Perfused 마이크로 유체 플랫폼에서 환자 유래 제노이식의 Ex vivo 3D 하이드로겔 배양에 대한 향상된 생존력

요약

이 프로토콜은 환자 유래 제노이식(PDX)의 시험관 내 배양을 확장가능하게 하는 방법을 보여 줍니다. 한 단계는 실행 불가능한 단일 셀을 간단하게 제거하여 3D 하이드로겔에서 다세포 클러스터 배양의 전반적인 생존력을 향상시킵니다. 보조 단계는 PERfused 된 미세 유체 플랫폼에서 PDX 문화에 대한 모범 사례를 보여줍니다.

초록

환자 유래 이종이이식(PDX)은 환자 종양 조직이 면역 손상 된 마우스로 직접 이식 될 때 생성되며 생물학적으로 안정적으로 유지되어 분자, 유전 및 조직학적 특징뿐만 아니라 원래 종양의 이질성을 보존합니다. 그러나, 약물 스크리닝을 포함한 수많은 실험을 수행하기 위해 이러한 모델을 사용하는 것은 비용과 시간 면에서 모두 금지된다. 3차원(3D) 배양 시스템은 암세포가 생화학적 상호 작용, 형태학 및 건축을 통해 생물학적 무결성을 유지하는 플랫폼으로 널리 간주됩니다. 우리 팀은 히알루론산 (HA)으로 구성된 3D 행렬을 사용하여 시험관 내에서 PDX 세포를 배양한 광범위한 경험을 가지고 있습니다. PDX와 관련된 마우스 섬유아세포 기질 세포를 분리하기 위해, 우리는 기질 세포가 조직 배양 판의 표면에 부착되는 회전 배양을 사용하며 PDX 종양 세포가 부유하고 다세포 클러스터로 자체 연관시합니다. 또한 상체에 떠있는 것은 3D 세포 배양을 위한 하이드로겔로 다운스트림 캡슐화를 위한 실행 가능한 PDX 클러스터를 수집하는 데 어려움을 제시하는 단일, 종종 죽은 세포입니다. 이러한 단일 세포를 라이브 셀 클러스터에서 분리하기 위해 밀도 단계 그라데이션 원심 분리를 채택했습니다. 여기서 설명된 프로토콜은 추가 시험관 내 실험을 위해 사용될 세포 클러스터의 건강한 집단에서 실행 불가능한 단세포의 고갈을 허용합니다. 우리의 연구에서, 우리는 문화 동안 미디어 관류를 허용하는 미세 유체 판에 3D 배양을 통합합니다. 정제되지 않은 세포와 정제된 세포의 형광 이미지 기반 생존 가능성 분석기를 사용하여 결과 배양을 평가한 결과, 우리의 결과는 이 추가 분리 단계가 우리의 배양에서 실행 불가능한 세포의 수를 실질적으로 감소시켰다는 것을 보여줍니다.

서문

지난 10년 동안 암 연구 분야는 암세포 통로 의존도 및 약물 감수성^1을평가하기 위한 도구로 환자 유래 제노이식(PDXs)에 대한 새로운 열정을 입증해 왔다. 가장 일반적인 PDX 모델은 인간 종양 세포의 피하 또는 직교 이식에 의해 확립됩니다 - 종양 단편, 해리 된 종양 유래 세포의 클러스터, 또는 절연 순환 종양 세포의 샘플 (CTC)-설치류 숙주로. 종양 "테이크"가 성공하면, 이종이이식 세포가 증식, 혈관화 및 그렇지 않으면 최적의 크기로 수확될 수 있는 종양을 만들기 위해 숙주 조직과 상호 작용하여 다른 호스트로 다시 이식될 수 있습니다. 모델 시스템으로서 이들의 많은 장점 중에서, PDX는 전형적으로 네이티브 종양 세포 집단의 이질성의 상당 부분을 유지하고 인간 특이적 경로 및 세포 반응^2,,3의평가를 가능하게 한다. 생체 내 컨텍스트는 혈관 및 기타 인접 성 기질과의 종양 상호 작용을 가능하게하고 생물학적 및 기계적으로 종양 진행에 영향을 미치는 약물 확산 역학, 산소 장력 및 세포 외 매트릭스 영향과 같은 조직 특성을 재구성합니다. PDXs의 부정적인 측면은 종양 확장을 위한 설치류 호스트에 대한 의존과 궁극적으로 가설 검사를 위한 것입니다. 많은 PDX는 바람직한 특성을 많이 잃지 않고 조직 배양 폴리스티렌에 대한 전통적인 2차원 (2D) 문화에 적응할 수 없기 때문에, 상대적으로 조절된 체외 방법 과 생체 내 PDX 사용에 대한 비용, 시설 및 시간 요구 사항의 상당한 증가 사이에 연구자에게 최소한의 중간 지점이 있었습니다.

