Verbesserte Lebensfähigkeit für Ex vivo 3D Hydrogelkulturen von patientenabgeleiteten Xenografts in einer perfused Microfluidic Platform

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt Methoden, um eine erweiterte In-vitro-Kultur von patientenabgeleiteten Xenografts (PDX) zu ermöglichen. Ein Schritt verbessert die Gesamtlebensfähigkeit von mehrzelligen Clusterkulturen in 3D-Hydrogelen durch die einfache Entfernung nicht lebensfähiger Einzelzellen. Ein sekundärer Schritt veranschaulicht Best Practices für PDX-Kultur in einer durchsetzten mikrofluidischen Plattform.

Zusammenfassung

Patienten-abgeleitete Xenografts (PDX), die entstehen, wenn resektiertes Tumorgewebe des Patienten direkt in immungeschwächte Mäuse eingepfropft wird, bleiben biologisch stabil, wodurch molekulare, genetische und histologische Merkmale sowie Heterogenität des ursprünglichen Tumors erhalten bleiben. Die Verwendung dieser Modelle zur Durchführung einer Vielzahl von Experimenten, einschließlich des Drogenscreenings, ist jedoch sowohl in Bezug auf die Kosten als auch auf die Zeit unerschwinglich. Dreidimensionale (3D) Kultursysteme werden weithin als Plattformen betrachtet, in denen Krebszellen ihre biologische Integrität durch biochemische Wechselwirkungen, Morphologie und Architektur behalten. Unser Team verfügt über umfangreiche Erfahrung in der Kultivierung von PDX-Zellen in vitro mit 3D-Matrizen aus Hyaluronsäure (HA). Um mit PDXs assoziierte Maus-Fibroblasten-Stromalzellen zu trennen, verwenden wir Rotationskultur, bei der Stromalzellen an der Oberfläche von gewebekulturbehandelten Platten haften, während dissoziierte PDX-Tumorzellen schweben und sich selbst zu multizellulären Clustern verbinden. Ebenfalls im Überstand schweben einzelne, oft abgestorbene Zellen, die eine Herausforderung darstellen, lebensfähige PDX-Cluster für die nachgeschaltete Verkapselung in Hydrogele für die 3D-Zellkultur zu sammeln. Um diese Einzelzellen von lebenden Zellclustern zu trennen, haben wir die Zentrifuge des Dichteschrittgradienten eingesetzt. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Erschöpfung nicht lebensfähiger Einzelzellen aus der gesunden Population von Zellclustern, die für weitere In-vitro-Experimente verwendet werden. In unseren Studien integrieren wir die 3D-Kulturen in mikrofluidische Platten, die eine Mediendurchblutung während der Kultur ermöglichen. Nach der Bewertung der resultierenden Kulturen unter Verwendung eines fluoreszierenden bildbasierten Lebensfähigkeits-Assays von gereinigten versus nicht gereinigten Zellen zeigen unsere Ergebnisse, dass dieser zusätzliche Trennungsschritt die Anzahl der nicht lebensfähigen Zellen aus unseren Kulturen erheblich reduziert hat.

Einleitung

In den letzten zehn Jahren hat der Bereich der Krebsforschung eine erneute Begeisterung für patientenabgeleitete Xenografts (PDXs) als Instrument zur Beurteilung der Abhängigkeit von Krebszellsignalen und der Arzneimittelanfälligkeit¹gezeigt. Die gängigsten PDX-Modelle werden durch subkutane oder orthotopische Implantation menschlicher Tumorzellen – ein Tumorfragment, ein Cluster dissoziierter Tumorzellen oder eine Probe isolierter zirkulierender Tumorzellen (CTCs) – in einen Nagetierwirt etabliert. Wenn der Tumor "nehmen" erfolgreich ist, vermehren sich die Xenograft-Zellen, vermehren sich und interagieren auf andere Weise mit dem Wirtsgewebe, um einen Tumor zu erzeugen, der in einer optimalen Größe geerntet, unterteilt und wieder in andere Wirte eingepflanzt werden kann. Unter ihren vielen Vorteilen als Modellsystem behalten PDXs in der Regel einen wesentlichen Teil der Heterogenität der nativen Tumorzellpopulation bei und ermöglichen die Beurteilung von humanspezifischen Bahnen und Zellreaktionen^2,3. Der in vivo-Kontext ermöglicht die Tumorinteraktion mit vaskulaturundig und anderen angrenzenden Stroma und rekapituliert Gewebeeigenschaften wie Arzneimitteldiffusionsdynamik, Sauerstoffspannung und extrazelluläre Matrixbeeinflussen, die die Tumorprogression biologisch und mechanisch beeinflussen. Ein negativer Aspekt von PDXs ist ihre Abhängigkeit von einem Nagetier-Wirt, sowohl für die Tumorexpansion als auch letztlich für Hypothesentests. Da sich viele PDX nicht an die traditionelle zweidimensionale (2D) Kultur auf Gewebekultur-Polystyrol anpassen können, ohne viele ihrer wünschenswerten Eigenschaften zu verlieren, gibt es für Forscher einen minimalen Mittelweg zwischen dieser relativ kontrollierten In-vitro-Methode und dem signifikanten Anstieg der Kosten, Einrichtungen und Zeitanforderungen für die In-vivo-PDX-Nutzung.

