Maggiore vitalità per le colture di idrogel 3D ex vivo di xenoinnesti derivati dal paziente in una piattaforma microfluidica perfusa

Riepilogo

Questo protocollo illustra i metodi per consentire una coltura estesa in vitro di xenoinnesti derivati dal paziente (PDX). Un passo migliora la vitalità complessiva delle colture di cluster multicellulari negli idrogel 3D, attraverso la semplice rimozione di singole cellule non vitali. Un passaggio secondario illustra le procedure consigliate per le impostazioni cultura PDX in una piattaforma microfluidica perfusa.

Abstract

Gli xenoinnesti derivati dal paziente (PDX), generati quando il tessuto tumorale del paziente reinsediato viene innestato direttamente in topi immunocompromessi, rimangono biologicamente stabili, preservando così le caratteristiche molecolari, genetiche e istologiche, nonché l'eterogeneità del tumore originale. Tuttavia, l'uso di questi modelli per eseguire una moltitudine di esperimenti, incluso lo screening farmacologico, è proibitivo sia in termini di costi che di tempo. I sistemi di coltura tridimensionali (3D) sono ampiamente visti come piattaforme in cui le cellule tumorali mantengono la loro integrità biologica attraverso interazioni biochimiche, morfologia e architettura. Il nostro team ha una vasta esperienza nella coltivazione di cellule PDX in vitro utilizzando matrici 3D composte da acido ialuronico (HA). Al fine di separare le cellule stromali dei fibroblasti di topo associate ai PDX, usiamo la coltura di rotazione, dove le cellule stromali aderiscono alla superficie delle placche trattate con coltura tissutale mentre le cellule tumorali PDX dissociate galleggiano e si associano in ammassi multicellulari. Fluttuanti anche nel supernatante sono singole, spesso cellule morte, che presentano una sfida nella raccolta di cluster PDX vitali per l'incapsulamento a valle in idrogel per la coltura cellulare 3D. Per separare queste singole cellule dagli ammassi di cellule vive, abbiamo impiegato la centrifugazione gradiente del passo di densità. Il protocollo qui descritto consente l'esaurimento di singole cellule non vitali dalla popolazione sana di cluster cellulari che saranno utilizzati per ulteriori sperimentazioni in vitro. Nei nostri studi, incorporiamo le colture 3D in piastre microfluidiche che consentono la perfusione dei supporti durante la coltura. Dopo aver valutato le colture risultanti utilizzando un saggio di vitalità fluorescente basato su immagini di cellule purificate rispetto a quelle non purificate, i nostri risultati mostrano che questo ulteriore passaggio di separazione ha ridotto sostanzialmente il numero di cellule non vitali dalle nostre colture.

Introduzione

Nell'ultimo decennio, il campo della ricerca sul cancro ha dimostrato un rinnovato entusiasmo per gli xenoinnesti derivati dal paziente (PDX) come strumento per valutare la dipendenza dal percorso delle cellule tumorali e la suscettibilità ai farmaci¹. I modelli PDX più comuni sono stabiliti dall'impianto sottocutaneo o ortotopico delle cellule tumorali umane - un frammento tumorale, un ammasso di cellule dissociate derivate dal tumore o un campione di cellule tumorali circolanti isolate (CTC) - in un ospite di roditori. Se il tumore "take" ha successo, le cellule xenograft proliferano, vascolarizzano e altrimenti interagiscono con il tessuto ospite per creare un tumore, che può essere raccolto a una dimensione ottimale, suddiviso e reimpiantato in altri ospiti. Tra i loro numerosi vantaggi come sistema modello, i PDX in genere mantengono una parte sostanziale dell'eterogeneità della popolazione di cellule tumorali native e consentono la valutazione delle vie specifiche dell'uomo e delle risposte^{cellulari 2,,3}. Il contesto in vivo consente l'interazione tumorale con la vascuola e altri stroma adiacenti e ricapitola caratteristiche tissutali come la dinamica di diffusione del farmaco, la tensione dell'ossigeno e l'influenza della matrice extracellulare che influenzano biologicamente e meccanicamente la progressione tumorale. Un aspetto negativo dei PDX è la loro dipendenza da un ospite di roditori, sia per l'espansione del tumore che, in ultima analisi, per il test delle ipotesi. Poiché molti PDX non possono adattarsi alla tradizionale coltura bidimensionale (2D) sul polistirolo di coltura tissutale senza perdere molte delle loro caratteristiche desiderabili, c'è stata una minima via di mezzo per i ricercatori tra questo metodo in vitro relativamente controllato e il significativo aumento delle spese, delle strutture e dei requisiti di tempo per l'uso in vivo di PDX.