우리는 지원 매트릭스 내에서 3D 세포 배양을 구현하는 여러 체외 모델을 설명하고, 최근에는 골수 유래^{섬유아세포4,,5와}함께 단독으로 그리고 공동 배양에서 다중 전립선암(PCa)유래 PDX의 전 생체 배양을 입증하기 위해 그 작업을 확장하였다. 히알루론산(HA)기반 하이드로겔 매트릭스는 하이드로겔 깊이^6을통한 이미징을 위한 하이드로겔 특성및 광학 선명도에 대한 촉진제어와 함께 두 세포 유형에 대해 사용자 정의 가능하고 생물학적으로 관련된 지원을 제공한다.

성숙한 PDX 종양 조직은 이질적인 인간 암세포 및 마우스 기질 (섬유아세포, 내피 세포 등)의 가변 혼합물을 포함한다. 체외에서 종양 진행에 대한 세포 형 특이적 기여를 연구하기 위해 종양을 해리하고 세포 집단을 분리하며 세포 간 통신의 경로를 해부하는 조직된 방식으로 실험적으로 통합하는 것이 유리할 수 있습니다. 조직 발굴내의 혼합 세포 인구는 특정 배양 조건과의 차동 적 호환성을 갖는다. 예를 들어, 종양 관련 섬유아세포 생존가능성은 인테그린 리간드로 기능화된 표면 준수 또는 3D 행렬을 필요로 하며, 상피 유래 PDX 세포는 전형적으로 이러한 요구 사항을 갖지 않고 세포 세포 상호 작용을 선호합니다. 이러한 차이는 마우스 기질 세포를 오염에서 PDX 세포의 효과적인 분리를 달성하기 위해 악용 될 수있다. 조직 발굴의 회전 배양은 세포-세포 접착이 24-48h에서 상체체에 다세포 클러스터를 형성하기 위해 회전 배양 표면 위에 떠 있는 PDX 세포를 구동하는 동안 조직 배양 표면에 기질 세포 부착을 허용합니다. 이러한 클러스터의 특정 특성은 PDX(예: 크고, 단단하고, 구형군이 많거나, 포도 무리를 닮은 더 작고, 느슨한 골재)와 다르지만, 일반적으로 생물학적으로 관련된 크기(50-250 μm 직경)에 따라 세포 간 접촉에 의존하는 세포 상호 작용을 평가하기에 충분합니다.