Wir haben mehrere In-vitro-Modelle beschrieben, die 3D-Zellkultur innerhalb einer unterstützenden Matrix implementieren, und vor kurzem erweitert, dass arbeite, um die Ex-vivo-Kultur von multiplem Prostatakrebs (PCa)-abgeleiteten PDXs zu demonstrieren, sowohl allein als auch in Co-Kultur mit Knochenmark-abgeleiteten Fibroblasten^4,5. Hyaluronsäure (HA)-basierte Hydrogelmatrizen bieten anpassbare und biologisch relevante Unterstützung für beide Zelltypen, mit leichter Kontrolle über Hydrogeleigenschaften und optischer Klarheit für die Bildgebung durch die Hydrogeltiefe⁶.

Reife PDX-Tumorgewebe bestehen aus einer variablen Mischung aus heterogenen menschlichen Krebszellen und Mausstroma (Fibroblasten, Endothelzellen usw.). Um zelltypspezifische Beiträge zur Tumorprogression in vitro zu untersuchen, kann es vorteilhaft sein, Tumore zu dissoziieren, die Zellpopulationen zu trennen und experimentell in organisierter Weise zu integrieren, um Wege der interzellulären Kommunikation zu sezieren. Die gemischten Zellpopulationen in Gewebeverdauungen haben eine Differentialverträglichkeit mit bestimmten Kulturbedingungen. Beispielsweise erfordert die tumorassoziierte Fibroblasten-Lebensfähigkeit entweder die Oberflächenhaftung oder 3D-Matrizen, die mit Integrin-Liganden funktionalisiert sind, während epitheliale abgeleitete PDX-Zellen in der Regel nicht diese Anforderungen haben, sondern Zell-Zell-Wechselwirkungen bevorzugen. Diese Unterschiede können genutzt werden, um eine effektive Trennung von PDX-Zellen von kontaminierenden Mausstromalzellen zu erreichen. Die Rotationskultur von Gewebeverdauten ermöglicht die Anhaftung von Stromalzellen an der Gewebekulturoberfläche, während Zellzellverklebungen PDX-Zellen, die über der rotierenden Kulturoberfläche schweben, dazu bewegen, in 24 bis 48 h mehrzellige Cluster im Überstand zu bilden. Die spezifischen Eigenschaften dieser Cluster variieren mit dem PDX (z. B. große, enge, stark sphärische Cluster oder kleinere, lockerere Aggregate, die Traubentrauben ähneln), sind aber typischerweise biologisch relevant (Durchmesser 50 bis 250 m), ausreichend für die Beurteilung zellulärer Wechselwirkungen, die auf interzellulären Kontakten beruhen.

