Verwendung der Magnetometrie zur Überwachung der zellulären Inkorporation und des anschließenden biologischen Abbaus chemisch synthetisierter Eisenoxid-Nanopartikel

Zusammenfassung

Eisenoxid-Nanopartikel werden über ein nicht wässriges Sol-Gel-Verfahren synthetisiert und mit anionischen Kurzmolekülen oder Polymeren beschichtet. Die Verwendung der Magnetometrie zur Überwachung der Integration und Biotransformation magnetischer Nanopartikel in menschlichen Stammzellen wird mit einem vibrierenden Probenmagnetometer (VSM) demonstriert.

Zusammenfassung

Magnetische Nanopartikel aus Eisenoxid stellen ein besonderes Interesse für eine Vielzahl biomedizinischer Anwendungen dar, für die sie oft in Zellen verinnerlicht und dann im Inneren belassen werden. Eine Herausforderung besteht darin, ihr Schicksal in der intrazellulären Umgebung mit zuverlässigen und präzisen Methoden zu beurteilen. Hierbei stellen wir die Verwendung des vibrierenden Probenmagnetometers (VSM) vor, um die Integrität magnetischer Nanopartikel in Zellen präzise zu quantifizieren, indem sie ihr magnetisches Moment messen. Stammzellen werden zuerst mit zwei Arten von magnetischen Nanopartikeln beschriftet; Die Nanopartikel haben den gleichen Kern, der über eine schnelle und effiziente Mikrowellen-basierte nichtwässrige Solgelsynthese entsteht und unterscheiden sich in ihrer Beschichtung: Das häufig verwendete Zitronensäuremolekül wird mit Polyacrylsäure verglichen. Die Bildung von 3D-Zellsphäroiden wird dann durch Zentrifugation erreicht und das magnetische Moment dieser Sphäroide wird zu unterschiedlichen Zeiten mit dem VSM gemessen. Das erhaltene Moment ist ein direkter Fingerabdruck der Integrität der Nanopartikel, wobei abnehmende Werte auf einen Nanopartikelabbau hindeuten. Bei beiden Nanopartikeln nimmt das magnetische Moment im Laufe der Kulturzeit ab und offenbart ihren biologischen Abbau. Eine schützende Wirkung der Polyacrylsäurebeschichtung wird auch im Vergleich zu Zitronensäure gezeigt.

Einleitung

Das Interesse an den magnetischen Merkmalen von Eisenoxid-Nanopartikeln für eine Vielzahl biomedizinischer Anwendungen ist gestiegen. Ihre Reaktion auf Magnetresonanz macht sie zu zuverlässigen Kontraststoffen für die Magnetresonanztomographie (MRT), ein Vorteil in der regenerativen Medizin, wo Zellen, die mit magnetischen Nanopartikeln gekennzeichnet sind, nach der Implantation¹in vivo nachverfolgt werden können. Mithilfe von Magnetfeldern können Zellen auch in der Ferne geführt werden; auf diese Weise können zelluläre Sphäroide^2,3, Ringe⁴, oder Blatt⁵ magnetisch und auch aus der Ferne stimuliert⁶, ein Vorteil in der Entwicklung von Gerüst-freien Geweben. Die Möglichkeiten für diese Nanopartikel umfassen auch Arzneimittelabgabesysteme^7,8 und magnetische und photoinduzierte hyperthermische Behandlung, um Krebszellen^9,10,11abzutöten. Bei all diesen Anwendungen werden die Nanopartikel entweder durch intravenöse Injektion oder durch direkte Internalisierung in Zellen in die biologische Umgebung integriert und dann im Inneren gelassen, was ihr intrazelluläres Schicksal in Frage stellt.

