Uso de magnetometría para monitorear la incorporación celular y la posterior biodegradación de nanopartículas de óxido de hierro sintetizadas químicamente

Resumen

Las nanopartículas de óxido de hierro se sintetizan a través de un procedimiento de gel sol noaqueoso y están recubiertas con moléculas cortas aniónicas o polímero. El uso de magnetometría para monitorear la incorporación y biotransformaciones de nanopartículas magnéticas dentro de células madre humanas se demuestra utilizando un magnetómetro de muestra vibratoria (VSM).

Resumen

Las nanopartículas magnéticas, hechas de óxido de hierro, presentan un interés peculiar para una amplia gama de aplicaciones biomédicas para las que a menudo se interiorizan en las células y luego se dejan dentro. Un desafío es evaluar su destino en el entorno intracelular con metodologías fiables y precisas. En este documento, introducimos el uso del magnetómetro de la muestra vibratoria (VSM) para cuantificar con precisión la integridad de las nanopartículas magnéticas dentro de las células midiendo su momento magnético. Las células madre se etiquetan por primera vez con dos tipos de nanopartículas magnéticas; las nanopartículas tienen el mismo núcleo producido a través de una síntesis rápida y eficiente de gel sol a base de microondas y difieren en su recubrimiento: la molécula de ácido cítrico comúnmente utilizada se compara con el ácido poliacrílico. La formación de esferoides celulares 3D se logra a través de la centrifugación y el momento magnético de estos esferoides se mide en diferentes momentos con el VSM. El momento obtenido es una huella digital directa de la integridad de las nanopartículas, con valores decrecientes indicativos de una degradación de las nanopartículas. Para ambas nanopartículas, el momento magnético disminuye con el tiempo de cultivo revelando su biodegradación. También se muestra un efecto protector del recubrimiento de ácido poliacrílico, en comparación con el ácido cítrico.

Introducción

Hay un mayor interés en las características magnéticas de las nanopartículas de óxido de hierro para una amplia gama de aplicaciones biomédicas. Su respuesta a la resonancia magnética los convierte en agentes de contraste fiables para la resonancia magnética (RM), una ventaja en la medicina regenerativa donde las células etiquetadas con nanopartículas magnéticas pueden ser rastreadas in vivo después de la implantación^1. Utilizando campos magnéticos, las células también se pueden guiar a distancia; de esta manera, los esferoides celulares^2,3,anillos^4,o hojas⁵ se pueden diseñar magnéticamente y también estimulado remotamente^6,un activo en el desarrollo de tejidos sin andamios. La gama de posibilidades para estas nanopartículas también incluye sistemas de administración de fármacos^7,8 y tratamiento hipertérmico magnético y fotoinducido para matar las células cancerosas^9,10,11. Para todas estas aplicaciones, las nanopartículas se integran en el entorno biológico, ya sea mediante inyección intravenosa o a través de la internalización directa en las células y luego se dejan dentro, lo que pone en tela de juicio su destino intracelular.

Los análisis in vivo transmitieron una comprensión general del destino de las nanopartículas en el organismo: al inyectarse en el torrente sanguíneo, primero son capturadas en su mayoría por los macrófagos del hígado (células de Kupffer), bazo y médula ósea, se degradan progresivamente, y se unen a la piscina de hierro del organismo^{12,13,14,15,16,17,18,19.} Las observaciones cualitativas sólo son posibles debido a la circulación de las nanopartículas en todo el organismo. Por lo general, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) se puede utilizar para observar directamente las nanopartículas y la presencia de hierro en los órganos se puede determinar a través de la dosificación. Más recientemente, su destino ha sido evaluado directamente en un conjunto de células, lo que significa en circuito cercano sin escape de hierro, permitiendo una medición cuantitativa de sus biotransformaciones a nivel celular^20,21,22. Tales mediciones son posibles a través del análisis de las propiedades magnéticas de las nanopartículas que están estrechamente vinculadas a su integridad estructural. La magnetometría de muestras vibratorias (VSM) es una técnica en la que la muestra vibra periódicamente para que la medición de la bobina del flujo inducido proporcione el momento magnético de la muestra en el campo magnético aplicado. Dicha detección sincrónica permite una medición rápida, que es un activo para determinar los momentos magnéticos de un gran número de muestras^20,21,22,23. La firma magnética macroscópica recuperada por VSM ofrece una visión cuantitativa de toda la muestra biológica directamente correlacionada con el tamaño y la estructura de las nanopartículas. En particular, proporciona el momento magnético en saturación (expresado en emú) de las muestras, que es una cuantificación directa del número de nanopartículas magnéticas presentes en la muestra, respectivamente a sus propiedades magnéticas específicas.