Tumor-Retrieval und -Verarbeitung führt unweigerlich zu einem gewissen Grad an Kollateralzelltod, entweder aufgrund kurzfristiger Schäden durch mechanische/enzymatische Störungen oder aufgrund langfristiger Inkompatibilität von Subpopulationen mit den gewählten Kulturbedingungen. Trotz der Nützlichkeit der Rotationskultur als anfängliche Massentrennung werden tot- oder sterbende Zellen unweigerlich mit den PDX-Clustern übertragen und können die resultierende Kultur beeinflussen. Bei diesen abgestorbenen Zellen handelt es sich oft um einzelne PDX-Zellen, die nicht in einen Cluster integriert waren, mausstromaler Fibroblasten, die unter ausgewählten Kulturbedingungen nicht überleben können, oder besonders fragile Endothelzellen. Solche sterbenden Zellen können experimentelle Ergebnisse von "Überlebenden" beeinflussen und die Quantifizierung wesentlich beeinflussen, z. B. durch fluoreszierende bildbasierte Durchführbarkeits-Screening-Assays. Um die Auswahl lebender PDX-Zellen aus dieser Methode zu verbessern, haben wir Zentrifugationsmethoden mit Dichteschritten angepasst, um einzelne abgestorbene/sterbende Zellen einfach aus PDX-Mischungen zu entfernen und überwiegend lebende mehrzellige Cluster zu behalten.

Um die Untersuchung von resultierenden PDX-abgeleiteten Clustern in der 3D-Kultur zu verbessern, haben wir eine mikrofluidics-basierte Perfusionskulturplattform verwendet, die OrganoPlate (Abbildung 1), die eine Hochdurchsatz-Organ-on-a-Chip-Plattform ist, die eine gleichzeitige Kultur von bis zu 96 einzelnen perfundierten 3D-Kulturen auf einer 384-well Mikrotiter-Plattenbasis ermöglicht (Abbildung 1A)^7,8. In der 2-spurigen mikrofluidischen Platte wird ein einzelner Gewebechip durch zwei mikrofluidische Kanäle(Abbildung 1B, Gelkanal: rot, Perfusionskanal: blau) verbunden, die vier Brunnen hintereinander umfassen. Die beiden mikrofluidischen Kanäle sind durch einen kurzen Kunststoffrücken, den sogenannten Phaseguide, getrennt, der das Überlaufen eines Kanals in den angrenzenden Nachbarkanal verhindert und gleichzeitig eine membranfreie Schnittstelle zwischen dem Inhalt des Gels und dem Perfusionskanal⁹ermöglicht. Da der Boden der mikrofluidischen Platte aus mikroskopischem Glas besteht, können die Kulturen im Beobachtungsfenster durch den Boden der Platte mit einem Standard- oder automatisierten Mikroskop betrachtet werden. Perfusion wird in der mikrofluidischen Platte mit einer programmierbaren Wippe etabliert, mit Schwerkraft, um Medien durch die mikrofluidischen Kanäle zu treiben, zwischen Reservoirbrunnen (Abbildung 1C). Die Perfusions-Flow-Mimik rekapituliert die Tumormikroumgebung genauer als die statische Kultur, was die Einbeziehung von Scherspannung und eine verbesserte Verteilung von Gasen und Nährstoffen ermöglicht. Die Vorteile der Aufrechterhaltung einer durchbluteten Krebszellkultur in der mikrofluidischen Platte wurden zuvor als durchfundierte Brustkrebskulturen beschrieben, die eine optimale Lebensfähigkeit im Vergleich zu einer statischen 3D-Kultur der gleichen Zellen aufwiesen⁷.

Der vorliegende Bericht beschreibt eine angepasste Methode zur Zentrifugierung des Dichtegradienten zur Isolierung von lebenden mehrzelligen PDX-Clustern und demonstriert deren Nutzen bei der Etablierung von 3D-PDX-Kulturen innerhalb durchdringender mikrofluidischer Platten. Da immer mehr Forschungslaboratorien nach Methoden suchen, um die Verwendung von PDX zu erleichtern, gehen wir davon aus, dass die hier vorgestellten Protokolle sofort von Nutzen sein werden.

Protokoll

Tumorgewebe wurde mit Zustimmung des Patienten und gemäß einem genehmigten Institutional Review Board (IRB) Protokoll erhalten. Xenografts wurden gemäß einem akzeptierten Protokoll des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) implantiert, angebaut und geerntet.

HINWEIS: Alle Arbeiten sind in einem sterilen biologischen Sicherheitsschrank durchzuführen, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Alle Schritte sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.