In-vivo-Analysen vermittelten ein allgemeines Verständnis des Schicksals der Nanopartikel im Organismus: Bei injektionn in den Blutkreislauf werden sie zunächst hauptsächlich von den Makrophagen der Leber (Kupffer-Zellen), Milz und Knochenmark erfasst, nach und nach abgebaut und verbinden sich mit dem Eisenpool des Organismus^{12,13,14,15,16,17,18,19}. Qualitative Beobachtungen sind nur durch die Zirkulation der Nanopartikel im gesamten Organismus möglich. Typischerweise kann die Getriebeelektronische Mikroskopie (TEM) verwendet werden, um die Nanopartikel direkt zu beobachten und das Vorhandensein von Eisen in den Organen kann über die Dosierung bestimmt werden. In jüngerer Zeit wurde ihr Schicksal direkt an einem Zellpool bewertet, d.h. in einem engen Kreislauf ohne Eisenflucht, was eine quantitative Messung ihrer Biotransformationen auf Zellebene^20,21,22ermöglicht. Solche Messungen sind durch die Analyse der magnetischen Eigenschaften der Nanopartikel möglich, die eng mit ihrer strukturellen Integrität verbunden sind. Vibrierende Probenmagnetometrie (VSM) ist eine Technik, bei der die Probe periodisch vibriert, so dass die Spulenmessung des induzierten Flusses das magnetische Moment der Probe am angelegten Magnetfeld liefert. Eine solche synchrone Detektion ermöglicht eine schnelle Messung, die ein Mittel zur Bestimmung der magnetischen Momente einer großen Anzahl von Proben^20,21,22,23ist. Die makroskopische magnetische Signatur, die von VSM abgerufen wird, gibt dann einen quantitativen Überblick über die gesamte biologische Probe, die direkt mit der Größe und Struktur der Nanopartikel korreliert. Insbesondere liefert es das magnetische Moment bei der Sättigung (ausgedrückt in emu) der Proben, was eine direkte Quantifizierung der Anzahl der in der Probe vorhandenen magnetischen Nanopartikel bzw. ihrer spezifischen magnetischen Eigenschaften darstellt.

Es hat sich gezeigt, dass die intrazelluläre Verarbeitung magnetischer Nanopartikel eng mit ihren strukturellen Merkmalen verbunden ist²⁰. Diese Funktionen können über optimale Syntheseprotokolle gesteuert werden. Jedes Protokoll bietet Vorteile und Einschränkungen. Eisenoxid-Nanopartikel werden häufig in wässrigen Lösungen durch Kopräzipation von Eisenionen synthetisiert²⁴. Um die Grenzen der Polydispersität der Nanopartikelgröße zu überwinden, wurden andere Synthesemethoden wie polyolvermittelte Sol-Gel-Methoden entwickelt²⁵. Nicht wässrige Ansätze durch thermische Zersetzung führen zur Produktion sehr gut kalibrierter Eisenoxid-Nanopartikel²⁶. Die Verwendung von massiven Mengen an Tensiden wie Oleylamin oder Ölsäure erschwert jedoch deren Funktionalisierung und Wassertransfer für biomedizinische Anwendungen. Aus diesem Grund synthetisieren wir solche magnetischen Nanopartikel über einen nicht wässrigen Sol-Gel-Weg, der zu hoher Kristallinität, Reinheit und Reproduzierbarkeit führt²⁷. Dieses Protokoll erzeugt gut kontrollierte Nanopartikel in Größe, die durch Temperaturschwankungen²⁸abgestimmt werden können. Dennoch hat die mikrowellenunterstützte nicht wässrige Sol-Gel-Route eine obere Größengrenze der erhaltenen Nanopartikel von etwa 12 nm. Dieses Verfahren wäre nicht für Anwendungen mit ferromagnetischen Partikeln bei Raumtemperatur geeignet. Neben der Kernsynthese ist ein weiteres Hauptmerkmal die Beschichtung. An der Oberfläche des Nanopartikels liegend, fungiert die Beschichtung als Verankerungsmolekül, das die gezielte Internalisierung der Nanopartikel unterstützt, oder sie kann das Nanopartikel vor dem Abbau schützen. Da Benzylalkohol gleichzeitig als Sauerstoffquelle und Liganden dient, werden nackte Nanopartikel ohne zusätzliche Tenside oder Liganden hergestellt. Die Nanopartikel werden dann nach der Synthese ohne Tensidaustausch leicht oberflächenfunktionalisiert.

