种微流体板，请将移液器尖端垂直于板上对齐，同时轻轻地将尖端放在凝胶入口的中心（柱 1、5、9、13、17、21），以确保在分配水凝胶溶液时接触，但无压力。快速工作，防止水凝胶凝固过早，将1.5μL的凝胶溶液分配到每个凝胶入口。
9. 通过从板的顶部、板的底部或显微镜观察微流体通道的填充状态，并使用图 3 作为参考（图 3A 中的加载成功加载，图 3B中的移液定位指南，图 3C中的未填充加载，图 3D中未填充到结束，图3E 中的溢出）。 Figure 3B确定任何必要的技术调整，这些调整可能会提高下一轮芯片的灌装成功率（有关故障排除技巧，请参阅讨论）。
10. 使用 HA 溶液中剩余的 3 个等分单元重复步骤 4.6~4.9。在准备下一个等分（±1分钟）时反转板。
    注:当凝胶发生时，1分钟的等待时间和板的反转通过减少细胞沉降来改善细胞的3D分布。
11. 填充所有芯片后，在37°C的加气培养箱中孵育板，直到凝胶完成（+45分钟）。
12. 使用提供的手册，确保将灌注摇杆安装到细胞培养箱中，并采用正确的灌注设置（14° 角度，4 分钟间隔）。
13. 将 50 μL 的 PDX 培养介质添加到所有介质入口（第 2、6、10、14、18、22 列），通过翻转板检查通道是否正确填充。轻轻敲击板对表面，以鼓励液体填充微流体通道。
14. 为所有介质插座（第 4、8、12、16、20、24）添加 50 μL 的 DMEM-F12（10% FBS）。如果灌注通道中有任何气泡，请轻轻敲击板面，将其拆下。
15. 使用显微镜和板布局表（补充图1），记录芯片填充成功。将未正确填充的芯片排除在进一步实验使用之外。
16. 将板放在倾斜摇杆上，设置为 14° 倾斜，循环 4 分钟，开始灌注。每 2 天更换一次 PDX 培养介质（进气中先更换 50 μL，然后在出口中更换 50 μL）。

5. 细胞染色、成像和图像量化

1. 准备含有三种荧光染料的细胞可行性测定溶液（Hoechst 33342，同质-1，钙蛋白醋氧甲基[AM]）。
   1. 准备每种染料的库存溶液如下:在脱压水中以1.6 mM（1毫克/千升）的 Hoechst 33342;在无水 DMSO 中， 钙化物 Am 在 4 mm;在 DMSO/H 2 O （1:4， v/v） 中的₂mM 的乙基均质-1。
      注:库存钙化物 AM 和同质-1 溶液在材料表中的笔记 套件中提供。
   2. 在HSSS或苯酚无红介质中准备一个工作溶液，包含所有三种染料。优化每个细胞类型和基质的最终工作浓度，在 Hoechst 33342 的 1.6±8.0 μM 范围内，在钙素 AM 的 0.1±10 ΜM 范围内，在 0.1±10 μM 的量值均匀物-1 的范围内优化 0.1±10 μM。
2. 去除培养基，将工作活力染料溶液应用于所需的微流体芯片（入口75μL，出口25μL），并放回细胞培养箱中的灌注摇摇杆上1小时。
3. 使用手动或自动共合显微镜（材料表）用荧光滤光片（Table of Materials列为激发/发射波长） 成像染色文化中的观察窗口， 以 nm） 观察所有核 （Hoechst 33342， 350/461）， 死细胞核 （同质 - 1， 528/617）， 和活细胞细胞质 （钙素 AM， 494/517）.
4. 使用 20 倍空气目标捕获 140 μm Z 堆栈，步进尺寸为 ≤1 μm。需要三个视场来对具有少量重叠的整个微通道进行成像。为了避免双重采样，每个芯片只能成像两个视场。
   注:应优化成像条件，以确保正确的奈奎斯特采样。根据作者的经验，一个快速成像系统，无论是基于传统的荧光源的去卷积或共振扫描模式，是需要完全检测一个完整的Z堆栈，与三种激光颜色，在一个板在合理的时间内96个芯片（大约3.5小时自动成像，包括设置）。
5. 使用图像分析软件，对所需的量化数据（如形态、聚合状态或其他特征）的 Z 堆栈图像进行检测。要量化细胞生存能力，计算死细胞（红色）和总细胞核（蓝色）的数量。

结果

在标准水千斤细胞培养箱中准备了可编程灌注摇臂，在标准生物安全柜中准备了双通道微流体板进行装载（图1）。MDA-PCA-118b PDX肿瘤在体内扩大，在达到最大尺寸时收获，并如协议第2节所述分离，以大约单细胞状态形成细胞的泥浆悬浮（图2A）。浆料被分配到6孔组织培养板中，并按所述放置在XY旋转器上，为48小时。如先前所述，小鼠频闪附附于组织培...

讨论

在这里，我们描述了一种在高通量、注入三D培养系统中处理和培养可行的PDX衍生肿瘤细胞的方法。虽然该协议利用PCa PDX组织，它同样有效的其他上皮衍生肿瘤。肿瘤特征在单个 PDX 线之间有所不同，即使在同一原点组织（前列腺、乳房等）内。一些PCa PDX线是更多的纤维化和难以分离可行的细胞，而其他更多的细胞。此处指出的肿瘤大小可以在 IACUC 指南中变化，为特别低产的肿瘤提供更多的组织?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1N NaOH			any suitable tissue culture grade
60 mm round tissue culture dishes			any suitable
6-well tissue culture plates			any suitable
70 µm cell strainers	Corning	431751	or equivalent
Centrifuge	Eppendorf	5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes	or equivalent
Density gradient centrifugation solution	Millipore Sigma	P1644	Percoll
Dimethylsulfoxide			any suitable tissue culture grade
Dissociation enzyme solution	StemCell Technologies	07921	ACCUMAX
DMEM-F12	ThermoFisher Scientific	11039021	or equivalent
Forceps			any suitable
HA hydrogel kit	ESI BIO	GS311	HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)
Hanks Balanced Salt Solution	Lonza	10-527F	or equivalent
Heat-inactivated fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B Hausser BrightLine	or equivalent
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H1398	or equivalent
Image processing software	Oxford Instruments	Imaris 9.3	or equivalent
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)	ThermoFisher Scientific	L3224	or equivalent
Microfluidic culture plate	Mimetas	9603-400-B	2-lane OrganoPlate
Microscope	Nikon	A1R	or equivalent
Multichannel pipette	Eppendorf	3125000036	or equivalent
PDX-derived tumor tissue			obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122	or equivalent
Perfusion rocker	Mimetas	OrganoPlate Perfusion Rocker Mini
pH strips (pH 5-9)			any suitable
Phosphate-buffered saline solution	Lonza	17-516F	or equivalent
Razor blades			any suitable
Rotating xy-shaker	VWR	Advanced 3500 Orbital Shaker	or equivalent
Scalpel handle			any suitable
Single channel repeating pipette	Eppendorf	22260201
Sterile, 15mL conical centrifuge tubes			any suitable
Sterile, 50mL conical centrifuge tubes			any suitable