שימוש במגנטומטריה לניטור התאגדות תאית והתפרקות ביולוגית של חלקיקי תחמוצת ברזל מסונתטיים כימית

Summary

חלקיקי תחמוצת ברזל מסונתזים באמצעות הליך ג'ל סול לא רקיקי ומצוידים במולקולות קצרות אניוניות או פולימר. השימוש מגנטומטריה לניטור התאגדות ו biotransformations של חלקיקים מגנטיים בתוך תאי גזע אנושיים מודגם באמצעות מגנטומטר מדגם רוטט (VSM).

Abstract

חלקיקים מגנטיים, עשוי תחמוצת ברזל, מציגים עניין מוזר עבור מגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים שעבורם הם מופנמים לעתים קרובות בתאים ולאחר מכן נשארים בפנים. אתגר אחד הוא להעריך את גורלם בסביבה תאית עם מתודולוגיות אמינות ומדויקות. בזאת, אנו מציגים את השימוש מגנטומטר מדגם רוטט (VSM) כדי לכמת במדויק את השלמות של חלקיקים מגנטיים בתוך התאים על ידי מדידת הרגע המגנטי שלהם. תאי גזע מסומנים לראשונה עם שני סוגים של חלקיקים מגנטיים; חלקיקים יש את אותה הליבה המיוצר באמצעות סינתזה מהירה ויעילה מבוססי מיקרוגל nonaqueous סול ג'ל ושונים בציפוי שלהם: מולקולת חומצת לימון נפוץ מושווה חומצה פוליאקרילית. היווצרות של ספירואידים תאים 3D מושגת לאחר מכן באמצעות צנטריפוגה ואת הרגע המגנטי של כדוריות אלה נמדד בזמנים שונים עם VSM. הרגע המתקבל הוא טביעת אצבע ישירה של שלמות הננו-חלקיקים, עם ערכים יורדים המעידים על השפלה של חלקיקים. עבור שני הננו-חלקיקים, הרגע המגנטי פוחת עם הזמן התרבותי וחושף את ההתכלה שלהם. השפעה מגנה של ציפוי חומצה פוליאקרילית מוצג גם, בהשוואה לחומצה ציטרית.

Introduction

יש עניין מוגבר בתכונות המגנטיות של חלקיקי תחמוצת ברזל עבור מגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים. התגובה שלהם תהודה מגנטית עושה אותם סוכני ניגודיות אמינים עבור הדמיית תהודה מגנטית (MRI), יתרון ברפואה רגנרטיבית שבו תאים המסומנים עם חלקיקים מגנטיים ניתן לעקוב ב vivo לאחר ההשתלה¹. באמצעות שדות מגנטיים, תאים יכולים גם להיות מונחים במרחק; בדרך זו, spheroids הסלולר^2,3, טבעות⁴, או^{גיליונות 5} ניתן להנדס מגנטי וגם מגורה מרחוק⁶, נכס בפיתוח של רקמות ללא פיגומים. מגוון האפשרויות עבור חלקיקים אלה כולל גם מערכות משלוח תרופות^7,8 וטיפול היפרתרמי מגנטי פוטואין להרוג תאים סרטניים^9,10,11. עבור כל היישומים האלה, חלקיקים משולבים בסביבה הביולוגית או על ידי הזרקה תוך ורידי או באמצעות הפנמה ישירה בתאים ולאחר מכן נשארים בפנים, אשר מטיל ספק גורלם תאיים.