종양 검색 및 처리는 필연적으로 기계적 / 효소 중단으로 인한 단기 손상 또는 선택한 문화 조건과의 하위 집단의 장기적인 비호환성으로 인해 어느 정도의 부수적 인 세포 사멸을 초래합니다. 초기 벌크 분리로서 회전 배양의 유용성에도 불구하고, 죽거나 죽어가는 세포는 필연적으로 PDX 클러스터로 전송되고 결과 배양에 영향을 미칠 수 있다. 이 죽은 세포는 수시로 클러스터, 선택된 배양 조건에서 살아남을 수 없는 마우스 기질 섬유아세포, 또는 특히 연약한 내피 세포에 통합되지 않은 개별 PDX 세포입니다. 이러한 죽어가는 세포는 "생존자"의 실험 결과에 영향을 미칠 수 있으며 형광 이미지 기반 생존 가능성 스크리닝 을 통해 정량화에 실질적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 이 방법에서 살아있는 PDX 세포의 선택을 개선하기 위해, 우리는 PDX 혼합물에서 개별 죽은 / 죽어가는 세포를 쉽게 제거하고 주로 살아있는 다세포 클러스터를 유지하기 위해 밀도 단계와 원심 분리 방법을 적응.

3D 배양에서 PDX 유래 클러스터의 연구를 강화하기 위해, 우리는 384 웰 마이크로티터 플레이트에 최대 96 개의 개별, 3D 배양의 동시 배양을 허용하는 높은 처리량 오르간 온 - 칩 플랫폼인 미세 유체 기반 관류 배양^{7플랫폼인}OrganoPlate(그림1)를^{활용했습니다.} 2차선 미세유체 플레이트에서 단일 티슈 칩은 2개의 미세유체채널(도 1B,젤 채널: 빨강, 관류 채널: 블루)에 의해 연결됩니다. 두 개의 미세 유체 채널은 한 채널의 인접 한 채널의 오버플로를 방지하는 Phaseguide라는 짧은 플라스틱 능선으로 분리되며 동시에 젤과 관류 채널^9의내용 사이의 막 없는 인터페이스를 허용합니다. 미세 유체 판의 바닥은 현미경 등급 유리로 구성되기 때문에, 배양은 표준 또는 자동화 된 현미경으로 플레이트의 바닥을 통해 관찰 창에서 볼 수 있습니다. 관류는 프로그래밍 가능한 로커가 있는 미세유체 판에 설치되어 중력을 사용하여 미세유체 채널을 통해 미디어를 구동하며, 저수지우물(도 1C)을통해 미디어를 구동한다. 관류 흐름 모방은 정적 배양보다 종양 미세 환경을 더 밀접하게 재구성하여 전단 응력의 통합과 가스와 영양소의 향상된 분포를 허용합니다. 미세유체판에서 관융합된 암 세포 배양을 유지하는 이점은 이전에 동일한 세포의 정적 3D 배양에 비해 최적의 생존가능성을 나타내는 것으로 설명되어 있다^7.

본 보고서는 라이브 다세포 PDX 클러스터를 격리하기 위한 적응된 밀도 그라데이션 원심분리 방법을 설명하고, 구불구형 미세 유체 플레이트 내에서 3D PDX 배양을 확립하는 데 있어 유용성을 입증합니다. PDX 사용을 용이하게 하는 방법을 모색하는 연구 실험실의 수가 늘어나고 있기 때문에 여기에 제시된 프로토콜이 즉각적인 유용성일 것으로 예상됩니다.

프로토콜

종양 조직은 환자의 동의와 승인 된 기관 검토 위원회 (IRB) 프로토콜에 따라 얻어졌다. 제노이식은 허용된 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 프로토콜에 따라 이식, 재배 및 수확되었습니다.

참고: 모든 작업은 멸균을 유지하기 위해 멸균 생물학적 안전 캐비닛에서 수행되어야 합니다. 달리 명시되지 않는 한 모든 단계는 실온에서 수행되어야 합니다.

1. PDX 처리를위한 재료의 준비

1. 자동 클랩 집게와 메스 손잡이 또는 면도날.
2. 해화 효소 용액을 하룻밤 사이에 4°C 또는 실온에서 티슈 해리와 같은 날에 해동한다.
   참고: 37°C에서 해동하는 것은 일부 해리 효소를 비활성화할 수 있으므로 권장되지 않습니다.
3. 100 U/mL 페니실린및 연쇄상 구균증및 3을 가진 PDX 배양 배지(덜벡코의 수정된 이글 중간 영양 혼합물 F-12 [DMEM-F12]의 최소 100mL 준비 태아 소 혈청 [FBS]), 및 PDX 처리 매체의 최소 25mL (DMEM-F12 와 100 U/mL 페니실린 및 연쇄 상 혈 청 및 FBS 없음). 사용할 준비가 될 때까지 4 °C에 보관하십시오.

