자기 측정을 사용하여 화학적으로 합성된 산화철 나노 입자의 세포 통합 및 후속 생분해를 모니터링합니다.

요약

산화철 나노입자는 비수성 솔 젤 시술을 통해 합성되고 음이온 짧은 분자 또는 폴리머로 코팅된다. 인간 줄기 세포 내부의 자기 나노 입자의 통합 및 생체 변환을 모니터링하기 위한 자기 측정의 사용은 진동 시료 자력계(VSM)를 사용하여 입증된다.

초록

산화철로 만든 마그네틱 나노입자는 세포에서 종종 내면화된 다음 그 안에 남겨지는 광범위한 생물 의학 응용 분야에 대한 특이한 관심을 제시합니다. 한 가지 과제는 안정적이고 정밀한 방법론으로 세포 내 환경에서 자신의 운명을 평가하는 것입니다. 본원에서, 우리는 자기 모멘티브를 측정하여 세포 내자기 나노 입자의 무결성을 정확하게 정량화하기 위해 진동 시료 자력계(VSM)의 사용을 소개합니다. 줄기 세포는 먼저 자기 나노 입자의 두 가지 유형으로 표시; 나노 입자는 빠르고 효율적인 마이크로파 기반의 비수성 솔 젤 합성을 통해 생성되는 동일한 코어를 가지며 코팅이 다릅니다: 일반적으로 사용되는 구연산 분자는 폴리아크릴산과 비교된다. 3D 세포-스페로이드의 형성은 원심분리를 통해 달성되고 이러한 스페로이드의 자기 모멘트는 VSM과 다른 시간에 측정된다. 얻어진 모멘트는 나노입자의 무결성의 직접적인 지문이며, 나노입자 분해를 나타내는 값이 감소합니다. 두 나노 입자의 경우 자기 모멘은 배양 시간이 지남에 따라 감소하여 생분해를 드러냅니다. 구연산과 비교했을 때 폴리아크릴산 코팅의 보호 효과도 나타난다.

서문

광범위한 생체 의학 응용 분야에 대한 산화철 나노 입자의 자기 기능에 대한 관심이 증가합니다. 자기 공명에 대한 그들의 반응은 자기 공명 화상 진찰을 위한 믿을 수 있는 조영제를 만듭니다 (MRI), 자기 나노 입자로 표지된 세포가 이식^1다음생체내에서 추적될 수 있는 재생 의학에서 이점. 자기장을 사용하여, 세포는 또한 거리에서 유도 될 수있다; 이러한 방식으로, 셀룰러 스페로이드^2,3,링^4,또는 시트^5는 자기적으로 설계될 수 있으며, 또한 원격으로^자극6,비계없는 조직의 개발에 있는 자산이다. 이들 나노입자에 대한 가능성의 범위는 또한 약물 전달 시스템^7,8 및 자기 및 광유도 열 처리를 포함하여 암세포를 죽이는^9,10,11을포함한다. 이러한 모든 응용 분야에서, 나노 입자는 정맥 주사 또는 세포의 직접 내재화를 통해 생물학적 환경에 통합된 다음 내부에 남아 있으며, 이는 세포 내 운명에 의문을 제기합니다.

생체 내 분석에서 유기체에서 나노 입자의 운명에 대한 일반적인 이해를 전달 : 혈류에서 주입시, 그들은 먼저 간 (Kupffer 세포),비장과 골수의 대식세포에 의해 주로 캡처되고, 점진적으로 저하되고, 유기체의 철풀에 가입^{12,13,14,15,16,17, 18,18.} 질적 관측은 유기체 전체에 걸쳐 나노 입자의 순환으로 인해 가능하다. 전형적으로, 전송 전자 현미경검사(TEM)는 나노입자를 직접 관찰하는 데 사용될 수 있으며 장기내철의 존재는 투여를 통해 결정될 수 있다. 최근에는 철분 탈출없이 가까운 회로에서 세포 수면에서 직접 평가되어 세포 수준^{20,21,22에서}생체 변환을 정량적으로 측정할 수 있습니다. 이러한 측정은 구조적 무결성에 단단히 연결된 나노 입자의 자기 특성 분석을 통해 가능합니다. 진동 시료 자기측정(VSM)은 시료가 주기적으로 진동하여 유도된 플럭스의 코일 측정이 적용된 자기장에서 시료의 자기 모멘트를 제공하는 기술이다. 이러한 동기 검출을 통해 많은 수의시료(20,^21,22,23)의자기 순간을 결정하는 자산인 신속한 측정을 가능하게 한다. VSM에서 검색한 거시적 자기 서명은 나노입자의 크기와 구조와 직접 상관관계가 있는 전체 생물학적 시료에 대한 정량적 개요를 제공합니다. 특히, 시료의 포화(emu에서 발현)에서 자기 모멘트를 제공하며, 이는 샘플에 존재하는 자기 나노입자의 수를 각각 특정 자기 특성에 정량화한다.