בניתוחי vivo נמסרה הבנה כללית של גורל הננו-חלקיקים באורגניזם: עם הזרקת זרם הדם, הם נלכדים לראשונה בעיקר על ידי מקרופאגים של הכבד (תאי קופפר), טחול ומח עצם, מתפרקים בהדרגה, ומצטרפים לבריכת הברזל של האורגניזם^{12,13,14,15,16,17,18,19}. תצפיות איכותיות אפשריות רק בשל זרימת הננו-חלקיקים ברחבי האורגניזם. בדרך כלל, העברת מיקרוסקופ אלקטרונית (TEM) ניתן להשתמש כדי לצפות ישירות את חלקיקים ואת נוכחותו של ברזל באיברים ניתן לקבוע באמצעות מינון. לאחרונה, גורלם הוערך ישירות על מאגר של תאים, כלומר במעגל קרוב ללא בריחה ברזל, המאפשר מדידה כמותית של biotransformations שלהם ברמת התא^20,21,22. מדידות כאלה אפשריות באמצעות ניתוח התכונות המגנטיות של הננו-חלקיקים הקשורים קשר הדוק לשלמות המבנית שלהם. מגנטומטריה מדגם רוטט (VSM) היא טכניקה שבה המדגם רוטט מעת לעת, כך מדידת הסליל של השטף המושרה מספק את הרגע המגנטי של המדגם בשדה המגנטי להחיל. זיהוי סינכרוני כזה מאפשר מדידה מהירה, המהווה נכס לקביעת הרגעים המגנטיים של מספר רב של דגימות^20,21,22,23. החתימה המגנטית המקרוסקופית שאוחזרה על ידי VSM נותנת סקירה כמותית של כל המדגם הביולוגי בקורלציה ישירה לגודל ולמבנה של הננו-חלקיקים. בפרט, הוא מספק את הרגע המגנטי ברוויה (לידי ביטוי אמו) של הדגימות, שהוא כימות ישיר של מספר חלקיקים מגנטיים הנמצאים במדגם, בהתאמה לתכונות המגנטיות הספציפיות שלהם.

הוכח כי העיבוד תאיים של חלקיקים מגנטיים קשורה קשר הדוק לתכונות המבניות שלהם²⁰. ניתן לשלוט בתכונות אלה באמצעות פרוטוקולי סינתזה אופטימליים. כל פרוטוקול מציג יתרונות ומגבלות. חלקיקי תחמוצת ברזל מסונתזים בדרך כלל בתמיסות מימיות באמצעות coprecipitation של יוני ברזל²⁴. כדי להתגבר על המגבלות של polydispersity גודל חלקיקים, שיטות סינתזה אחרות כגון שיטות סול-ג'ל בתיווך פוליול פותחו²⁵. גישות nonaqueous על ידי פירוק תרמי מוביל לייצור של חלקיקי תחמוצת ברזל מכויל היטב²⁶. עם זאת, השימוש בכמויות עצומות של פעילי שטח כמו אוליאמין או חומצה אולאית מסבך את הפונקציונליזציה שלהם ואת העברת המים עבור יישומים ביו-רפואיים. מסיבה זו, אנו לסנתז חלקיקים מגנטיים כאלה דרך מסלול ג'ל סול nonaqueous המוביל גבישות גבוהה, טוהר רבייה²⁷. פרוטוקול זה מייצר חלקיקי גודל מבוקרים היטב שניתן לכוונן באמצעות וריאציית טמפרטורה²⁸. עם זאת, מסלול סול-ג'ל לא מימי בסיוע מיקרוגל יש מגבלת גודל עליון של חלקיקים המתקבלים של סביב 12 ננומטר. הליך זה לא יותאם ליישומים המשתמשים בחלקיקים פרומגנטיים בטמפרטורת החדר. בנוסף לסינתזת הליבה, תכונה עיקרית נוספת שיש לקחת בחשבון היא הציפוי. שוכב על פני השטח של חלקיק, הציפוי פועל כמולקולה עיגון, עוזר הפנמה ממוקדת של חלקיקים, או שזה יכול להגן על חלקיק מפני השפלה. מאז בנזיל אלכוהול משמש כמקור חמצן ליגנד באותו זמן, חלקיקים חשופים מיוצרים ללא צורך פעילי שטח נוספים או ליגנדים. חלקיקים לאחר מכן בקלות פני השטח פונקציונלי לאחר סינתזה ללא תהליך חילופי פעילי שטח.