2. PDX 해리 및 기질 성분의 초기 정화

1. 오토클레이브 기구, 70 μm 세포 스트레이너(2-3), 60mm 원형 조직 배양 접시(2), 6웰 조직 배양 플레이트, 멸균 50mL 원심분리관, 멸균 1x 인산완충식식(PBS)을 수집한다. 따뜻한 배양 배지에서 37°C까지, 실온에 해리 효소 용액을 허용한다.
2. PDX 조직이 마우스 숙주에서 직경 1.0-1.5cm에 도달하면, 외과적으로 표준 수단(예를 들어, 허용된 마취 하에)에 의해 마우스에서 종양을 제거하고 PDX 배양배지(그림 2A)를가진 50mL 튜브에 얼음에 저장한다. 추수 후 1-2 시간 이내에 세포 생존력을 극대화하기 위해 아래 단계를 통해 조직을 신속하게 처리하십시오.
3. 종양 조직을 미리 계량된 멸균 50mL 원문 튜브로 이송한다. 혈액과 오염 물질을 제거하기 위해 멸균 PBS30mL로 6x를 헹구습니다. 가능한 한 많은 액체를 제거하고 종양 조직을 무게.
4. 종양 조직을 60mm 원형 조직 배양 접시로 옮기고 멸균 면도날이나 메스를 사용하여 ~1mm^3개로 다진다.
5. 5mL의 PDX 처리 매체를 추가하여 종양 슬러리를 수집하고 새로운 멸균 50mL 튜브로 이송합니다. 교양 접시를 또 다른 5mL의 PDX 가공 매체로 헹구고, 그 다음에는 해리 효소 용액(10mL/g 종양, 적어도 5mL)으로 배양 접시를 헹구고, 50mL 튜브에 모든 헹구를 추가한다.
6. 37°C에서 20분 동안 부드러운 흔들림으로 배양합니다. 튜브를 잠복 시간 중간에 부드럽게 소용돌이시다.
7. 파이펫은 덩어리를 분해하기 위해 서학적 파이펫으로 부드럽게 위아래로. 새로운 멸균 50mL 튜브 위에 배치 된 70 μm 세포 스트레이너로 셀을 필터링합니다.
   참고: 하나 이상의 여과자가 필요할 수 있습니다.
8. 펠릿 세포에 5 분 동안 200 x g에서 원심 분리기. PDX 배양 배지의 2-3 mL에서 상수 제거 및 재중단. 혈전계 또는 자동화된 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산합니다.
9. 표 1을 사용하여 칩당 원하는 세포 밀도를 달성하는 데 필요한 분리된 PDX 유래 셀수를 추정합니다.
   참고: 표 1의 값은 시작점입니다. 실제 값은 조직 생존가능성/세포성 및 동결/회복으로 인한 세포 손실로 인해 달라집니다. PDX 종양은 주어진 암 유형 내에서도 개인이므로 이러한 값을 경험적으로 조정해야합니다.
10. 단계 2.9에서 계산된 수의 플레이트 1-2 x 10⁶ 세포는 PDX 배양 배지의 5mL에서 6웰 조직 배양 플레이트의 웰당. 인큐베이션(37°C, 5% CO_2,95% 습도)을 48h에 부드러운 흔들림(50-55rpm)으로 하여 클러스터형성(도 2B)을촉진한다. 클러스터가 형성된 후 원심분리를 위해 섹션 3로 진행합니다.
11. 극저온 보존 초기 해리에서 50% FBS + 40% DMEM-F12 + 10% 디메틸 설산화물(DMSO) 또는 시판 가능한 1차 세포 동결 배지에서 사용하지 않은 PDX 세포.
    참고: 부착 된 마우스 기질 세포는 또한 배양 배지로 간략하게 헹구고 표준 수단에 의해 확장함으로써, 원하는 경우, 조직 판 표면에서 복구 될 수있다.
12. 냉동 보존 PDX 종양 세포 /마우스 스트로마의 나중에 사용, 2 분 동안 37 °C 수조에서 세포를 해동. 제3항으로 진행하기 전에 2.10단계에서 설명된 바와 같이 6웰 조직 배양 판에서 카운트 및 플레이트. 냉동 보존으로 인한 생존 가능성 손실을 수용하기 위해 PDX 셀 수를 ~20% 늘립니다.