Dabei werden zwei Arten von Nanopartikeln bewertet, die den gleichen Kern besitzen und sich in der Beschichtung unterscheiden. Der Kern wird mit einer schnellen und hocheffizienten Mikrowellentechnik synthetisiert. Die beiden verglichenen Beschichtungen bestehen aus Zitronensäure, einer der am häufigsten als Beschichtungsmittel in biomedizinischen Anwendungen^29,30und Polyacrylsäure (PAA), einer polymeren Beschichtung mit einer hohen Anzahl von Chelatfunktionen. VSM-Magnetometriemessungen werden dann zuerst verwendet, um die Nanopartikelaufnahme durch die Zellen zu quantifizieren, und dann als direkte Bewertung der strukturellen Integrität von Nanopartikeln bei der Internalisierung in Stammzellen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Inkubationskonzentration die Aufnahme von Nanopartikeln beeinflusst und dass die Beschichtung ihren Abbau beeinflusst, wobei die große Anzahl von Verankerungsmolekülen von PAA den Kern vor Dementstehen schützt.

Protokoll

1. Synthese magnetischer Nanopartikel

1. Kernsynthese – Mikrowellen-unterstützt
   1. 400 mg Eisen(III) Acetylacetonat auflösen (>99,9%) in 10 ml Benzylalkohol (BA, 99,8%) innerhalb einer 30 ml Monowellenglasdurchstechflasche.
   2. Erhöhen Sie die Temperatur der Suspension von 25 auf 250 °C in 20 min (bei einer Geschwindigkeit von 11,25 °C/min) und halten Sie sie 30 min mit einem Mikrowellenreaktor bei 250 °C.
   3. Übertragen Sie die in Benzylalkohol suspendierten Nanopartikel in eine Glasdurchstechflasche und trennen Sie die Nanopartikel mit einem Neodymmagneten 30 min.
   4. Waschen Sie den Niederschlag in der vorherigen 100 ml Glasdurchstechflasche mit 10 ml Dichlormethan, 1 M Natriumhydroxid, Ethanol, pH 7 Wasser (dreimal) mit einem Neodym-Magnetfürst für 5 min pro Schritt, um Nanopartikel zu pelletisieren und den Überstand zu entfernen.
   5. Stellen Sie die Nanopartikelsuspension in Wasser mit 1 M Salzsäure auf pH2 und dann in 100 kDa Ultrazentrifugalfiltern bei 2.200 x g für 10 min zentrifugieren.
   6. Entfernen Sie das Filtrat, fügen Sie 12 ml 10^-2 M Salzsäure in die Nanopartikellösung und Zentrifuge in 100 kDa Ultrazentrifugalfilter bei 2.200 x g für 10 min (dreimal). Anschließend die Nanopartikellösung innerhalb von 10 ml von 10^-2 M Salzsäure vor der Beschichtung verdünnen.
2. Beschichtung
   1. 175 mg Zitronensäure und Polyacrylsäure in Wasser bei pH 2 in einer 100 ml Glasdurchstechflasche verdünnen und den pH-Wert mit einer 1 M Salzsäurelösung auf 2 einstellen.
   2. Fügen Sie die 10 ml-Nanopartikel wässrige Dispersion in die Beschichtungsmoleküllösung ein, was einem Massenverhältnis von 5 zwischen dem Beschichtungsmolekül und den Nanopartikeln entspricht. Rühren Sie für 2 h unter magnetischem Rühren bei Raumtemperatur.
   3. Nach der Reaktion den pH-Wert auf 7 mit 1 M Natriumhydroxid einstellen.
   4. Zentrifuge die Nanopartikellösung 3 mal mit deionisiertem (DI) Wasser in 100 kDa Ultrazentrifugalfiltern bei 2.200 x g für 10 min; Filtrat entfernen und die Nanopartikellösung in 12 ml DI-Wasser verdünnen.