Abbiamo descritto più modelli in vitro che implementano la coltura cellulare 3D all'interno di una matrice di supporto, e recentemente ampliato quel lavoro per dimostrare la coltura ex vivo di PDX derivati dal cancro alla prostata multipla (PCa), sia da soli che in co-coltura con fibroblasti derivati dal midollo^{osseo 4,,5}. Le matrici idrogel a base di acido ialuronico (HA) forniscono un supporto personalizzabile e biologicamente rilevante per entrambi i tipi di cellule, con facile controllo sulle caratteristiche dell'idrogel e chiarezza ottica per l'imaging attraverso la profondità dell'idrogel^6.

I tessuti tumorali PDX maturi comprendono una miscela variabile di cellule tumorali umane eterogenee e stroma del topo (fibroblasti, cellule endoteliali, ecc.). Per studiare i contributi specifici di tipo cellulare alla progressione tumorale in vitro, può essere vantaggioso dissociare i tumori, separare le popolazioni cellulari e incorporarle sperimentalmente in modo organizzato per sezionare percorsi di comunicazione intercellulare. Le popolazioni di cellule miste all'interno dei digestati tissutali hanno compatibilità differenziale con specifiche condizioni di coltura. Ad esempio, la vitalità dei fibroblasti associati al tumore richiede aderenza alla superficie o matrici 3D funzionalizzate con ligandi integrini, mentre le cellule PDX derivate dall'epiteliale in genere non hanno questi requisiti, favorendo invece le interazioni cellula-cellula. Queste differenze possono essere sfruttate per ottenere un'efficace separazione delle cellule PDX dalla contaminazione delle cellule stromali del topo. La coltura di rotazione dei digestati tissutali consente l'aderenza delle cellule stromali alla superficie di coltura tissutale mentre le aderenze cellulare-cellulari guidano le cellule PDX che galleggiano sopra la superficie di coltura rotante per formare ammassi multicellulari nel supernatante in 24−48 h. Le caratteristiche specifiche di questi ammassi variano con il PDX (ad esempio, ammassi grandi, stretti, altamente sferici o aggregati più piccoli e più sciolti simili a grappoli d'uva), ma sono tipicamente di dimensioni biologicamente rilevanti (50−250 μm di diametro), sufficienti per valutare le interazioni cellulari che si basano su contatti intercellulari.

Il recupero e l'elaborazione del tumore si trae inevitabilmente da un certo grado di morte cellulare collaterale, a causa di danni a breve termine dovuti a interruzioni meccaniche / enzimatiche o incompatibilità a lungo termine delle sottopopolazioni con le condizioni di coltura scelte. Nonostante l'utilità della coltura di rotazione come separazione iniziale di massa, le cellule morte o morenti vengono inevitabilmente trasferite con i cluster PDX e possono influenzare la coltura risultante. Queste cellule morte sono spesso singole cellule PDX che non sono state integrate in un ammasso, fibroblasti stromali del topo che non possono sopravvivere in condizioni di coltura selezionate, o cellule endoteliali particolarmente fragili. Tali cellule morenti possono influenzare i risultati sperimentali dei "sopravvissuti" e possono avere un impatto sostanziale sulla quantificazione, ad esempio attraverso test di screening di fattibilità fluorescenti basati su immagini. Per migliorare la selezione di cellule PDX vive da questo metodo, abbiamo adattato i metodi di centrifugazione con passaggi di densità per rimuovere facilmente singole cellule morte / morenti dalle miscele PDX e trattenere prevalentemente cluster multicellulari vivi.