בזאת, שני סוגים של חלקיקים מוערכים בעלי אותה ליבה ושונים בציפוי. הליבה מסונתזת בטכניקה מהירה ויעילה ביותר המבוססת על מיקרוגל. שני הציפויים בהשוואה מורכבים מחומצת לימון, אחד הנפוצים ביותר כסוכן ציפוי ביישומים^{ביו-רפואיים 29,30}, וחומצה פוליאקרילית (PAA), ציפוי פולימרי עם מספר גבוה של פונקציות כלאט. מדידות מגנטומטריה VSM משמשים לאחר מכן תחילה כדי לכמת את ספיגת הננו-חלקיקים על ידי התאים, ולאחר מכן כהערכה ישירה של השלמות המבנית הננו-חלקיקית עם הפנמה בתאי גזע. התוצאות מראות כי ריכוז הדגירה משפיע על ספיגת הננו-חלקיקים וכי הציפוי משפיע על השפלתם, כאשר המספר הגדול של מולקולות עיגון של PAA מגינות על הליבה מפני השפלה.

Protocol

1. סינתזה של חלקיקים מגנטיים

1. סינתזת ליבה – בסיוע מיקרוגל
   1. להמיס 400 מ"ג ברזל (III) אצטילצטונט (>99.9%) ב 10 מ"ל של בנזיל אלכוהול (BA, 99.8%) בתוך בקבוקון זכוכית מונווייב 30 מ"ל.
   2. להגדיל את הטמפרטורה של ההשעיה מ 25 °C (70 °F) ב 20 דקות (בקצב של 11°C/min) ולשמור אותו ב 250 °C (70 °F) במשך 30 דקות באמצעות כור מיקרוגל.
   3. להעביר את חלקיקים וכתוצאה מכך מושעה באלכוהול בנזיל בקבוקון זכוכית להפריד את חלקיקים באמצעות מגנט ניאודימיום במשך 30 דקות.
   4. לשטוף את המשקעים בעברית זכוכית 100 מ"ל הקודם עם 10 מ"ל של dichloromethane, 1 M נתרן הידרוקסיד, אתנול, pH 7 מים (שלוש פעמים) באמצעות מגנט ניאודימיום במשך 5 דקות בכל שלב כדי גלולות חלקיקים ולהסיר את supernatant.
   5. התאם את המתלה ננו-חלקיקים במים ל- pH 2 באמצעות חומצה הידרוכלורית 1 M, ולאחר מכן צנטריפוגה במסננים ultracentrifugal 100 kDa ב 2,200 x גרם במשך 10 דקות.
   6. הסר את הסינון, להוסיף 12 מ"ל של 10^-2 M חומצה הידרוכלורית לפתרון חלקיקים צנטריפוגה ב 100 kDa מסננים ultracentrifugal ב 2,200 x g במשך 10 דקות (שלוש פעמים). לאחר מכן לדלל את פתרון חלקיקים בתוך 10 מ"ל של^10-2 M חומצה הידרוכלורית לפני הציפוי.
2. ציפוי
   1. לדלל 175 מ"ג של חומצת לימון וחומצה פוליאקרילית במים ב- pH 2 בבקבוקון זכוכית 100 מ"ל והתאים את ה- pH ל -2 עם תמיסת חומצה הידרוכלורית 1 מ '.
   2. מוסיפים את פיזור מימית חלקיקי 10 מ"ל לתמיסת מולקולת הציפוי, בהתאם ליחס מסה של 5 בין מולקולת הציפוי לננו-חלקיקים. להתסיס במשך 2 שעות תחת ערבוב מגנטי בטמפרטורת החדר.
   3. לאחר התגובה, להתאים את ה- pH ל 7 עם 1 M נתרן הידרוקסידי.
   4. צנטריפוגה פתרון חלקיקים 3 פעמים עם מים deionized (DI) ב 100 kDa אולטרה צנטריפוגלי מסננים ב 2,200 x גרם במשך 10 דקות; להסיר את הסינון לדלל את פתרון חלקיקים ב 12 מ"ל של מים DI.