Se ha demostrado que el procesamiento intracelular de nanopartículas magnéticas está estrechamente vinculado a sus características estructurales^20. Estas características se pueden controlar a través de protocolos de síntesis óptimos. Cada protocolo presenta ventajas y limitaciones. Las nanopartículas de óxido de hierro se sintetizan comúnmente en soluciones acuosas a través de la coprecipitación de iones de hierro²⁴. Para superar las limitaciones de la polidispersidad del tamaño de las nanopartículas, se han desarrollado otros métodos de síntesis como los métodos sol-gel mediados por poliol²⁵. Los enfoques noaqueos por descomposición térmica conducen a la producción de nanopartículas de óxido de hierro muy bien calibradas^26. Sin embargo, el uso de cantidades masivas de tensioactivos como la oleylamina o el ácido oleico complica su funcionalización y transferencia de agua para aplicaciones biomédicas. Por esta razón, sintetizamos tales nanopartículas magnéticas a través de una ruta de gel sol noaqueís que conduce a alta cristalina, pureza y reproducibilidad^27. Este protocolo produce nanopartículas de tamaño bien controladas que se pueden ajustar a través de la variación de temperatura²⁸. Sin embargo, la ruta sol-gel no acuosa asistida por microondas tiene un límite de tamaño superior de las nanopartículas obtenidas de alrededor de 12 nm. Este procedimiento no se adaptaría para aplicaciones que utilicen partículas ferromagnéticas a temperatura ambiente. Además de la síntesis del núcleo, otra característica principal a tener en cuenta es el recubrimiento. Acostado en la superficie de la nanopartícula, el revestimiento actúa como una molécula de anclaje, ayudando a la internalización específica de las nanopartículas, o puede proteger la nanopartícula de la degradación. Dado que el alcohol bencílico actúa como una fuente de oxígeno y un ligando al mismo tiempo, las nanopartículas desnudas se producen sin necesidad de tensioactivos o ligandos adicionales. Las nanopartículas se funcionalizan fácilmente después de la síntesis sin un proceso de intercambio de tensioactivos.

En este documento, se evalúan dos tipos de nanopartículas que poseen el mismo núcleo y difieren en el recubrimiento. El núcleo se sintetiza utilizando una técnica rápida y altamente eficiente basada en microondas. Los dos recubrimientos comparados consisten en ácido cítrico, uno de los más utilizados como agente de recubrimiento en aplicaciones biomédicas^29,30,y ácido poliacrílico (PAA), un revestimiento polimérico con un alto número de funciones quelantes. Las mediciones de magnetometría VSM se utilizan primero para cuantificar la absorción de nanopartículas por las células, y luego como una evaluación directa de la integridad estructural de las nanopartículas al internalizarse en las células madre. Los resultados demuestran que la concentración de incubación afecta a la absorción de nanopartículas y que el recubrimiento influye en su degradación, con el gran número de moléculas de anclaje de PAA protegiendo el núcleo de la degradación.