2. Kultur und magnetische Kennzeichnung von Stammzellen

1. Kultur humane mesenchymale Stammzellen (MSC) im vollständigen mesenchymalen Stammzellwachstumsmedium (MSCGM) bei 37 °C und 5%_CO2. Wenn die Zellen bei 90% Zusammenfluss sind, fügen Sie 10 ml Trypsin-EDTA vorgewärmt bei 37°C pro 150 cm2 Kolben hinzu und lassen Sie für 2-3 Minuten die Zellen zu lösen.
   1. Um zu wissen, wann die Zellen abgetrennt sind, beobachten Sie sie mit einem Hellfeldmikroskop. Setzen Sie die abgetrennten Zellen in MSCGM wieder auf und teilen Sie sie in vier 150 cm2-Flaschen. Verstärken Sie die Zellen auf diese Weise bis Durchgang 4 bis 5.
2. Bereiten Sie die Lösung magnetischer Nanopartikel für die Zellbeschriftung vor: Dispergieren Sie die gewählte Konzentration von Eisenoxid-Nanopartikeln im serumfreien Roswell Park Memorial Institute Medium (RMPI-1640) ohne Glutamin. RPMI wird für die Inkubation von Nanopartikeln (und die damit verbundenen Spülschritte) verwendet, da es eine geringere Ionenstärke als DMEM hat und Nanopartikelaggregationsereignisse besser verhindert.
3. Wenn sich die Zellen in Durchgang 4 oder 5 und 90 % konfluent befinden, entfernen Sie das MSCGM-Medium, spülen Sie die Zellen mit serumfreiem RPMI (ohne Glutamin) aus und fügen Sie 10 ml Eisenoxid-Nanopartikellösung pro 150 cm² Kulturkolben hinzu, was das minimale Volumen ist, das erforderlich ist, um alle Zellen abzudecken.
4. Bei 37 °C und 5%_CO2 für 30 min inkubieren und dann die Nanopartikellösung entsorgen. Einmal mit serumfreiem RPMI-1640 (kein Glutamin) waschen und mit Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) über Nacht mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin (25 ml pro 150 cm² Kolben) bei 37 °C und 5%_CO2 inkubieren, um eine vollständige Internalisierung der Nanopartikel zu ermöglichen.

3. Bildung von Stammzellsphäroiden

1. Frisch vorbereitendes Zellsphäroid-Kulturmedium bestehend aus DMEM-Hoher Glukose mit L-Glutamin, ergänzt mit 50 M L-Ascorbinsäure 2-Phosphat, 0,1 M Dexamethason, 1 mM Natriumpyruvat, 0,35 mM L-Prolin und 1% universaler Kulturergänzung, die Insulin, HumanTransferrin und Selensäure (ITS-Premix) enthält.
2. Lösen Sie die magnetischen MSCs, indem Sie 10 ml 0,05% Trypsin-EDTA vorwärmte bei 37 °C pro 150 cm² Kolben für 2-3 Minuten hinzufügen. Wenn die Zellen abgetrennt werden, inaktivieren Sie sofort das Trypsin, indem Sie 1/3 des Volumens von DMEM hinzufügen, das mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin vorgewärmt bei 37 °C ergänzt wird.
3. Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen bei 260 x g für 5 min, aspirieren Sie die Medien und setzen Sie die Zellen in einem kleinen Volumen (weniger als 1 ml pro 150 cm2 Kolben) des Zellsphäroid-Kulturmediums wieder auf, z. B. mit 200.000 Zellen in etwa 50 l Medium. Zählen Sie die Zellennummer mit einem Hämozytometer, und passen Sie die Lautstärke bei Bedarf an.
4. Fügen Sie 1 ml frisch zubereitetes Zellsphäroid-Kulturmedium in ein 15 ml steriles konisches Zentrifugenrohr und fügen Sie das Volumen der resuspendierten Lösung hinzu, die 200.000 Zellen entspricht.
5. Zentrifugieren Sie diese magnetisch beschrifteten Zellen bei 180 x g für 3 min, wie z. B. die Bildung eines Zellpellets an der Unterseite des Rohres und halten Sie den Überstand, das das Zellkulturmedium ist.
6. Öffnen Sie die Rohre leicht, um Luftaustausch zu ermöglichen und bei 37 °C mit 5%_CO2 für bis zu 21 Tage zu brüten, Kulturzeit, entlang der die Zellen eine kohäsive 3D-Struktur bilden, die zu einem voll ausgebildeten Sphäroid führt. Wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche.
7. An bestimmten Tagen die Sphäroide zweimal mit Einem Cakodylatepuffer aus 0,2 M in demineralisiertem Wasser verdünntem Cakodylat waschen und mit 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Kakokylatpuffer in destilliertem Wasser 30 min bei Raumtemperatur verdünnt fixieren. Bewahren Sie die festen Sphäroide in PBS auf, bis sie für die VSM-Messung oder TEM-Bildgebung verwendet werden. Dieser Fixierungsschritt stoppt alle biologischen Prozesse und ermöglicht eine langfristige Konservierung.