자기 나노 입자의 세포 내 처리가 구조적^{특징(20)에}단단히 연결되어 있는 것으로 나타났다. 이러한 기능은 최적의 합성 프로토콜을 통해 제어할 수 있습니다. 각 프로토콜은 장점과 한계를 제시합니다. 철산화질소 나노입자는 일반적으로^{철이온(24)의}회량화를 통해 수성 용액에서 합성된다. 나노입자 크기의 다각형의 한계를 극복하기 위해 폴리올 매개 솔겔 방법과 같은 다른 합성 방법이^25개개발되었다. 열 분해에 의한 비수성 접근법은 매우 잘 보정된 산화질소^{나노입자(26)의}생산으로 이어집니다. 그러나, 올리라민 또는 올레산 과 같은 계면 활성제의 엄청난 양의 사용은 생물 의학 응용 프로그램에 대한 기능화 및 물 전송을 복잡하게. 이러한 이유로, 우리는 높은 결정성, 순도 및^{재현성(27)으로}이어지는 비수성 솔 젤 경로를 통해 이러한 자기 나노입자를 합성한다. 이 프로토콜은 온도^{변화(28)를}통해 조정할 수 있는 잘 제어된 크기의 나노입자를 생성한다. 그럼에도 불구하고, 전자레인지지원 비수성 솔젤 경로는 약 12nm의 얻어진 나노입자의 상한한계를 갖는다. 이 절차는 실온에서 강자성 입자를 사용하는 응용 분야에 적용되지 않습니다. 코어 합성 외에도 고려해야 할 또 다른 주요 특징은 코팅입니다. 나노 입자의 표면에 누워, 코팅은 나노 입자의 표적 내재화를 돕는 고정 분자 역할을, 또는 분해로부터 나노 입자를 보호 할 수 있습니다. 벤질 알코올은 산소 공급원과 리간드역할을 동시에 하기 때문에, 베어 나노입자는 추가계활성제 나 리간드없이 생산된다. 나노 입자는 계면 활성제 교환 과정없이 합성 후 쉽게 표면 기능화된다.

본명, 나노입자의 2가지 유형은 동일한 코어를 가지고 코팅이 다른 것으로 평가된다. 코어는 빠르고 매우 효율적인 전자 레인지 기반 기술을 사용하여 합성됩니다. 비교된 두 코팅은 구연산으로 구성되며, 생체 의학 응용 분야에서 코팅제로 가장 많이 사용되는 중^{하나인 29,30,}및 폴리아크릴산(PAA), 다수질 기능의 수가 많은 폴리머 코팅. VSM 자기측정측정은 먼저 세포에 의한 나노입자 섭취를 정량화한 다음 줄기세포의 내재화 시 나노입자 구조적 무결성을 직접 평가하는 데 사용된다. 결과는 인큐베이션 농도가 나노입자 섭취에 영향을 미치고 코팅이 저하에 영향을 미치고 PAA의 많은 수의 앵커링 분자가 저하로부터 코어를 보호한다는 것을 보여줍니다.

프로토콜

1. 자기 나노 입자의 합성

1. 코어 합성 – 전자레인지 지원
   1. 용해 400 철 (III) 아세틸 레이스토네이트의 mg (>99.9%) 10mL의 벤질 알코올(BA, 99.8%)에서 30mL 단파 유리 유리 바이알 내에서.
   2. 서스펜션의 온도를 20분(11.25°C/min의 속도로) 250°C로 높이고 전자레인지 반응기를 사용하여 30분 동안 250°C로 유지한다.
   3. 벤질 알코올에 매달린 결과 나노입자를 유리 유리병으로 옮기고 30분 동안 네오디뮴 자석을 사용하여 나노입자를 분리한다.
   4. 이전 100mL 유리 바이알에서 디클로로메탄 10mL, 수산화나트륨 1M, 에탄올, pH 7물(3회)으로 침전물을 세척하여 나노입자를 펠릿화하고 상퍼나탄을 제거한다.
   5. 1M 염산을 사용하여 물에서 나노 입자 현탁액을 pH 2로 조정한 다음 100 kDa 초원심 필터에서 100 kDa 초원심 필터에서 10 분 동안 2,200 x g로 원심분리기를 조정합니다.
   6. 여과를 제거하고,^10-2M 염산의 12mL를 나노입자 용액에 넣고 원심분리기는 100kDa 초원심 필터에서 10분(3회)에 2,200xg로 첨가한다. 그런 다음 코팅 전에^10-2M 염산의 10mL 이내에 나노 입자 용액을 희석시킵니다.
2. 코팅
   1. 100mL 유리 바이알에서 pH 2에서 175 mg의 구연산과 폴리 아크릴산을 희석하고 1M 염산 용액으로 pH를 2로 조정하였다.
   2. 코팅 분자 용액에 10mL 나노입자수성 분산을 추가하여 코팅 분자와 나노입자 사이의 질량 비 5에 해당한다. 실온에서 자기 교반 하에서 2 시간 동안 동요하십시오.
   3. 반응 후, 1M 수산화 나트륨으로 pH를 7로 조정한다.
   4. 100kDa 초원심 필터에서 100kDa 초원심 필터에서 10분 동안 100kDa 초원심 필터로 나노입자 용액을 3회 원심분리합니다. 여과를 제거하고 12mL의 DI 수에서 나노입자 용액을 희석시킵니다.