1. Herstellung von Materialien für die PDX-Verarbeitung

1. Autoklavzangen und Skalpellgriff oder Rasierklingen.
2. Enzymlösung bei 4 °C über Nacht oder bei Raumtemperatur am selben Tag wie Gewebedissoziation auftauen.
   HINWEIS: Das Auftauen bei 37 °C ist nicht ratsam, da dies einige Dissoziationsenzyme inaktivieren kann.
3. Bereiten Sie mindestens 100 ml PDX-Kulturmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Mittelnährstoffgemisch F-12 [DMEM-F12] mit 100 U/ml Penicillin und Streptomycin und 30% fetales Rinderserum [FBS]) und mindestens 25 ml PDX-Verarbeitungsmedium (DMEM-F12 mit 100 U/ml Penicillin und Streptomycin und ohne FBS). Bei 4 °C lagern, bis sie einsatzbereit sind.

2. PDX-Dissoziation und Erstreinigung der Stromalkomponente

1. Sammeln Sie autoklavierte Utensilien, 70 m Zellsiebe (2x3), 60 mm runde Gewebekulturschalen (2), 6-Well-Gewebekulturplatten, sterile 50 ml konische Zentrifugenröhren und sterile 1x phosphatgepufferte Kochchen (PBS). Wärmekultur medium bis 37 °C und ermöglichen Dissoziationsenzymlösung auf Raumtemperatur zu kommen.
2. Wenn PDX-Gewebe in einem Mauswirt einen Durchmesser von 1,0 x 1,5 cm erreicht hat, entfernen Sie den Tumor mit Standardmitteln (z.B. unter akzeptierter Anästhesie) operativ von der Maus und lagern Sie auf Eis in einem 50 ml-Rohr mit PDX-Kulturmedium(Abbildung 2A). Verarbeiten Sie das Gewebe umgehend, über die folgenden Schritte, um die Zelllebensfähigkeit zu maximieren, vorzugsweise innerhalb von 1 x 2 h nach der Ernte.
3. Übertragen Sie Tumorgewebe in ein vorgewogenes steriles 50 ml konisches Rohr. Spülen Sie 6x mit 30 ml sterilem PBS, um Blut und Verunreinigungen zu entfernen. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich und wiegen Sie das Tumorgewebe.
4. Übertragen Sie Tumorgewebe in eine 60 mm runde Gewebekulturschale und hacken Sie mit einer sterilen Rasierklinge oder einem Skalpell in 1 mm³ Stück.
5. Fügen Sie 5 ml PDX-Verarbeitungsmedium hinzu, um Tumorschlämme zu sammeln und in ein neues steriles 50 ml-Rohr zu übertragen. Spülen Sie die Kulturschale mit weiteren 5 ml PDX-Verarbeitungsmedium, dann mit Dissoziationsenzymlösung (10 ml/g Tumor, mindestens 5 ml), wobei alle Spülungen in das 50 ml-Rohr hinzugefügt werden.
6. 20 min bei 37 °C mit sanftem Schütteln bebrüten. Wirbeln Sie das Rohr vorsichtig auf halbem Weg durch die Inkubationszeit.
7. Pipette sanft mit einer serologischen Pipette auf und ab, um Klumpen aufzubrechen. Filterzellen mit einem 70 m Zellsieb, das über ein neues steriles 50 ml-Rohr gelegt wird.
   HINWEIS: Es kann mehrere Sieb erforderlich sein.
8. Zentrifuge bei 200 x g für 5 min zu Pelletzellen. Entfernen Sie überstand und resuspendieren in 2 x 3 ml PDX-Kulturmedium. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
9. Verwenden Sie Tabelle 1, um die erforderliche Anzahl von dissoziierten PDX-abgeleiteten Zellen zu schätzen, die erforderlich sind, um die gewünschte Zelldichte pro Chip zu erreichen.
   HINWEIS: Die Werte in Tabelle 1 sollen ein Ausgangspunkt sein. Die tatsächlichen Werte variieren aufgrund der Gewebelebensfähigkeit/Zelllichkeit und des Zellverlusts durch Einfrieren/Recovery. PDX-Tumoren sind Individuen sogar innerhalb eines bestimmten Krebstyps, daher sollten diese Werte empirisch angepasst werden.
10. Von der zahl berechnet in Schritt 2.9, Platte 1-2 x 10⁶ Zellen in 5 ml PDX Kulturmedium pro Brunnen einer 6-Well-Gewebekulturplatte. Inkubieren (37 °C, 5%_CO2,95% Luftfeuchtigkeit) für 48 h mit sanftem Schütteln (50-55 Rpm) zur Förderung der Clusterbildung(Abbildung 2B). Nachdem sich der Cluster gebildet hat, fahren Sie mit Abschnitt 3 für die Zentrifugierung fort.
11. Kryokonservieren Sie nicht verwendete PDX-Zellen aus der anfänglichen Dissoziation in 50% FBS + 40% DMEM-F12 + 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) oder einem kommerziell erhältlichen Primärzellgefriermedium.
    HINWEIS: Anhaftende Mausstromalzellen können auf Wunsch auch von der Gewebeplattenoberfläche zurückgewonnen werden, indem sie kurz mit Kulturmedium spülen und sich standardmäßig ausdehnen.
12. Für die spätere Verwendung von kryokonservierten PDX-Tumorzellen/Mausstroma, Tauen Zellen in einem 37 °C Wasserbad für 2 min. Anzahl und Platte in einer 6-Well-Gewebekulturplatte, wie in Schritt 2.10 beschrieben, bevor sie zu Abschnitt 3 übergehen. Erhöhen Sie die Anzahl der PDX-Zellen um 20 %, um Lebensfähigkeitsverluste durch Kryokonservierung zu bewältigen.