Protocolo

1. Síntesis de nanopartículas magnéticas

1. Síntesis de núcleos – asistido por microondas
   1. Disolver 400 mg de acetiletonato de hierro (III) (>99,9%) en 10 ml de alcohol bencílico (BA, 99,8%) dentro de un vial de vidrio monowave de 30 ml.
   2. Aumente la temperatura de la suspensión de 25 a 250 °C en 20 min (a una velocidad de 11,25 °C/min) y mantenla a 250 °C durante 30 minutos utilizando un reactor microondas.
   3. Transfiera las nanopartículas resultantes suspendidas en alcohol bencílico a un vial de vidrio y separe las nanopartículas utilizando un imán de neodimio durante 30 min.
   4. Lave el precipitado en el vial de vidrio anterior de 100 ml con 10 ml de diclorometano, 1 M de hidróxido sódico, etanol, agua pH 7 (tres veces) utilizando un imán de neodimio durante 5 minutos cada paso para peletizar nanopartículas y eliminar el sobrenadante.
   5. Ajuste la suspensión de nanopartículas en agua a pH 2 utilizando ácido clorhídrico de 1 M y, a continuación, centrífuga en filtros ultracentrífugos de 100 kDa a 2.200 x g durante 10 minutos.
   6. Retire el filtrado, agregue 12 ml de ácido clorhídrico de^10-2 M a la solución de nanopartículas y centrífuga en filtros ultracentrífugos de 100 kDa a 2.200 x g durante 10 min (tres veces). A continuación, diluya la solución de nanopartículas dentro de 10 ml de ácido clorhídrico de^10-2 M antes de recubrimiento.
2. Capa
   1. Diluir 175 mg de ácido cítrico y ácido poliacrílico en agua a la pH 2 en un vial de vidrio de 100 ml y ajustar el pH a 2 con una solución de ácido clorhídrico de 1 M.
   2. Añadir las nanopartículas de 10 ml de dispersión acuosa a la solución de molécula de recubrimiento, correspondiente a una relación de masa de 5 entre la molécula de recubrimiento y las nanopartículas. Agitar durante 2 h bajo agitación magnética a temperatura ambiente.
   3. Después de la reacción, ajuste el pH a 7 con hidróxido de sodio de 1 M.
   4. Centrífuga la solución de nanopartícula 3 veces con agua desionizada (DI) en filtros ultracentrífugos de 100 kDa a 2.200 x g durante 10 minutos; eliminar el filtrado y diluir la solución de nanopartículas en 12 ml de agua di.

2. Cultivo y etiquetado magnético de células madre

1. Cultivo de células madre mesenquimales humanas (MSC) en el medio de crecimiento completo de células madre mesenquimales (MSCGM) a 37 °C y 5% CO₂. Cuando las células estén al 90% de confluencia, agregue 10 ml de trippsina-EDTA precalentada a 37 °C por matraz de 150 cm² y deje durante 2-3 minutos para separar las células.
   1. Para saber cuándo se separan las células, observelas con un microscopio de campo brillante. Resuspend las células separadas en MSCGM y divida en cuatro matraces de 150 cm². Amplificar las células de esta manera hasta el paso 4 a 5.
2. Preparar la solución de nanopartículas magnéticas para el etiquetado celular: dispersar la concentración elegida de nanopartículas de óxido de hierro en el medio gratuito Roswell Park Memorial Institute (RMPI-1640) sin glutamina. RPMI se utiliza para la incubación de nanopartículas (y los pasos de enjuague relacionados) ya que tiene una fuerza iónica más baja que DMEM y previene mejor los eventos de agregación de nanopartículas.
3. Cuando las células estén en el paso 4 o 5 y 90% confluentes, retire el medio MSCGM, enjuague las células con RPMI libre de suero (sin glutamina) y agregue 10 ml de solución de nanopartículas de óxido de hierro por 150 cm² matraz de cultivo, que es el volumen mínimo necesario para cubrir todas las células.
4. Incubar a 37 °C y 5% CO₂ durante 30 min y luego desechar la solución de nanopartículas. Lávese una vez con RPMI-1640 libre de suero (sin glutamina) e incubar con el medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco complementado con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina (25 ml por 150 cm² matraz) durante la noche a 37 °C y 5% CO₂ para permitir una internalización completa de las nanopartículas.

3. Formación de esferoides de células madre

1. Preparar recién preparado medio de cultivo de esferoides celulares compuesto de DMEM alta glucosa con L-glutamina complementada con 50 μM L-ácido ascórbico 2-fosfato, 0.1 μM dexametasona, 1 mM de piruvato sódico, 0.35 mM L-proline, y 1% suplemento de cultivo universal que contiene insulina, transferrina humana y ácido seleno (ITS-Premix).
2. Desenganche los MSC magnéticos añadiendo 10 ml de 0.05% trypsin-EDTA precalentado a 37 °C por 150 cm² frasco durante 2-3 minutos. Cuando las células se desasocian, inactive inmediatamente la trippsina añadiendo 1/3 del volumen de DMEM complementado con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina precalentada a 37 °C.
3. Centrífuga las células disociadas a 260 x g durante 5 minutos, aspirar el medio y volver a suspender las células en un volumen pequeño (menos de 1 ml por matraz de 150 cm²) del medio de cultivo esferoide celular, como tener 200.000 células en aproximadamente 50 μL de medio. Cuente el número de celda usando un hemociclo y ajuste el volumen si es necesario.
4. Añadir 1 ml de medio de cultivo de esferoide celular recién preparado en un tubo centrífugo cónico estéril de 15 ml y añadir el volumen de solución resuspended correspondiente a 200.000 células.
5. Centrífuga estas células etiquetadas magnéticamente a 180 x g durante 3 minutos, como formar un pellet celular en la parte inferior del tubo y mantener el sobrenadante, que es el medio de cultivo celular.
6. Abra ligeramente los tubos para permitir el intercambio de aire e incubar a 37 °C con un 5% de CO₂ durante un máximo de 21 días, tiempo de cultivo a lo largo del cual las células forman una estructura 3D cohesiva que resulta en un esferoide completamente formado. Cambie el medio dos veces por semana.
7. En días dados, lave los esferoides dos veces con tampón de cacodilato hecho de cacodilato de 0,2 M diluido en agua desmineralizada y arréglalos usando 2% de glutaraldehído en 0,1 M de cacodilato diluido en agua destilada durante 30 min a temperatura ambiente. Almacene los esferoides fijos en PBS hasta que se utilicen para la medición VSM o imágenes TEM. Este paso de fijación detiene todos los procesos biológicos y permite la conservación a largo plazo.