Per migliorare lo studio dei cluster derivati da PDX risultanti in coltura 3D, abbiamo utilizzato una piattaforma di coltura perfusione basata sulla microfluidica, organoplate (Figura 1), che è una piattaforma organ-on-a-chip ad alta produttività che consente una coltura simultanea fino a 96 singole colture 3D perfuse su una base di piastre a microtitro a 384 pozzi(Figura 1A)^7,8. Nella piastra microfluidica a 2 corsie, un singolo chip tissutale è collegato da due canali microfluidici(Figura 1B,canale gel: rosso, canale di perfusione: blu) che si estendono su quattro pozzi di fila. I due canali microfluidici sono separati da una breve cresta di plastica chiamata Phaseguide che impedisce l'overflow di un canale nel suo canale adiacente vicino, e allo stesso tempo consente un'interfaccia priva di membrana tra il contenuto del gel e il canale di perfusione⁹. Poiché il fondo della piastra microfluidico è composto da vetro di grado microscopio, le colture possono essere visualizzate nella finestra di osservazione attraverso il fondo della piastra con un microscopio standard o automatizzato. La perfusione è stabilita nella piastra microfluidica con un rocker programmabile, utilizzando la gravità per guidare i mezzi attraverso i canali microfluidici, tra i pozzi del serbatoio (Figura 1C). Il flusso di perfusione imita più da vicino il microambiente tumorale rispetto alla coltura statica, consentendo l'incorporazione dello stress da taglio e una maggiore distribuzione di gas e sostanze nutritive. I benefici del mantenimento di una coltura cellulare tumorale perfusa nella piastra microfluidica sono stati precedentemente descritti come colture perfuse di cancro al seno che mostravano una vitalità ottimale rispetto a una coltura 3D statica delle stesse^{cellule 7}.

Il presente rapporto descrive un metodo di centrifugazione del gradiente di densità adattato per isolare i cluster PDX multicellulari vivi e dimostra la sua utilità nella creazione di colture PDX 3D all'interno di piastre microfluidiche perfusabili. Poiché un numero crescente di laboratori di ricerca sta cercando metodi per facilitare l'uso del PDX, prevediamo che i protocolli qui presentati saranno di utilità immediata.

Protocollo

Il tessuto tumorale è stato ottenuto con il consenso del paziente e secondo un protocollo approvato dell'Institutional Review Board (IRB). Gli xenografti sono stati impiantati, coltivati e raccolti secondo un protocollo accettato institutional animal care and use committee (IACUC).

NOTA: Tutto il lavoro deve essere eseguito in un armadio di sicurezza biologico sterile per mantenere la sterilità. Tutti i passaggi devono essere condotti a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione.

1. Preparazione dei materiali per la lavorazione PDX

1. Impugnatura autoclave e manico bisturi o lamette da barba.
2. Scongelare la soluzione enzimatica di dissociazione a 4 °C durante la notte o a temperatura ambiente lo stesso giorno della dissociazione tissutale.
   NOTA: Lo scongelamento a 37 °C non è consigliato, in quanto ciò può inattivare alcuni enzimi di dissociazione.
3. Preparare almeno 100 mL di terreno di coltura PDX (miscela di nutrienti medi Eagle modificata di Dulbecco F-12 [DMEM-F12] con penicillina e streptomicina 100 U/mL e 30% siero bovino fetale [FBS]) e almeno 25 mL di mezzo di lavorazione PDX (DMEM-F12 con penicillina e streptomicina 100 U/mL e senza FBS). Conservare a 4 °C fino a quando non è pronto per l'uso.