3. Dichtegradientzentrifugationsbasierte Trennung von PDX-abgeleiteten Clustern von einzelnen Zellen

1. Bereiten Sie 20 ml 100% Dichtegradientenlösung vor, indem Sie 18 ml Dichtegradientenzentrifugationslösung mit 2 ml steriler 10x Hanks' balanced salt solution (HBSS) in einem sterilen 50 ml konischen Rohr gründlich mischen. Machen Sie 10 ml von je 20%, 30%, 40% und 55% Dichte Gradientenlösungen, indem Sie diese 100% Lösung mit sterilen 1x HBSS verdünnen und gut mischen.
   ANMERKUNG: Diese Volumina sind ausreichend für zwei 15 ml Gradienten, die verwendet werden können, um jeweils 15 x 10⁶ Zellen zu trennen. Wenn weniger als 15 x 10⁶ Zellen getrennt werden, sollte der zweite Gradient als Balance für die Zentrifugation verwendet werden.
2. Fügen Sie 3 ml mit 55% Dichtegradientenlösung an den Boden eines 15 ml konischen Rohres. Halten Sie das Rohr in einem Winkel, sehr vorsichtigSchicht 3 ml 40% Dichte Gradient lösung auf der Oberseite der 55% Schicht, langsam die Flüssigkeit auf die abgewinkelte Seite des Rohres, um das Mischen der Schichten zu vermeiden. Wiederholen Sie dies mit der 30%igen Gradientenlösung.
3. Sammeln Sie den Überstand von PDX-Rotationskulturen mit einer 5 ml serologischen Pipette, die Plattenoberfläche sanft spült. Zentrifuge bei 200 x g für 2 min zu Pelletzellen.
4. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 3 ml mit 20 % Dichtegradientenlösung entsprechend der Anzahl der Gradienten wieder auf, die zum Trennen der Zellen erforderlich sind. Schichtung einer 20%igen Dichtegradientenlösung mit Zellen auf der Oberseite des/der Gradienten(s). Wenn Sie nur ein Gradientenrohr für Zellen verwenden, überfordern Sie das BalanceGradientenrohr mit einer zellfreien 20%igen Dichtegradientenlösung.
5. Kappen Sie die Rohre und zentrifugen in einer Schwenkschaufel-Rotorzentrifuge für 30 min bei 4 °C, 2.000 x gund 0 Bremse.
6. Nach der Zentrifugation sind Brüche sichtbar (Abbildung 2C). Sammeln Sie 2 x 3 ml Fraktionen in frische 15 ml Rohre. Fügen Sie 3 x 4 Volumen sterilen 1x HBSS zu jeder Fraktion hinzu und invertieren Sie es gründlich.
7. Zentrifuge bei 1.000 x g für 3 min zu Pelletzellen. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 1 x 2 ml PDX-Verarbeitungsmedium wieder auf.
   HINWEIS: Lebensfähige PDX-Zellcluster finden sich in der Regel an der 40-55%-Dichtegradientenlösungsschnittstelle (Abbildung 2D) mit einzelnen abgestorbenen/sterbenden Zellen, die sich bei den meisten getesteten PDXs an der 20-40%igen Dichtegradientenlösungsschnittstelle ansammeln.
8. Entfernen Sie ein kleines, repräsentatives Aliquot (50-100 L) zur wiederdissoziation mit einem gleichen Volumen der Dissoziationsenzymlösung, um die Zellzahl in der geclusterten Zellsuspension zu bewerten. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.