2. 줄기 세포의 배양 및 자기 라벨

1. 37°C 및 5% CO_2에서완전한 중간엽 줄기 세포 성장 배지(MSCGM)에서 인간 중간엽 줄기 세포(MSC)를 배양한다. 세포가 90% 합류할 때, 150cm² 당 37°C에서 미리 데워진 트립신-EDTA 10mL을 추가하고 세포를 분리하기 위해 2-3분 동안 둡니다.
   1. 세포가 분리되는 시기를 알기 위해 밝은 필드 현미경으로 관찰하십시오. MSCGM에서 분리 된 세포를 다시 중단하고 4 개의 150cm² 플라스크로 나눕니다. 4~5번 통로까지 이 방법으로 세포를 증폭시다.
2. 세포 라벨링용 자기 나노입자의 용액준비: 글루타민 없이 혈청 무료 로스웰 파크 기념 연구소 배지(RMPI-1640)에서 산화철 나노입자의 선택된 농도를 분산시킵니다. RPMI는 DMEM보다 이온 강도가 낮고 나노 입자 집계 이벤트를 보다 더 잘 예방하기 때문에 나노 입자 인큐베이션 (및 관련 헹구기 단계)에 사용됩니다.
3. 세포가 4 또는 5 및 90% 컨할 수 있을 때, MSCGM 배지를 제거하고, 혈청 무료 RPMI(글루타민 없음)로 세포를 헹구고, 150cm² 배양 플라스크당 10mL의 철산화질소 나노입자 용액을 첨가하여 모든 세포를 커버하는 데 필요한 최소 부피이다.
4. 37°C및 5%_CO2에서 30분 동안 배양한 다음 나노입자 용액을 폐기합니다. 혈청 무료 RPMI-1640 (글루타민 없음)으로 한 번 세척하고 10 % FBS와 1 % 페니실린 - 연쇄 상류균신 (150cm² 플라스크 당 25 mL)로 보충 된 덜벡코의 수정 된 독수리 매체 (DMEM)로 인큐베이션을 37 °C에서 5 % CO_2로 씻어 나노 입자의 완전한 입자를 허용합니다.

3. 줄기 세포 스페로이드 의 형성

1. L-글루타민을 함유한 DMEM 고혈당으로 구성된 세포-스페로이드 배양 배지는 50 μM L-아스코르브산 2-인산염, 0.1 μM 덱사메타손, 1mM 나트륨 피루바테, 0.35mM L-프롤린, 인슐린, 인간 전염을 함유한 1% 범용 배양 보충제(셀-프리믹스)로 보충한다.
2. 150cm² 플라스크당 37°C에서 0.05%의 10mL를 추가하여 2-3분간 자석 MSC를 분리한다. 세포가 분리되면, 즉시 37 °C에서 미리 따뜻하게 10 % FBS와 1 % 페니실린 연쇄 절제술로 보충 DMEM의 부피의 1/3을 추가하여 트립신을 즉시 비활성화합니다.
3. 원심분리기는 5분 동안 260 x g에서 해리된 세포를, 배지를 흡인하고 세포의 작은 부피(150cm² 플라스크당 1mL 미만)로 세포를 다시 일시 중단하여 약 50μL의 배지에서 200,000개의 세포를 갖는 것과 같은 세포-스퍼로이드 배양 배지를 갖는다. 혈전계를 사용하여 셀 번호를 계산하고 필요한 경우 볼륨을 조정합니다.
4. 15mL 멸균 원심분리기 튜브에 갓 준비된 세포-스페로이드 배양 배지 1mL를 추가하고 200,000세포에 해당하는 재일시 중단 된 용액의 부피를 추가합니다.
5. 원심분리기는 180 x g에서 자기로 표지된 세포를 튜브 의 바닥에 세포 펠릿을 형성하는 것과 같은 3분 동안, 세포 배양 배지인 상퍼나탄을 유지한다.
6. 튜브를 37°C에서 최대 21일 동안 5%_CO2로 배양하고, 세포가 완전히 형성된 스페로이드를 초래하는 응집력 있는 3D 구조를 형성하는 배양 시간을 가한다. 일주일에 두 번 매체를 변경합니다.
7. 주어진 일에, 0.2 M 의 cacodylate로 만든 cacodylate 버퍼로 스페로이드를 두 번 세척하고 실온에서 30 분 동안 증류수로 희석 된 0.1 M 의 캐코딜레이트 버퍼에서 2 % 글루타랄데히드를 사용하여 고정하십시오. VSM 측정 또는 TEM 이미징에 사용될 때까지 고정 스페로이드를 PBS에 저장합니다. 이 고정 단계는 모든 생물학적 과정을 중지하고 장기 보존을 허용합니다.