3. 단일 셀에서 PDX 파생 클러스터의 밀도 그라데이션 원심 분리 기반 분리

1. 멸균 50mL 원문 튜브에 멸균 10x 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)의 2mL와 18mL의 밀도 그라데이션 원심 분리 용액을 철저히 혼합하여 20mL의 밀도 그라데이션 용액을 준비한다. 멸균 1x HBSS로 이 100% 솔루션을 희석하고 잘 혼합하여 각각 20%, 30%, 40%, 밀도 55% 밀도 그라데이션 솔루션을 10mL로 만드십시오.
   참고: 이러한 볼륨은 각각 ~15 x 10⁶ 셀을 분리하는 데 사용할 수 있는 두 개의 15mL 그라데이션에 충분합니다. ~15 x 10⁶ 셀 미만을 분리하는 경우 두 번째 그라데이션은 원심분리를 위한 균형으로 사용해야 합니다.
2. 15mL 원문 튜브의 바닥에 55% 밀도 그라데이션 솔루션3mL을 추가합니다. 튜브를 비스듬히 잡고, 55% 층 위에 40% 밀도 그라데이션 용액의 3mL을 매우 부드럽게 층으로, 천천히 층을 혼합하지 않도록 튜브의 각진 측면에 액체를 분배. 30% 밀도 그라데이션 솔루션으로 반복합니다.
3. PDX 회전 배양의 상체를 5mL 세로지피펫으로 수집하고 플레이트 표면을 부드럽게 헹구십시오. 200 x g에서 펠릿 세포에 2 분 동안 원심 분리기.
4. 셀을 분리하는 데 필요한 그라데이션 수에 따라 20% 밀도 그라데이션 용액의 3mL에서 수퍼나탄을 제거하고 세포 펠릿을 재연한다. 셀이 그라데이션 의 상단에 있는 20% 밀도 그라데이션 솔루션을 신중하게 층으로 레이어합니다. 셀에 대해 그라데이션 튜브를 하나만 사용하는 경우, 세포가 없는 20% 밀도 그라데이션 솔루션으로 균형 그라데이션 튜브를 맨 위에 얹습니다.
5. 4°C, 2,000 x g및 0 브레이크에서 30분 동안 튜브와 원심분리기를 스윙 버킷 로터 원심분리기에서 30분 동안 캡합니다.
6. 원심분리 후 분획이표시됩니다(그림 2C). 신선한 15 mL 튜브에 분수의 2-3 mL을 수집합니다. 각 분획에 멸균 1x HBSS의 3-4 볼륨을 추가하고 완전히 혼합 반전.
7. 원심분리기는 펠릿 세포에 3분 동안 1,000 x g에서. PDX 처리 매체의 1-2 mL에서 상체를 제거하고 셀 펠릿을 다시 분리합니다.
   참고: 실행 가능한 PDX 세포 클러스터는 일반적으로 테스트된 대부분의 PDX에 대해 20-40% 밀도 그라데이션 솔루션 인터페이스에 축적된 단일 죽기/죽어가는 세포가 있는 40-55% 밀도 그라데이션 솔루션인터페이스(그림 2D)에서발견됩니다.
8. 클러스터된 세포 현탁액의 세포 수를 평가하기 위해 동일한 양의 해리 효소 용액으로 재해리를 위해 작고 대표적인 알리쿼트(50-100 μL)를 제거한다. 혈종계 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다.