4. Hydrogelzubereitung und mikrofluidische Plattenaussaat

1. Rekonstituieren HA Hydrogel-Lösungen (thiol-modifizierte HA, HA-SH; Thiol-reaktives Polyethylenglykoldiakrylat, PEGDA) nach den Anweisungen des Herstellers.
2. Mit einer Mehrkanalpipette fügen Sie 50 L HBSS zu allen Brunnen in Beobachtungsfenstersäulen (Spalte 3, 7, 11, 15, 19, 23) einer 2-spurigen mikrofluidischen Platte hinzu, um die Kulturfeuchtigkeit und optimale Bildgebungsbedingungen aufrechtzuerhalten.
3. Berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension aus Abschnitt 3, der für 50 l Hydrogel bei der gewünschten Zelldichte benötigt wird (d. h. 5.000 Zellen/L). Für die Aussaat einer mikrofluidischen Platte wird das berechnete Volumen in jeweils 4 sterile 1,5 ml Zentrifugenrohre einfließen lassen.
   HINWEIS: HA-Hydrogele haben eine feste Zeit bis zur Gelation. Passen Sie das Volumen der Gellösung aliquots für die Benutzereffizienz bei der Abgabe, wenn vorzeitige Gelation auftritt.
4. Stellen Sie den pH-Wert der HA-SH-Lösung unmittelbar vor der Anwendung auf 8,0 mit 1 N NaOH ein. Führen Sie eine Testgelation durch, indem Sie 40 l HA-SH mit 10 l PEGDA mischen und die Gelation im Laufe der Zeit überwachen. Die Gelation beginnt in der Regel 5-8 min nach dem Mischen von HA-SH mit dem PEGDA-Verklinker.
5. Zentrifugenzellsuspension aliquots für 2 min (200 x g, Raumtemperatur) zu Pelletzellen. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und setzen Sie die Zellen im entsprechenden Volumen von HA-SH wieder auf.
   ANMERKUNG: Das Endhydrogel ist eine 4:1 HA-SH:PEGDA-Lösung (nach Volumen), so dass Zellen in 40 l HA-SH für ein Endvolumen von 50 l resuspendiert werden sollten.
6. Fügen Sie 10 L PEGDA zu einem Aliquot von Zellen in HA hinzu. Gut mischen und 1 bis 3 min (je nach Gelationszeit ab Schritt 4.4) abwarten, bevor sie die mikrofluidische Platte säen.
   HINWEIS: Das Zulassen der Gelationsreaktion des Beginns vor der Aussaat hilft, die Zellabsetzung zu minimieren.
7. Befestigen Sie eine Spitze für die Abgabe von 1,5 L-Volumen auf eine einkanalige, sich wiederholende Pipette und Lastmitzellen mit Zellen in HA-Hydrogellösung. Denken Sie daran, das Hydrogel aliquot gut gemischt zu halten, um eine gleichmäßige Zellverteilung zu gewährleisten.
8. Um die mikrofluidische Platte auszusäen, richten Sie die Pipettespitze senkrecht zur Platte aus, während Sie die Spitze vorsichtig in die Mitte des Geleinlasses legen (Säulen 1, 5, 9, 13, 17, 21), um kontaktzufinden, aber keinen Druck bei der Abgabe der Hydrogellösung zu gewährleisten. Arbeiten Sie schnell, um eine vorzeitige Hydrogelerstarrung zu verhindern, geben Sie 1,5 l Gellösung in jeden Geleinlass.
9. Beobachten Sie den Füllstatus der mikrofluidischen Kanäle, indem Sie von der Oberseite der Platte, unten der Platte oder durch das Mikroskop betrachten, und bewerten Sie die Belastung anhand von Abbildung 3 als Leitfaden (erfolgreiche Belastung in Abbildung 3A, Pipet-Positionierungsführung in Abbildung 3B, verpasste Belastung in Abbildung 3C, nicht gefüllt bis zum Ende in Abbildung 3D, Überlauf in Abbildung 3E). Identifizieren Sie alle erforderlichen Anpassungen in der Technik, die den Füllerfolg für die nächste Chipsrunde verbessern können (siehe Diskussion für Tipps zur Fehlerbehebung).
10. Wiederholen Sie die Schritte 4.6-4.9 mit den verbleibenden 3 Aliquots von Zellen in HA-Lösung. Invertieren Sie die Platte während der Vorbereitung der nächsten Aliquot (ca. 1 min).
    HINWEIS: Die 1 min Wartezeit und Die Umkehrung der Platte verbessern die 3D-Verteilung der Zellen, indem sie die Zellabsetzung reduzieren, wenn die Gelation auftritt.
11. Nachdem alle Chips gefüllt sind, inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator, bis die Gelation abgeschlossen ist (ca. 45 min).
12. Stellen Sie mit dem mitgelieferten Handbuch sicher, dass die Perfusionswippe im Zellkultur-Inkubator mit den richtigen Perfusionseinstellungen (14° Winkel, 4 min Intervalle) installiert ist.
13. Fügen Sie 50 L PDX-Kulturmedium zu allen mittleren Einlässen hinzu (Spalten 2, 6, 10, 14, 18, 22) und überprüfen Sie, ob die Kanäle ordnungsgemäß gefüllt sind, indem Sie die Platte umdrehen. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte an einer Oberfläche, um die Flüssigkeit zu ermutigen, die mikrofluidischen Kanäle zu füllen.
14. Fügen Sie 50 l DMEM-F12 (10% FBS) für alle mittleren Auslässe hinzu (Spalte 4, 8, 12, 16, 20, 24). Wenn Luftblasen im Perfusionskanal gefangen sind, entfernen Sie, indem Sie die Platte vorsichtig gegen eine Oberfläche tippen.
15. Mit hilfe eines Mikroskops und Plattenlayout-Formular (Ergänzungsabbildung 1), Rekord Chip Füllung Erfolg. Nicht ordnungsgemäß gefüllte Chips von der weiteren experimentellen Verwendung ausschließen.
16. Legen Sie die Platte auf eine Kippwippe, die auf eine Neigung von 14° und einen Zyklus von 4 min eingestellt ist, um mit der Durchblutung zu beginnen. Ersetzen Sie das PDX-Kulturmedium alle 2 Tage (zuerst 50 l im Einlass, dann 50 l im Ausgang).