2. Dissociazione PDX e purificazione iniziale della componente stromale

1. Raccogliere utensili autoclavati, filtri cellulari da 70 μm (2−3), piatti di coltura tissutale rotonda da 60 mm (2), piastre di coltura tissutale a 6 pozzole, tubi sterili di centrifuga conica da 50 ml e soluzione salina sterile tamponata da fosfati (PBS). Coltura calda media a 37 °C e lasciare che la soluzione enzimatica di dissociazione venga a temperatura ambiente.
2. Quando il tessuto PDX ha raggiunto un diametro di 1,0−1,5 cm in un ospite del topo, rimuovere chirurgicamente il tumore dal topo con mezzi standard (ad esempio, in anestesia accettata) e conservare sul ghiaccio in un tubo da 50 ml con mezzo di coltura PDX(Figura 2A). Elaborare il tessuto prontamente, attraverso i passaggi sottostanti, per massimizzare la vitalità cellulare, preferibilmente entro 1−2 ore dalla raccolta.
3. Trasferire il tessuto tumorale in un tubo conico sterile pre-pesato da 50 ml. Risciacquare 6x con 30 mL di PBS sterile per rimuovere sangue e contaminanti. Rimuovere il più liquido possibile e pesare il tessuto tumorale.
4. Trasferire il tessuto tumorale in un piatto rotondo di coltura tissutale da 60 mm e tritare in ~ 1 mm^{3 pezzi} usando una lama di rasoio sterile o bisturi.
5. Aggiungere 5 ml di mezzo di lavorazione PDX per raccogliere liquami tumorali e trasferirli in un nuovo tubo sterile da 50 ml. Risciacquare il piatto di coltura con altri 5 ml di mezzo di lavorazione PDX, quindi con soluzione enzimatica di dissociazione (tumore 10 mL / g, almeno 5 ml), aggiungendo tutti i risciacqui al tubo da 50 ml.
6. Incubare 20 min a 37 °C con tremori delicati. Ruotare delicatamente il tubo a metà del tempo di incubazione.
7. Pipetta su e giù delicatamente con una pipetta sierologica per rompere i grumi. Celle filtranti con filtro cellulare da 70 μm posizionate su un nuovo tubo sterile da 50 ml.
   NOTA: Può essere necessario più di un colino.
8. Centrifuga a 200 x g per 5 min a celle a pellet. Rimuovere il supernatante e il resuspend in 2−3 mL di mezzo di coltura PDX. Contare le celle utilizzando un emocitometro o un contatore di celle automatizzato.
9. Utilizzare la tabella 1 per stimare il numero richiesto di cellule dissociate derivate da PDX necessarie per ottenere la densità cellulare desiderata per chip.
   NOTA: I valori della tabella 1 sono destinati ad essere un punto di partenza. I valori effettivi varieranno a causa della vitalità/cellularità dei tessuti e della perdita cellulare dovuta al congelamento / recupero. I tumori PDX sono individui anche all'interno di un dato tipo di cancro, quindi questi valori dovrebbero essere regolati empiricamente.
10. Del numero calcolato nel passaggio 2.9, piastra 1−2 x 10^{6 cellule} in 5 mL di mezzo di coltura PDX per pozzo di una piastra di coltura tissutale a 6 pozzi. Incubare (37 °C, 5% CO₂, 95% di umidità) per 48 ore con scuotimento delicato (50−55 giri/min) per promuovere la formazione di cluster(Figura 2B). Dopo che il cluster si è formato, procedere alla sezione 3 per la centrifugazione.
11. Crioconservare le cellule PDX inutilizzate dalla dissociazione iniziale in FBS 50% + 40% DMEM-F12 + 10% di solfossido di dimetile (DMSO) o un mezzo di congelamento cellulare primario disponibile in commercio.
    NOTA: Le cellule stromali del topo aderenti possono anche essere recuperate dalla superficie della piastra tissutale, se lo si desidera, risciacquando brevemente con il mezzo di coltura ed espandendosi con mezzi standard.
12. Per un uso successivo di cellule tumorali PDX crioconservate / stroma del topo, scongelare le cellule in un bagno d'acqua a 37 °C per 2 minuti. Contare e placcare in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzole come descritto al passaggio 2.10 prima di procedere alla sezione 3. Aumentare il numero di cellule PDX di ~20% per adattarsi alle perdite di vitalità dovute alla crioconservazione.

