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  • Résumé
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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Les nanoparticules d’oxyde de fer sont synthétisées au moyen d’une procédure de gel sol nonaqueous et recouvertes de molécules courtes anioniques ou de polymère. L’utilisation de la magnétométrie pour surveiller l’incorporation et les biotransformations de nanoparticules magnétiques à l’intérieur des cellules souches humaines est démontrée à l’aide d’un magnétomètre d’échantillon vibrant (VSM).

Résumé

Les nanoparticules magnétiques, faites d’oxyde de fer, présentent un intérêt particulier pour un large éventail d’applications biomédicales pour lesquelles elles sont souvent intériorisées dans les cellules, puis laissées à l’intérieur. L’un des défis consiste à évaluer leur sort dans l’environnement intracellulaire avec des méthodologies fiables et précises. C’est pourquoi nous introduisons l’utilisation du magnétomètre d’échantillon vibrant (VSM) pour quantifier avec précision l’intégrité des nanoparticules magnétiques dans les cellules en mesurant leur moment magnétique. Les cellules souches sont d’abord étiquetées avec deux types de nanoparticules magnétiques; les nanoparticules ont le même noyau produit par une synthèse rapide et efficace de gel de sol nonaqueous à base de micro-ondes et diffèrent dans leur revêtement : la molécule d’acide citrique couramment utilisée est comparée à l’acide polyacrylique. La formation de sphéroïdes cellulaires 3D est ensuite obtenue par centrifugation et le moment magnétique de ces sphéroïdes est mesuré à différents moments avec le VSM. Le moment obtenu est une empreinte directe de l’intégrité des nanoparticules, avec des valeurs décroissantes indicatifs d’une dégradation des nanoparticules. Pour les deux nanoparticules, le moment magnétique diminue au fil du temps de culture révélant leur biodégradation. Un effet protecteur du revêtement acide polyacrylique est également montré, par rapport à l’acide citrique.

Introduction

Il y a un intérêt accru pour les caractéristiques magnétiques des nanoparticules d’oxyde de fer pour un large éventail d’applications biomédicales. Leur réponse à la résonance magnétique en fait des agents de contraste fiables pour l’imagerie par résonance magnétique (IRM), un avantage en médecine régénérative où les cellules étiquetées avec des nanoparticules magnétiques peuvent être suivies in vivo après l’implantation1. À l’aide de champs magnétiques, les cellules peuvent également être guidées à distance; de cette façon, les sphéroïdescellulaires 2,3,anneaux 4,ou feuilles 5 peuvent être conçus magnétiquement et aussistimulés à distance 6, un atout dans le développement de tissus sans échafaudage. L’éventail des possibilités pour ces nanoparticules comprend également les systèmes d’administrationde médicaments 7,8 et le traitement hyperthermal magnétique et photoinduced pour tuer les cellules cancéreuses9,10,11. Pour toutes ces applications, les nanoparticules sont intégrées dans l’environnement biologique soit par injection intraveineuse, soit par internalisation directe dans les cellules, puis laissées à l’intérieur, ce qui remet en question leur destin intracellulaire.

Les analyses in vivo ont transmis une compréhension générale du sort des nanoparticules dans l’organisme : lors de l’injection dans le flux sanguin, elles sont d’abord capturées principalement par les macrophages du foie (cellules Kupffer), de la rate et de la moelle osseuse, sont progressivement dégradées, et rejoignent le pool defer de l’organisme 12,13,14,15,16,17,18,19. Les observations qualitatives ne sont possibles qu’en raison de la circulation des nanoparticules dans tout l’organisme. En règle générale, la microscopie électronique de transmission (TEM) peut être utilisée pour observer directement les nanoparticules et la présence de fer dans les organes peut être déterminée par dosage. Plus récemment, leur sort a été évalué directement sur un pool de cellules, ce qui signifie en circuit étroit sans fuite de fer, permettant une mesure quantitative de leurs biotransformations au niveau cellulaire20,21,22. De telles mesures sont possibles grâce à l’analyse des propriétés magnétiques des nanoparticules étroitement liées à leur intégrité structurelle. La magnétométrie de l’échantillon vibrant (VSM) est une technique où l’échantillon vibre périodiquement de sorte que la mesure en bobine du flux induit fournit le moment magnétique de l’échantillon au champ magnétique appliqué. Une telle détection synchrone permet une mesure rapide, qui est un atout pour déterminer les moments magnétiques d’un grand nombred’échantillons 20,21,22,23. La signature magnétique macroscopique récupérée par VSM donne ensuite un aperçu quantitatif de l’ensemble de l’échantillon biologique directement corrélé à la taille et à la structure des nanoparticules. En particulier, il fournit le moment magnétique à saturation (exprimé en émeu) des échantillons, qui est une quantification directe du nombre de nanoparticules magnétiques présentes dans l’échantillon, respectivement à leurs propriétés magnétiques spécifiques.