4. Quantifizierung magnetischer Nanopartikel in Lösung und in Cellulo mit einem vibrierenden Probenmagnetometer (VSM)

1. Legen Sie entweder ein bestimmtes Volumen magnetischer Nanopartikellösung (maximal 10 l) oder ein einzelnes Zellsphäroid in den Probenhalter, der speziell für den VSM entwickelt wurde.
2. Fügen Sie die Probe in den VSM ein, und scannen Sie nach Stichprobenversatz. Platzieren Sie die Probe an der Position, die dem Magnetisierungsmaximum entspricht.
3. Führen Sie die erste Messung bei einem niedrigen Magnetfeld (zwischen -1500 Oe und +1500 Oe) mit einer Rate von 20 Oe/s durch.
4. Führen Sie eine zweite Messung bei einem hohen Magnetfeld (zwischen -30 000 Oe und +30 000 Oe) mit einer Rate von 200 Oe/s durch.

5. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Analyse

1. Für die Nanopartikellösungen 10 l der wässrigen Lösung auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter ablagern und bei Raumtemperatur trocknen lassen.
2. Bei den in Zellen internalisierten Nanopartikeln die fixen Zellsphäroide mit Oolong Tea Extract (OTE) mit 0,5% in 0,1 M Cacodylatpuffer verdünnt, postfix mit 1% Osmiumtetroxid mit 1,5% Kaliumcyanoferrat und anschließenddehydratisiert in abgestuften Ethanolbädern, die in Epon enthalten sind. Schneiden Sie Ultrasections von 70 nm und legen Sie sie auf Cooper Grids.
3. Nehmen Sie Bilder mit einem Elektronenmikroskop bei 80 kV mit einer Vergrößerung von 1k für die Beobachtung ganzer Zellen bis 40k für die Beobachtung von endosomalen Kompartimenten auf.

Ergebnisse

Mit Hilfe der Mikrowellen-gestützten Synthese werden magnetische Nanopartikel mit einem monodispersen Kern von 8,8 ± 2,5 nm Kerngröße hergestellt und entweder mit Citrat oder PAA beschichtet (Abbildung 1A). Stammzellen werden dann mit diesen Nanopartikeln in Kulturmedium in einer gegebenen Konzentration für 30 Minuten dispergiert, was zu ihrer Endozytose und Einschließung innerhalb der zellulären Endosomen führt (Abbildung 1B). Die magnetischen Stammzell...

Diskussion

Mit einer schnellen und effizienten Mikrowellen-basierten Synthese können magnetische Nanopartikel leicht synthetisiert, mit kontrollierter Größe und weiter mit bestimmten Molekülen beschichtet werden. Ein kritischer Schritt ist es, das Eisensalz und den Benzylalkohol unter Vakuum zu lagern, um eine kleine Dispersion in der Größe zu halten. Der Benzylalkohol wirkt sowohl als Lösungsmittel als auch als Liganden und ermöglicht es, kalibriertes blankes Eisenoxid direkt zu erhalten, ohne dass zusätzliche Liganden be...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Benzyl alcohol for synthesis	Sigma Aldrich	8.22259
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C
Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR	VWR Chemicals	23367
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-106
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35640
Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%)	Sigma Aldrich	517003
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501
Monowave glass vial	Anton Paar	82723_us
Microwave reactor	Anton Paar	Monowave 300
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL)	Life Technologies	15140-122
Poly(acrylic acid, sodium salt)	Sigma Aldrich	416010	MW = 1200 g/mol
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35629
Sodium pyruvate solution 100mM	Sigma	S8636
Sterile conical centrifuge tube	Falcon	352097	15 mL tubes
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis	Sigma Aldrich	10396430
Ultra centrifugal filter	Amicon	AC S510024