3. Separazione basata sulla centrifugazione del gradiente di densità dei cluster derivati da PDX da singole celle

1. Preparare 20 ml di soluzione gradiente di densità al 100% mescolando accuratamente 18 ml di soluzione di centrifugazione del gradiente di densità con 2 ml di soluzione salina bilanciata sterile da 10x Hanks (HBSS) in un tubo conico sterile da 50 ml. Crea soluzioni di gradiente di densità 10 mL ciascuna del 20%, 30%, 40% e 55% di densità diluendo questa soluzione al 100% con HBSS sterile 1x e mescolando bene.
   NOTA: Questi volumi sono sufficienti per due gradienti da 15 mL che possono essere utilizzati per separare ~15 x 10⁶ celle ciascuno. Se si separano meno di ~15 x 10^{6 celle,} il secondo gradiente deve essere usato come equilibrio per la centrifugazione.
2. Aggiungere 3 ml di soluzione gradiente di densità del 55% sul fondo di un tubo conico da 15 ml. Tenendo il tubo ad angolo, strato molto delicatamente 3 mL di soluzione gradiente di densità del 40% sopra lo strato del 55%, erogando lentamente il liquido sul lato angolato del tubo per evitare di mescolare gli strati. Ripetere con la soluzione gradiente di densità del 30%.
3. Raccogliere il supernatante delle colture di rotazione PDX con una pipetta sierologica da 5 mL, risciacquando delicatamente la superficie della piastra. Centrifuga a 200 x g per 2 min a celle a pellet.
4. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 3 mL di soluzione gradiente di densità del 20% in base al numero di gradienti necessari per separare le celle. Sovrapporre con cura la soluzione gradiente di densità del 20% con le celle nella parte superiore dei gradienti. Se si utilizza un solo tubo sfumato per le celle, in cima al tubo gradiente di bilanciamento con una soluzione gradiente di densità del 20% priva di celle.
5. Limitare i tubi e la centrifuga in una centrifuga del rotore a benna oscillante per 30 minuti a 4 °C, 2.000 x ge 0 freno.
6. Dopo la centrifugazione, le frazioni saranno visibili (Figura 2C). Raccogliere 2−3 ml di frazioni in tubi freschi da 15 ml. Aggiungere 3−4 volumi di HBSS sterile 1x ad ogni frazione e invertire per mescolare accuratamente.
7. Centrifuga a 1.000 x g per 3 min a celle a pellet. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 1−2 mL di mezzo di lavorazione PDX.
   NOTA: I cluster di celle PDX vitali si trovano in genere all'interfaccia della soluzione gradiente di densità 40−55%(Figura 2D) con singole cellule morte/morenti che si accumulano all'interfaccia della soluzione gradiente di densità 20−40% per la maggior parte dei PDX testati.
8. Rimuovere una piccola aliquota rappresentativa (50−100 μL) per la ria dissociazione con un volume uguale di soluzione enzimatica di dissociazione per valutare il numero di cellule nella sospensione cellulare raggruppata. Contare le celle con un emocitometro o un contatore di celle automatizzato.