4. 하이드로겔 제제 및 미세 유체 플레이트 파종

1. 제조업체의 지침에 따라 HA 하이드로겔 용액(thiol-modified HA, HA-SH; 티올 반응성 폴리에틸렌 글리콜 디아콜리콜레이트, PEGDA)을 재구성한다.
2. 멀티채널 파이펫을 사용하여 2레인 미세 유체 플레이트의 관측 창 기둥(컬럼 3, 7, 11, 15, 19, 23)의 모든 우물에 50μL의 HBSS를 추가하여 배양 습도와 최적의 이미징 조건을 유지합니다.
3. 원하는 세포 밀도(즉, 5,000세포/μL)에서 하이드로겔 50μL에 필요한 3절에서 세포 현탁액의 부피를 계산합니다. 하나의 미세 유체 플레이트를 시드하기 위해, aliquot 계산된 부피를 각각 4멸균 1.5 mL 원심분리기 튜브로 인용한다.
   참고: HA 하이드로겔은 겔화에 고정된 시간이 있습니다. 조기 겔화가 발생하면 디스펜싱시 사용자 효율성을 위해 젤 용액 알리코트의 부피를 조정합니다.
4. 사용 직전에 HA-SH 용액의 pH를 1N NaOH로 8.0으로 조정합니다. HA-SH의 40 μL을 PEGDA 10 μL과 혼합하고 시간이 지남에 따라 겔화를 모니터링하여 시험 젤레이션을 수행합니다. 겔화는 일반적으로 PEGDA 크로스링커와 HA-SH를 혼합한 후 5-8분 시작됩니다.
5. 원심분리기 세포 현탁액은 펠릿 세포에 2분(200 x g,실온)에 대한 알리쿼트이다. 상체를 조심스럽게 제거하고 HA-SH의 적절한 부피에서 세포를 다시 중단합니다.
   참고: 최종 하이드로겔은 4:1 HA-SH:PEGDA 용액(부피별)이므로 50 μL 최종 부피의 HA-SH 40 μL에서 세포를 재장축해야 합니다.
6. HA에 있는 세포의 1개의 알리쿼트에 PEGDA의 10 μL를 추가합니다. 잘 섞고 1-3분(4단계에서 겔화 시간에 따라 다름)을 기다린 후 미세유체 플레이트를 시드합니다.
   참고: 시드 전에 시작의 겔화 반응을 허용하면 세포 침전을 최소화하는 데 도움이 됩니다.
7. 1.5 μL 볼륨을 단일 채널반복 파이펫에 분배하고 HA 하이드로겔 용액의 셀과 로드하는 팁을 부착합니다. 하이드로겔 알리쿼트도 세포 분포를 보장하기 위해 잘 혼합된 상태를 유지해야 합니다.
8. 미세유체 플레이트를 시드하려면, 파이펫 팁을 플레이트에 수직으로 정렬하면서 젤 입구(컬럼 1, 5, 9, 13, 17, 21)의 중앙에 팁을 부드럽게 배치하여 하이드로겔 용액을 분배할 때 접촉하지만 압력을 보장하지 않습니다. 조기 하이드로겔 응고를 방지하기 위해 신속하게 작동하여 각 젤 입구에 젤 용액1.5 μL을 분배합니다.
9. 도 3A에서 성공적인 로딩, 도 3B의파이펫 포지셔닝 안내, 도 3C의누락된 로딩, 도 Figure 3A 3D,도 3E의오버플로)를 사용하여 플레이트 의 상부, 플레이트 의 바닥 또는 현미경으로 보는 것으로 미세유체 채널의 채우기 상태를 관찰하고 로딩을 평가합니다. 다음 칩 라운드의 채우기 성공을 향상시킬 수 있는 기술에서 필요한 조정사항을 식별합니다(문제 해결 팁에 대한 토론 참조).
10. HA 용액에서 나머지 3 개의 알리쿼트와 함께 4.6-4.9 단계를 반복하십시오. 다음 알리쿼트(~1분)를 준비하면서 접시를 반전시다.
    참고: 플레이트의 대기 시간 및 반전은 겔화가 발생하면 세포 침전을 줄임으로써 세포의 3D 분포를 향상시킵니다.
11. 모든 칩이 채워진 후, 젤레이션이 완료 될 때까지 가습 인큐베이터에서 37 °C에서 플레이트를 배양 (~45 분).
12. 제공된 설명서를 사용하여 관류 로커가 정확한 관류 설정(14° 각도, 4분 간격)으로 세포 배양 인큐베이터에 설치되도록 하십시오.
13. 모든 매체 입구(열 2, 6, 10, 14, 18, 22)에 PDX 배양 배지 50μL을 추가하고 플레이트를 뒤집어 채널이 제대로 채워져 있는지 확인합니다. 표면을 부드럽게 탭하여 액체가 미세 유체 채널을 채우도록 유도합니다.
14. 모든 중간 콘센트(열 4, 8, 12, 16, 20, 24)에 DMEM-F12(10% FBS)의 50μL을 추가합니다. 관류 채널에 기포가 갇혀 있는 경우 플레이트를 표면을 부드럽게 눌러 제거합니다.
15. 현미경 및 플레이트 레이아웃형태(보충 도 1)를사용하여 칩 충전 성공을 기록합니다. 부적절하게 채워진 칩을 추가 실험용사용에서 제외합니다.
16. 14° 기울기와 4분 사이클로 설정된 기울기 로커에 플레이트를 놓아 관류를 시작합니다. PDX 배양 배지를 2일마다 교체합니다(입구에 처음 50μL, 콘센트에 50 μL).