Il a été démontré que le traitement intracellulaire des nanoparticules magnétiques est étroitement lié à leurs caractéristiques structurelles20. Ces caractéristiques peuvent être contrôlées au moyen de protocoles de synthèse optimaux. Chaque protocole présente des avantages et des limites. Les nanoparticules d’oxyde de fer sont généralement synthétisées dans des solutions aqueuses par coprécipitation des ions fer24. Pour surmonter les limites de la polydispersité de taille nanoparticules, d’autres méthodes de synthèse telles que les méthodes de sol-gel à base de polyol ont étédéveloppées 25. Les approches nonaqueous par décomposition thermique mènent à la production des nanoparticules très bien calibrées d’oxyde de fer26. Cependant, l’utilisation de quantités massives de surfactants comme l’oleylamine ou l’acide oléique complique leur fonctionnalisation et leur transfert d’eau pour des applications biomédicales. Pour cette raison, nous synthétisons ces nanoparticules magnétiques par une voie nonaqueous de gel de sol menant à la cristallinité élevée, à la pureté et à lareproductibilité 27. Ce protocole produit des nanoparticules de taille bien contrôlées qui peuvent être réglées par variation detempérature 28. Néanmoins, la voie sol-gel non aqueuse assistée par micro-ondes a une limite de taille supérieure des nanoparticules obtenues d’environ 12 nm. Cette procédure ne serait pas adaptée pour les applications utilisant des particules ferromagnétiques à température ambiante. En plus de la synthèse de base, une autre caractéristique principale à considérer est le revêtement. Situé à la surface de la nanoparticule, le revêtement agit comme une molécule d’ancrage, aidant à l’internalisation ciblée des nanoparticules, ou il peut protéger la nanoparticule contre la dégradation. Puisque l’alcool de benzyle agit comme source d’oxygène et ligand en même temps, les nanoparticules nues sont produites sans avoir besoin de surfactants ou de ligands supplémentaires. Les nanoparticules sont ensuite facilement fonctionnalisées à la surface après synthèse sans processus d’échange de surfactants.

Dans ce cas, deux types de nanoparticules sont évalués qui possèdent le même noyau et diffèrent dans le revêtement. Le noyau est synthétisé à l’aide d’une technique à base de micro-ondes rapide et très efficace. Les deux revêtements comparés se composent de l’acide citrique, l’un des plus utilisés comme agent de revêtement dans les applications biomédicales29,30, et l’acide polyacrylique (PAA), un revêtement polymérique avec un grand nombre de fonctions de chélament. Les mesures de magnétométrie VSM sont ensuite utilisées d’abord pour quantifier l’absorption de nanoparticules par les cellules, puis comme une évaluation directe de l’intégrité structurale des nanoparticules lors de l’internalisation des cellules souches. Les résultats démontrent que la concentration d’incubation influe sur l’absorption des nanoparticules et que le revêtement influe sur leur dégradation, le grand nombre de molécules d’ancrage de l’AAP protégeant le noyau de la dégradation.

Protocole

1. Synthèse des nanoparticules magnétiques

  1. Synthèse de base – assistée par micro-ondes
    1. Dissoudre 400 mg d’acétytonate de fer (III) (>99.9%) dans 10 mL d’alcool de benzyle (BA, 99.8%) dans un flacon en verre mono ondes de 30 mL.
    2. Augmenter la température de la suspension de 25 à 250 °C en 20 min (à un taux de 11,25 °C/min) et la maintenir à 250 °C pendant 30 minutes à l’aide d’un réacteur à micro-ondes.
    3. Transférer les nanoparticules qui en résultent en suspension dans de l’alcool de benzyle dans un flacon de verre et séparer les nanoparticules à l’aide d’un aimant néodymium pendant 30 min.
    4. Laver le précipité dans le flacon de verre précédent de 100 mL avec 10 mL de dichloromethane, 1 M d’hydroxyde de sodium, éthanol, pH 7 eau (trois fois) à l’aide d’un aimant néodymium pendant 5 min chaque étape pour pelleter les nanoparticules et enlever le supernatant.
    5. Ajustez la suspension nanoparticule dans l’eau au pH 2 à l’aide d’acide chlorhydrique de 1 M, puis centrifugeuse dans des filtres ultracentrifuges kDa de 100 kDa à 2 200 x g pendant 10 min.
    6. Retirer le filtrate, ajouter 12 mL d’acide chlorhydriquede 10 à 2 M à la solution de nanoparticules et centrifugeuse dans des filtres ultracentrifuges kDa de 100 kDa à 2 200 x g pendant 10 min (trois fois). Diluer ensuite la solution de nanoparticules dans un rayon de 10 mL d’acide chlorhydriquede 10 à 2 M avant de l’enduire.
  2. Revêtement
    1. Diluer 175 mg d’acide citrique et d’acide polyacrylique dans l’eau au pH 2 dans un flacon de verre de 100 mL et ajuster le pH à 2 avec une solution d’acide chlorhydrique de 1 M.
    2. Ajouter la dispersion aqueuse des nanoparticules de 10 mL à la solution de la molécule de revêtement, correspondant à un rapport de masse de 5 entre la molécule de revêtement et les nanoparticules. Agiter pendant 2 h sous l’agitation magnétique à température ambiante.
    3. Après la réaction, ajuster le pH à 7 avec 1 M d’hydroxyde de sodium.
    4. Centrifugeuse la solution nanoparticule 3 fois avec de l’eau déionisée (DI) dans des filtres ultracentrifuges de 100 kDa à 2 200 x g pendant 10 min; retirer le filtrate et diluer la solution de nanoparticules dans 12 mL d’eau DI.