4. Preparazione dell'idrogel e semina delle piastre microfluidiche

1. Ricostituire le soluzioni idrogel HA (HA modificato dal tiolo, HA-SH; diacrilato di glicole polietilenglicole tiolo-reattivo, PEGDA) secondo le istruzioni del produttore.
2. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 50 μL di HBSS a tutti i pozzi nelle colonne della finestra di osservazione (colonna 3, 7, 11, 15, 19, 23) di una piastra microfluidale a 2 corsie per mantenere l'umidità della coltura e le condizioni ottimali di imaging.
3. Calcolare il volume della sospensione cellulare dalla sezione 3 necessaria per 50 μL di idrogel alla densità cellulare desiderata (cioè 5.000 cellule/μL). Per la semina di una piastra microfluidale, aliquotare il volume calcolato in ciascuno dei 4 tubi sterili di centrifuga da 1,5 ml.
   NOTA: Gli idrogel ha un tempo fisso per la gelazione. Regolare il volume delle aliquote della soluzione di gel per l'efficienza dell'utente durante l'erogazione in caso di gelazione prematura.
4. Regolare il pH della soluzione HA-SH su 8.0 con 1 N NaOH immediatamente prima dell'uso. Eseguire una gelazione di prova mescolando 40 μL di HA-SH con 10 μL di PEGDA e monitorando la gelazione nel tempo. La gelazione inizia tipicamente 5−8 minuti dopo aver miscelato HA-SH con il reticolare PEGDA.
5. Aliquote di sospensione delle celle di centrifuga per 2 min (200 x g,temperatura ambiente) a celle a pellet. Rimuovere con cura le cellule supernatanti e resuspend nel volume appropriato di HA-SH.
   NOTA: L'idrogel finale è una soluzione HA-SH:PEGDA 4:1 (in volume), quindi le cellule devono essere rimospate in 40 μL di HA-SH per un volume finale di 50 μL.
6. Aggiungere 10 μL di PEGDA a un'aliquota di cellule in HA. Mescolare bene e attendere 1−3 min (a seconda del tempo di gelazione dal passo 4.4) prima di seminare la piastra microfluidico.
   NOTA: Consentire la reazione di gelazione dell'inizio prima della semina aiuta a ridurre al minimo la sedimentazione cellulare.
7. Apporre una punta per l'erogazione di volumi da 1,5 μL a una pipetta ripetuta a canale singolo e caricare con celle in soluzione di idrogel HA. Ricordarsi di mantenere l'aliquota dell'idrogel ben miscelata per garantire una distribuzione uniforme delle cellule.
8. Per seminare la piastra microfluidica, allineare la punta della pipetta perpendicolarmente alla piastra mentre si posiziona delicatamente la punta al centro dell'ingresso del gel (colonne 1, 5, 9, 13, 17, 21) per garantire il contatto ma nessuna pressione durante l'erogazione della soluzione di idrogel. Lavorando rapidamente per prevenire la solidificazione prematura dell'idrogel, erogare 1,5 μL di soluzione di gel in ogni ingresso di gel.
9. Osservare lo stato di riempimento dei canali microfluidici visualizzando dalla parte superiore della piastra, dal fondo della piastra o al microscopio e valutare il carico, utilizzando la figura 3 come guida (caricamento riuscito nella figura 3A, guida al posizionamento del tubo nella figura 3B, caricamento mancato nella figura 3C, non riempito per terminare nella figura 3D, overflow nella figura 3E). Identificare eventuali regolazioni necessarie nella tecnica che possono migliorare il successo del riempimento per la prossima tornata di chip (vedere la discussione per i suggerimenti per la risoluzione dei problemi).
10. Ripetere i passaggi 4.6−4.9 con le restanti 3 aliquote di cellule in soluzione HA. Invertire il piatto mentre si prepara l'aliquota successiva (~ 1 min).
    NOTA: Il tempo di attesa di 1 minuto e l'inversione della piastra migliorano la distribuzione 3D delle cellule riducendo la sedimentazione cellulare man mano che si verifica la gelazione.
11. Dopo aver riempito tutti i trucioli, incubare la piastra a 37 °C in un'incubatrice umidificata fino al completamento della gelazione (~ 45 min).
12. Utilizzando il manuale fornito, assicurarsi che il rocker perfusione sia installato nell'incubatore di coltura cellulare con le corrette impostazioni di perfusione (angolo di 14°, intervalli di 4 minuti).
13. Aggiungere 50 μL di mezzo di coltura PDX a tutte le entrate medie (colonne 2, 6, 10, 14, 18, 22) e verificare se i canali sono stati riempiti correttamente capovolgendo la piastra. Toccare delicatamente la piastra contro una superficie per incoraggiare il liquido a riempire i canali microfluidici.
14. Aggiungere 50 μL di DMEM-F12 (10% FBS) per tutte le uscite medie (colonna 4, 8, 12, 16, 20, 24). Se nel canale di perfusione sono intrappolate bolle d'aria, rimuovere toccando delicatamente la piastra contro una superficie.
15. Utilizzando un modulo di layout al microscopio e a piastre (Figura supplementare 1), registrare il successo del riempimento dei truciolo. Escludere i trucioli riempiti in modo improprio da ulteriori usi sperimentali.
16. Posizionare la piastra su un rocker basculante impostato su un'inclinazione di 14 ° e un ciclo di 4 minuti per iniziare la perfusione. Sostituire il mezzo di coltura PDX ogni 2 giorni (prima 50 μL in ingresso, quindi 50 μL in uscita).