5. 세포 염색, 이미징 및 이미지 정량화

1. 3개의 형광염료를 포함하는 세포 생존성 분석용액을 준비한다(Hoechst 33342, 에디듐 호모디머-1, 칼세신 아세톡시메틸 [AM]).
   1. 다음과 같이 각 염료의 재고 솔루션을 준비하십시오 : hoechst 33342 at 1.6 mM (1 mg /mL) 에서 탈온 된 물; 칼세인 AM at 4 mM in 무수DMSO; DMSO/H₂O (1:4, v/v)에서 2mM에서 에디듐 호모디움-1.
      참고 : 주식 칼세인 AM 및 에디듐 호모디머-1 솔루션은 재료의 표에표시된 키트에 제공됩니다.
   2. 세 개의 염료를 모두 포함하는 HBSS 또는 페놀 무적 배지에서 단일 작업 솔루션을 준비합니다. 각 세포 유형 및 매트릭스에 대한 최종 작동 농도를 최적화, Hoechst 33342에 대한 1.6-8.0 μM범위 내에서, 칼세인 AM의 경우 0.1-10 μM, 에디듐 호모디머-1용 0.1-10 μM.
2. 배양 배지를 제거하고 원하는 미세 유체 칩(75 μL in inlet, 25 μL) 세포 배양 인큐베이터의 관류 로커에 다시 배치하여 1시간 동안 작업 생존성 염료 용액을 적용한다.
3. 형광 필터 (여기/방출 파장으로 나열 된 수동 또는 자동화 된 공초점 현미경(재료의 표)을사용하여 스테인드 문화의 관찰 창을 이미지, nm에서) 모든 핵을 관찰하기 위해 (Hoechst 33342, 350/461), 죽은 세포 핵 (에디듐 호모디머-1, 528/617), 및 살아있는 세포 세포질 (calcein AM, 494/517).
4. 20배 공기 목표를 사용하여 단계 크기≤1 μm의 140 μm Z 스택을 캡처합니다. 소량의 중복으로 전체 마이크로 채널을 이미지화하려면 세 가지 보기 필드가 필요합니다. 이중 샘플링을 방지하려면 이미지칩당 두 개의 뷰 필드만 표시됩니다.
   참고: 적절한 NyQuist 샘플링을 보장하기 위해 이미징 조건을 최적화해야 합니다. 저자의 경험에서, 빠른 이미징 시스템, 기존의 에피 형광 소스또는 공초점에 공명 스캐닝 모드의 deconvolution에 기초, 완전히 세 레이저 색상, 전체 Z 스택을 분석하는 데 필요한 96 칩에 걸쳐 시간의 합리적인 금액 (약 3.5 시간 자동 이미징 포함).
5. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 형태학, 집계 상태 또는 기타 피쳐와 같은 원하는 정량화된 데이터에 대한 Z 스택 이미지를 분석합니다. 세포 생존가능성을 정량화하기 위해 죽은 세포(적)와 총 세포 핵(blue)의 수를 계산합니다.