2. תרבות ותיוג מגנטי של תאי גזע

1. תרבות תאי גזע mesenchymal אנושי (MSC) במדיום צמיחת תאי גזע Mesenchymal מלא (MSCGM) ב 37 °C (70 °F) ו 5% CO₂. כאשר התאים הם ב 90% מפגש, להוסיף 10 מ"ל של טריפסין-EDTA מראש מחומם ב 37 ° C לכל בקבוק 150 ס"מ רבוע ולהשאיר במשך 2-3 דקות כדי לנתק את התאים.
   1. כדי לדעת מתי התאים מנותקים, להתבונן בהם עם מיקרוסקופ שדה בהיר. השוהים מחדש את התאים המנותקים ב- MSCGM ומחלקים אותם בארבעה בקבוקונים בגודל 150 ס"מ רבועים. להגביר את התאים בדרך זו עד המעבר 4 עד 5.
2. הכינו את הפתרון של חלקיקים מגנטיים לתיוג תאים: לפזר את הריכוז הנבחר של חלקיקי תחמוצת ברזל במדיום מכון הזיכרון רוזוול פארק ללא סרום (RMPI-1640) ללא גלוטמין. RPMI משמש דגירה חלקיקים (ואת שלבי שטיפה הקשורים) כפי שיש לו חוזק יוני נמוך יותר מאשר DMEM ומונע טוב יותר אירועי צבירת חלקיקים.
3. כאשר התאים נמצאים במעבר 4 או 5 ו 90% confluent, להסיר את המדיום MSCGM, לשטוף את התאים עם RPMI ללא סרום (ללא גלוטמין) ולהוסיף 10 מ"ל של תחמוצת ברזל ננו חלקיקים פתרון לכל 150 ס"מ² בקבוק תרבות, שהוא נפח המינימום הנדרש כדי לכסות את כל התאים.
4. דגירה ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO₂ במשך 30 דקות ולאחר מכן להשליך את פתרון חלקיקים. לשטוף פעם אחת עם סרום חינם RPMI-1640 (ללא גלוטמין) ואת הדגירה עם בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין סטרפטומיצין (25 מ"ל לכל 150 ס"מ² בקבוק) לילה ב 37 °C ו 5% CO₂ כדי לאפשר הפנמה מלאה של חלקיקים.

3. היווצרות של תאי גזע-ספרואידים

1. הכן טרי תא ספרואידי תרבית בינוני מורכב DMEM גלוקוז גבוה עם L-גלוטמין בתוספת 50 μM L-ascorbic חומצה 2-פוספט, 0.1 μM dexamethasone, 1 מ"מ נתרן פירובט, 0.35 מ"מ L-פרולין, ו 1% תוסף תרבות אוניברסלי המכיל אינסולין, טרנספרין אנושי וחומצה סלנית (ITS-Premix).
2. נתק את ה-MSCs המגנטיים על-ידי הוספת 10 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA שהתחממו מראש ב-37°C ל-150 ס"מ² בקבוקים למשך 2-3 דקות. כאשר התאים מנותקים, מיד להשבית את טריפסין על ידי הוספת 1/3 של נפח של DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין סטרפטומיצין שחומם מראש ב 37 °C (77 °FBS).
3. צנטריפוגה התאים מנותקים ב 260 x g במשך 5 דקות, לשאוף את המדיה להשעות מחדש את התאים בנפח קטן (פחות מ 1 מ"ל לכל 150 ס"מ רבוע בקבוק) של תא ספרואידי תרבות בינוני כגון שיש 200,000 תאים בערך 50 μL של בינוני. לספור את מספר התא באמצעות hemocytometer ולהתאים את עוצמת הקול במידת הצורך.
4. הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבות תאים-spheroid שהוכן טרי בצינור צנטריפוגה סטרילי 15 מ"ל ולהוסיף את נפח הפתרון בשימוש חוזר המתאים 200,000 תאים.
5. צנטריפוגה אלה תאים מסומנים מגנטית ב 180 x g במשך 3 דקות כגון יצירת גלולה תא בתחתית הצינור ולשמור על supernatant, שהוא מדיום תרבות התא.
6. מעט לפתוח את הצינורות כדי לאפשר חילופי אוויר דגירה ב 37 °C (60 °F) עם 5% CO₂ עד 21 ימים, זמן תרבות שבו התאים יוצרים מבנה 3D מגובש שתוצאתו ספירואיד מעוצב במלואו. לשנות את המדיום פעמיים בשבוע.
7. בימים נתון, לשטוף את spheroids פעמיים עם חיץ cacodylate עשוי 0.2 M cacodylate מדולל במים demineralized ולתקן אותם באמצעות 2% glutaraldehyde ב 0.1 M מאגר cacodylate מדולל במים מזוקקים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. אחסן את הכדורים הקבועים ב- PBS עד לשימוש למדידת VSM או הדמיית TEM. שלב קיבוע זה עוצר את כל התהליכים הביולוגיים ומאפשר שימור ארוך טווח.