5. Colorazione cellulare, imaging e quantificazione delle immagini

1. Preparare una soluzione di dosaggio di vitalità cellulare contenente tre coloranti fluorescenti (Hoechst 33342, etidium homodimer-1, calcein acetoxymethyl [AM]).
   1. Preparare le soluzioni stock di ogni colorante come segue: Hoechst 33342 a 1,6 mM (1 mg/mL) in acqua deionizzata; calceina AM a 4 mM in DMSO anidro; etidio omodimero-1 a 2 mM in DMSO/H₂O (1:4, v/v).
      NOTA: Le soluzioni stock calcein AM ed ethidium homodimer-1 sono fornite nel kit indicato in Table of Materials.
   2. Preparare un'unica soluzione di lavoro in HBSS o fenolo senza rosso, contenente tutti e tre i coloranti. Ottimizzare la concentrazione di lavoro finale per ogni tipo di cella e matrice, all'interno degli intervalli di 1,6−8,0 μM per Hoechst 33342, 0,1−10 μM per la calceina AM e 0,1−10 μM per l'omodimero di etidio-1.
2. Rimuovere il mezzo di coltura e applicare la soluzione di colorante di vitalità di lavoro ai trucioli microfluidici desiderati (75 μL in ingresso, 25 μL in uscita) e riposizionare sul rocker perfusione nell'incubatore di coltura cellulare per 1 h.
3. Immagini le finestre di osservazione delle colture macchiate utilizzando un microscopio confocale manuale o automatizzato(Tabella dei materiali)con filtri fluorescenti (elencati come lunghezze d'onda di eccitazione/emissione, in nm) per osservare tutti i nuclei (Hoechst 33342, 350/461), nuclei cellulari morti (etidium homodimer-1, 528/617) e citoplasma cellulare vivo (calceina AM, 494/517).
4. Cattura pile Z da 140 μm con una dimensione del passo di ≤1 μm usando un obiettivo di aria 20x. Sono necessari tre campi di visualizzazione per visualizzare l'intero microcanale con una piccola quantità di sovrapposizione. Per evitare il doppio campionamento, immagini solo due campi di visualizzazione per chip.
   NOTA: Le condizioni di imaging devono essere ottimizzate per garantire un corretto campionamento NyQuist. Nell'esperienza degli autori, un sistema di imaging veloce, basato sulla deconvoluzione di una sorgente di epifluorescenza convenzionale o sulla modalità di scansione della risonanza su un confocale, è necessario per saggiare completamente una pila Z completa, con tre colori laser, su 96 chip su una piastra entro un ragionevole lasso di tempo (circa 3,5 ore con imaging automatico, inclusa la configurazione).
5. Utilizzando il software di analisi delle immagini, dite le immagini dello stack Z per i dati quantificati desiderati, come morfologia, stato di aggregazione o altre funzionalità. Per quantificare la vitalità delle cellule, contare il numero di globuli morti (rosso) e nuclei cellulari totali (blu).

Risultati

Un rocker perfusione programmabile è stato preparato in un incubatore standard di coltura cellulare jackato ad acqua e piastre microfluidiche a due corsie sono state preparate in un armadio standard di biosicurezza per il carico(figura 1). Un tumore PDX MDA-PCA-118b è stato espanso in vivo, raccolto quando aveva raggiunto una dimensione massima e dissociato come descritto nella sezione 2 del protocollo per creare una sospensione liquama delle cellule, a circa uno stato a singola cellula (<...

Discussione

Qui descriviamo un metodo per elaborare e coltivare cellule tumorali vitali derivate da PDX in un sistema di coltura 3D ad alta produttività e perfuso. Mentre questo protocollo utilizza tessuto PCa PDX, è ugualmente efficace per altri tumori derivati epiteliali. Le caratteristiche tumorali variano tra le singole linee PDX anche all'interno dello stesso tessuto di origine (prostata, seno, ecc.). Alcune linee PCa PDX sono più fibrotiche e difficili da isolare le cellule vitali mentre altre sono più cellulari. La dimens...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1N NaOH			any suitable tissue culture grade
60 mm round tissue culture dishes			any suitable
6-well tissue culture plates			any suitable
70 µm cell strainers	Corning	431751	or equivalent
Centrifuge	Eppendorf	5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes	or equivalent
Density gradient centrifugation solution	Millipore Sigma	P1644	Percoll
Dimethylsulfoxide			any suitable tissue culture grade
Dissociation enzyme solution	StemCell Technologies	07921	ACCUMAX
DMEM-F12	ThermoFisher Scientific	11039021	or equivalent
Forceps			any suitable
HA hydrogel kit	ESI BIO	GS311	HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)
Hanks Balanced Salt Solution	Lonza	10-527F	or equivalent
Heat-inactivated fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B Hausser BrightLine	or equivalent
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H1398	or equivalent
Image processing software	Oxford Instruments	Imaris 9.3	or equivalent
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)	ThermoFisher Scientific	L3224	or equivalent
Microfluidic culture plate	Mimetas	9603-400-B	2-lane OrganoPlate
Microscope	Nikon	A1R	or equivalent
Multichannel pipette	Eppendorf	3125000036	or equivalent
PDX-derived tumor tissue			obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122	or equivalent
Perfusion rocker	Mimetas	OrganoPlate Perfusion Rocker Mini
pH strips (pH 5-9)			any suitable
Phosphate-buffered saline solution	Lonza	17-516F	or equivalent
Razor blades			any suitable
Rotating xy-shaker	VWR	Advanced 3500 Orbital Shaker	or equivalent
Scalpel handle			any suitable
Single channel repeating pipette	Eppendorf	22260201
Sterile, 15mL conical centrifuge tubes			any suitable
Sterile, 50mL conical centrifuge tubes			any suitable