4. Cuantificación de nanopartículas magnéticas en solución y en celulo utilizando un magnetómetro de muestra vibratoria (VSM)

1. Coloque un volumen dado de solución de nanopartícula magnética (máximo 10 μL) o un único esferoide de celda en el soporte de muestra diseñado específicamente para caber en el VSM.
2. Inserte la muestra en el VSM y busque el desplazamiento de la muestra. Coloque la muestra en la posición correspondiente al máximo de magnetización.
3. Realice la primera medición en un campo magnético bajo (entre -1500 Oe y +1500 Oe) con una velocidad de 20 Oe/s.
4. Realice una segunda medición en un campo magnético alto (entre -30 000 Oe y +30 000 Oe) con una velocidad de 200 Oe/s.

5. Análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM)

1. Para las soluciones de nanopartículas, deposite 10 μL de la solución acuosa en una rejilla de cobre recubierta de carbono y déjela secar a temperatura ambiente.
2. Para las nanopartículas interiorizadas en las células, contraste los esferoides celulares fijos con extracto de té Oolong (OTE) a 0.5% diluido en 0.1 M cacodilato buffer, post fix con 1% tetroxida de osmio que contiene 1.5% de cianoferato de potasio y luego deshidratar en baños de etanol calificados, incluido en Epon. Corta ultrasecciones de 70 nm y colócalos en rejillas de cooperación.
3. Tome imágenes usando un microscopio electrónico a 80 kV con una ampliación de 1k para la observación de células enteras a 40k para la observación de compartimentos endosomales.

Resultados

Utilizando la síntesis asistida por microondas, se producen y recubren nanopartículas magnéticas con un tamaño de núcleo monodisperse de 8,8 ± 2,5 nm con citrato o PAA (Figura 1A). A continuación, las células madre se incuban con estas nanopartículas dispersas en el medio de cultivo a una concentración determinada durante 30 minutos, lo que resulta en su endocitosis y confinamiento dentro de los endosomas celulares(Figura 1B). Las células madre magné...

Discusión

Utilizando una síntesis rápida y eficiente a base de microondas, las nanopartículas magnéticas se pueden sintetizar fácilmente, con tamaño controlado y recubiertas aún más con moléculas dadas. Un paso crítico es abastecer la sal de hierro y el alcohol bencílico bajo vacío para mantener una pequeña dispersión en tamaño. El alcohol bencílico actúa como disolvente y ligando al mismo tiempo permitiendo obtener directamente óxido de hierro desnudo calibrado sin necesidad de ligandos adicionales. Después de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Benzyl alcohol for synthesis	Sigma Aldrich	8.22259
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C
Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR	VWR Chemicals	23367
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-106
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35640
Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%)	Sigma Aldrich	517003
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501
Monowave glass vial	Anton Paar	82723_us
Microwave reactor	Anton Paar	Monowave 300
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL)	Life Technologies	15140-122
Poly(acrylic acid, sodium salt)	Sigma Aldrich	416010	MW = 1200 g/mol
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35629
Sodium pyruvate solution 100mM	Sigma	S8636
Sterile conical centrifuge tube	Falcon	352097	15 mL tubes
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis	Sigma Aldrich	10396430
Ultra centrifugal filter	Amicon	AC S510024