5. Zellfärbung, Bildgebung und Bildquantifizierung

1. Bereiten Sie eine Zelllebensfähigkeits-Assay-Lösung vor, die drei fluoreszierende Farbstoffe enthält (Hoechst 33342, Ethidium homodimer-1, Calceinacetoxymethyl [AM]).
   1. Bereiten Sie Die Lagerlösungen für jeden Farbstoff wie folgt vor: Hoechst 33342 bei 1,6 mM (1 mg/ml) in entionisiertem Wasser; Calcein AM bei 4 mM in wasserfreiem DMSO; ethidium homodimer-1 bei 2 mM in DMSO/H_{2 O}(1:4, v/v).
      HINWEIS: Die Lagercalcein AM und Ethidium homodimer-1 Lösungen sind in der angegebenen Kit in Tabelle der Materialienzur Verfügung gestellt.
   2. Bereiten Sie eine einzige Arbeitslösung in HBSS oder phenolrot-freiem Medium vor, das alle drei Farbstoffe enthält. Optimieren Sie die Endarbeitskonzentration für jeden Zelltyp und jede Matrix im Bereich von 1,6 x 8,0 m für Hoechst 33342, 0,1 x 10 m für Calcein AM und 0,1 x 10 m für Ethidium homodimer-1.
2. Entfernen Sie das Kulturmedium und wenden Sie die Schmelzbarkeits-Farbstofflösung auf die gewünschten mikrofluidischen Chips (75 l im Einlass, 25 l im Ausgang) an und legen Sie sie für 1 h wieder auf die Perfusionswippe im Zellkultur-Inkubator.
3. Die Beobachtungsfenster der gebeizten Kulturen mit einem manuellen oder automatisierten konfokalen Mikroskop (Materialtabelle) mit Leuchtstofffiltern (gelistet als Anregungs-/Emissionswellenlängen, in nm) alle Kerne (Hoechst 33342, 350/461), tote Zellkerne (Ethidium homodimer-1, 528/617) und lebende Zellzytoplasma (Calcein AM, 494/517).
4. Erfassen Sie 140-m-Z-Stacks mit einer Schrittgröße von ≤1 m mit einem 20-fachen Luftobjektiv. Drei Sichtfelder sind erforderlich, um den gesamten Mikrokanal mit einer kleinen Überlappung abzubilden. Um doppelstichprobenartig zu vermeiden, bildn enden nur zwei Sichtfelder pro Chip.
   HINWEIS: Die Bildbedingungen sollten optimiert werden, um eine ordnungsgemäße NyQuist-Probenahme zu gewährleisten. Erfahrungsgemäß ist ein schnelles Bildgebungssystem, das entweder auf der Dekonvolution einer konventionellen Epifluoreszenzquelle oder auf dem Resonanzscanmodus auf einem Konfokal basiert, notwendig, um einen vollständigen Z-Stack mit drei Laserfarben über 96 Chips auf einer Platte innerhalb einer angemessenen Zeit (etwa 3,5 h mit automatisierter Bildgebung, einschließlich Setup) vollständig zu prüfen.
5. Mit Hilfe von Bildanalysesoftware können Sie die Z-Stack-Bilder für die gewünschten quantifizierten Daten wie Morphologie, Aggregationszustand oder andere Features testen. Um die Zelllebensfähigkeit zu quantifizieren, zählen Sie die Anzahl der abgestorbenen Zellen (rot) und der gesamten Zellkerne (blau).