결과

프로그래밍 가능한 관류 로커는 표준 수중 재사용 세포 배양 인큐베이터로 제조되었고, 2차선 미세 유체 플레이트는 적재를 위한 표준 생체 안전캐비닛(도 1)에제조되었다. MDA-PCA-118b PDX 종양은 생체 내에서 확장되었고, 최대 크기에 도달했을 때 수확하고, 프로토콜 섹션 2에 설명된 바와 같이 해리하여 세포의 슬러리 현탁액을 약 1세포상태(도 2A)에서생...

토론

여기서는 높은 처리량, perfused 3D 배양 시스템에서 실행 가능한 PDX 유래 종양 세포를 처리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 PCa PDX 조직을 활용하는 동안, 다른 상피 유래 종양에 대해 동등하게 효과적입니다. 종양 특성은 동일한 기원 조직(전립선, 유방 등)내에서도 개별 PDX 대사마다 다릅니다. 일부 PCa PDX 라인은 다른 사람들이 더 세포 인 동안 에서 실행 가능한 세포를 격리하기 어?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1N NaOH			any suitable tissue culture grade
60 mm round tissue culture dishes			any suitable
6-well tissue culture plates			any suitable
70 µm cell strainers	Corning	431751	or equivalent
Centrifuge	Eppendorf	5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes	or equivalent
Density gradient centrifugation solution	Millipore Sigma	P1644	Percoll
Dimethylsulfoxide			any suitable tissue culture grade
Dissociation enzyme solution	StemCell Technologies	07921	ACCUMAX
DMEM-F12	ThermoFisher Scientific	11039021	or equivalent
Forceps			any suitable
HA hydrogel kit	ESI BIO	GS311	HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)
Hanks Balanced Salt Solution	Lonza	10-527F	or equivalent
Heat-inactivated fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B Hausser BrightLine	or equivalent
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H1398	or equivalent
Image processing software	Oxford Instruments	Imaris 9.3	or equivalent
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)	ThermoFisher Scientific	L3224	or equivalent
Microfluidic culture plate	Mimetas	9603-400-B	2-lane OrganoPlate
Microscope	Nikon	A1R	or equivalent
Multichannel pipette	Eppendorf	3125000036	or equivalent
PDX-derived tumor tissue			obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122	or equivalent
Perfusion rocker	Mimetas	OrganoPlate Perfusion Rocker Mini
pH strips (pH 5-9)			any suitable
Phosphate-buffered saline solution	Lonza	17-516F	or equivalent
Razor blades			any suitable
Rotating xy-shaker	VWR	Advanced 3500 Orbital Shaker	or equivalent
Scalpel handle			any suitable
Single channel repeating pipette	Eppendorf	22260201
Sterile, 15mL conical centrifuge tubes			any suitable
Sterile, 50mL conical centrifuge tubes			any suitable