4. 진동 시료 자력계(VSM)를 이용한 용액 및 셀룰로에서 자기 나노입자의 정량화

1. 주어진 양의 자기 나노 입자 용액 (최대 10 μL) 또는 단일 세포 스페로이드를 VSM에 맞게 특별히 설계된 샘플 홀더에 놓습니다.
2. 샘플을 VSM에 삽입하고 샘플 오프셋을 검사합니다. 자화 최대값에 해당하는 위치에 샘플을 배치합니다.
3. 20 Oe/s 속도로 저자기장(-1500 Oe와 +1500 Oe 사이)에서 첫 번째 측정을 수행합니다.
4. 200 Oe/s 속도로 높은 자기장(-30 000 Oe 와 +30 000 Oe 사이)에서 두 번째 측정을 수행합니다.

5. 전송 전자 현미경 검사법 (TEM) 분석

1. 나노입자 용액의 경우 수성 용액의 10μL을 탄소 코팅 된 구리 그리드에 기입하고 실온에서 건조시키십시오.
2. 세포내산화된 나노입자의 경우, 고정된 세포-스페로이드를 오롱차 추출물(OTE)과 0.5%로 0.5% 희석하여 0.1M 카코딜레이트 버퍼로 대조하고, 1%의 오스뮴 테트산화물을 함유한 1%의 오스뮴 테트산화물으로 1.5% 칼륨 시안노퍼레이트를 함유한 후 에폰에 포함된 탈수하였다. 70 nm의 울트라 섹션을 슬라이스하고 쿠퍼 그리드에 보관하십시오.
3. 내시경 구획의 관찰을 위해 전체 세포에서 40k로 관찰하기 위해 1k에서 배율로 80 kV에서 전자 현미경을 사용하여 이미지를 가져 가라.

결과

전자레인지 보조 합성을 사용하여, 단면 8.8 ± 2.5 nm 코어 크기를 가진 자기 나노 입자가 구연산 또는 PAA(도1A)로생성되고 코팅된다. 줄기세포는 30분 동안 주어진 농도로 배양 배지에 분산된 이러한 나노입자로 배양되어 세포 내분(도1B)내내내세포 및 감금을 초래한다. 자기 줄기 세포는 그 때 매체에서 중단되고, 원심분리되고, 형성된 세포 펠릿은 21일까...

토론

빠르고 효율적인 마이크로파 기반 합성을 사용하여 자기 나노 입자는 제어 된 크기로 쉽게 합성 할 수 있으며 주어진 분자로 더 코팅 할 수 있습니다. 중요한 단계는 작은 분산을 유지하기 위해 진공 상태에서 철소금과 벤질 알코올을 비축하는 것입니다. 벤질 알코올은 용매와 리간드로 동시에 작용하여 추가 리간드 없이 는 교정된 베어 리산화물을 직접 얻을 수 있습니다. 나노 입자가 물에 전달 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Benzyl alcohol for synthesis	Sigma Aldrich	8.22259
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C
Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR	VWR Chemicals	23367
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-106
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35640
Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%)	Sigma Aldrich	517003
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501
Monowave glass vial	Anton Paar	82723_us
Microwave reactor	Anton Paar	Monowave 300
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL)	Life Technologies	15140-122
Poly(acrylic acid, sodium salt)	Sigma Aldrich	416010	MW = 1200 g/mol
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35629
Sodium pyruvate solution 100mM	Sigma	S8636
Sterile conical centrifuge tube	Falcon	352097	15 mL tubes
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis	Sigma Aldrich	10396430
Ultra centrifugal filter	Amicon	AC S510024