Ergebnisse

In einem Standard-Inkubator für wassergeknickte Zellkulturen wurde eine programmierbare Perfusionswippe und in einem Standard-Biosicherheitsschrank zweispurige mikrofluidische Platten für die Beladung vorbereitet (Abbildung 1). Ein MDA-PCA-118b PDX-Tumor wurde in vivo erweitert, geerntet, wenn er eine maximale Größe erreicht hatte, und sich wie in Protokollabschnitt 2 beschrieben distanziert, um eine Güllesuspension von Zellen zu erzeugen, in etwa einem einzelzelligen Zustand

Diskussion

Hier beschreiben wir eine Methode zur Verarbeitung und Kultivierung lebensfähiger PDX-abgeleiteter Tumorzellen in einem durchdrungenen 3D-Kultursystem mit hohem Durchsatz. Während dieses Protokoll PCa PDX Gewebe verwendet, Es ist ebenso wirksam für andere epitheliale-abgeleitete Tumoren. Die Tumoreigenschaften variieren zwischen den einzelnen PDX-Linien sogar innerhalb desselben Ursprungsgewebes (Prostata, Brust usw.). Einige PCa PDX-Linien sind eher fibrotisch und schwierig, lebensfähige Zellen zu isolieren, währen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1N NaOH			any suitable tissue culture grade
60 mm round tissue culture dishes			any suitable
6-well tissue culture plates			any suitable
70 µm cell strainers	Corning	431751	or equivalent
Centrifuge	Eppendorf	5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes	or equivalent
Density gradient centrifugation solution	Millipore Sigma	P1644	Percoll
Dimethylsulfoxide			any suitable tissue culture grade
Dissociation enzyme solution	StemCell Technologies	07921	ACCUMAX
DMEM-F12	ThermoFisher Scientific	11039021	or equivalent
Forceps			any suitable
HA hydrogel kit	ESI BIO	GS311	HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)
Hanks Balanced Salt Solution	Lonza	10-527F	or equivalent
Heat-inactivated fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B Hausser BrightLine	or equivalent
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H1398	or equivalent
Image processing software	Oxford Instruments	Imaris 9.3	or equivalent
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)	ThermoFisher Scientific	L3224	or equivalent
Microfluidic culture plate	Mimetas	9603-400-B	2-lane OrganoPlate
Microscope	Nikon	A1R	or equivalent
Multichannel pipette	Eppendorf	3125000036	or equivalent
PDX-derived tumor tissue			obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122	or equivalent
Perfusion rocker	Mimetas	OrganoPlate Perfusion Rocker Mini
pH strips (pH 5-9)			any suitable
Phosphate-buffered saline solution	Lonza	17-516F	or equivalent
Razor blades			any suitable
Rotating xy-shaker	VWR	Advanced 3500 Orbital Shaker	or equivalent
Scalpel handle			any suitable
Single channel repeating pipette	Eppendorf	22260201
Sterile, 15mL conical centrifuge tubes			any suitable
Sterile, 50mL conical centrifuge tubes			any suitable