4. כימות של חלקיקים מגנטיים בתמיסה ובצלולו באמצעות מגנטומטר מדגם רוטט (VSM)

1. מקם נפח נתון של פתרון חלקיקים מגנטיים (מקסימום 10 μL) או תא יחיד-ספרואיד לתוך מחזיק המדגם שתוכנן במיוחד כדי להתאים VSM.
2. הכנס את הדגימה ל- VSM וסרוק להיסט לדוגמה. מקם את המדגם במיקום המתאים למקסימום המגנטיזציה.
3. בצע את המדידה הראשונה בשדה מגנטי נמוך (בין -1500 Oe ו- +1500 Oe) בקצב של 20 Oe/s.
4. בצע מדידה שנייה בשדה מגנטי גבוה (בין -30 000 Oe ו- +30 000 Oe) בקצב של 200 Oe/s.

5. ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM)

1. עבור פתרונות חלקיקים, להפקיד 10 μL של הפתרון מימית על רשת נחושת מצופה פחמן ולתת לו להתייבש בטמפרטורת החדר.
2. עבור חלקיקים מופנמים בתאים, בניגוד תא קבוע ספרואידים עם תמצית תה Oolong (OTE) ב 0.5% מדולל 0.1 M מאגר cacodylate, פוסט לתקן עם 1% אוסמיום tetroxide המכיל 1.5% אשלגן ציאנופרט ולאחר מכן להתייבש באמבטיות אתנול מדורגים, כלול Epon. פורסים אולטרה-קטעים של 70 ננומטר ומפקידים אותם ברשתות קופר.
3. קח תמונות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים ב 80 kV עם הגדלה מ 1k לתצפית של תאים שלמים ל 40k לתצפית של תאים אנדוסומליים.

תוצאות

באמצעות סינתזה בסיוע מיקרוגל, חלקיקים מגנטיים עם מונודיספרס 8.8 ± 2.5 ננומטר גודל הליבה מיוצרים מצופים או ציטראט או PAA (איור 1A). תאי גזע אז הם דגירה עם חלקיקים אלה מפוזרים במדיום תרבות בריכוז נתון במשך 30 דקות, וכתוצאה מכך אנדוציטוזיס שלהם כליאה בתוך אנדוזומים הסלולר (

Discussion

באמצעות סינתזה מהירה ויעילה המבוססת על מיקרוגל, ניתן לסנתז בקלות חלקיקים מגנטיים, עם גודל מבוקר, ומצופים עוד יותר במולקולות נתונות. צעד קריטי הוא למלא את מלח הברזל ואת אלכוהול בנזיל תחת ואקום כדי לשמור על פיזור קטן בגודל. אלכוהול בנזיל פועל הן כמו ממס ו ligand באותו זמן המאפשר ישירות להשיג תחמ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Benzyl alcohol for synthesis	Sigma Aldrich	8.22259
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C
Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR	VWR Chemicals	23367
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-106
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35640
Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%)	Sigma Aldrich	517003
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501
Monowave glass vial	Anton Paar	82723_us
Microwave reactor	Anton Paar	Monowave 300
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL)	Life Technologies	15140-122
Poly(acrylic acid, sodium salt)	Sigma Aldrich	416010	MW = 1200 g/mol
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35629
Sodium pyruvate solution 100mM	Sigma	S8636
Sterile conical centrifuge tube	Falcon	352097	15 mL tubes
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis	Sigma Aldrich	10396430
Ultra centrifugal filter	Amicon	AC S510024