2. Culture et étiquetage magnétique des cellules souches

  1. Culture des cellules souches mésenchymales humaines (MSC) dans le milieu complet de croissance des cellules souches mésenchymales (MSCGM) à 37 °C et 5 % de CO2. Lorsque les cellules sont à 90% confluent, ajouter 10 mL de trypsine-EDTA préchauffé à 37 °C par flacon de 150 cm² et laisser pendant 2-3 minutes pour détacher les cellules.
    1. Pour savoir quand les cellules sont détachées, observez-les à l’aide d’un microscope à champ lumineux. Resuspendez les cellules détachées dans MSCGM et divisez-les en quatre flacons de 150 cm². Amplifiez les cellules de cette façon jusqu’au passage 4 à 5.
  2. Préparer la solution des nanoparticules magnétiques pour l’étiquetage cellulaire : disperser la concentration choisie de nanoparticules d’oxyde de fer dans le milieu sans sérum du Roswell Park Memorial Institute (RMPI-1640) sans glutamine. RPMI est utilisé pour l’incubation de nanoparticules (et les étapes de rinçage connexes) car il a une force ionique inférieure à DMEM et empêche mieux les événements d’agrégation de nanoparticules.
  3. Lorsque les cellules sont au passage 4 ou 5 et 90% confluent, enlever le milieu MSCGM, rincer les cellules avec rpmi sans sérum (sans glutamine) et ajouter 10 mL de solution nanoparticules d’oxyde de fer par flacon de culture de 150 cm2, qui est le volume minimum requis pour couvrir toutes les cellules.
  4. Incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 30 min, puis jeter la solution nanoparticule. Lavez-le une fois avec du RPMI-1640 sans sérum (sans glutamine) et incubez-le avec le medium aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine (25 mL par flacon de 150 cm2) pendant la nuit à 37 °C et 5 % de CO2 pour permettre une intériorisation complète des nanoparticules.

3. Formation de sphéroïdes à cellules souches

  1. Préparer fraîchement le milieu de culture cellule-sphéroïde composé de glucose élevé DMEM avec de la L-glutamine complétée par 50 μM D-ascorbic acide 2-phosphate, 0,1 μM dexaméthasone, 1 mM de pyruvate de sodium, 0,35 mM L-proline, et 1% supplément de culture universelle contenant de l’insuline, du transferrin humain et de l’acide sélénous (ITS-Premix).
  2. Détachez les MSC magnétiques en ajoutant 10 mL de trypsine-EDTA préchauffé à 37 °C par flacon de 150 cm2 pendant 2 à 3 minutes. Lorsque les cellules sont détachées, inactivez immédiatement la trypsine en ajoutant 1/3 du volume de DMEM complété par 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine préchauffée à 37 °C.
  3. Centrifugeuse les cellules dissociées à 260 x g pendant 5 min, aspirer les médias et re-suspendre les cellules dans un petit volume (moins de 1 mL par flacon de 150 cm²) de milieu de culture cellule-sphéroïde comme avoir 200.000 cellules dans environ 50 μL de milieu. Comptez le numéro de cellule à l’aide d’un hémomètre et ajustez le volume si nécessaire.
  4. Ajouter 1 mL de milieu de culture cellulaire-sphéroïde fraîchement préparé dans un tube de centrifugeuse conique stérile de 15 mL et ajouter le volume de solution résuspendée correspondant à 200 000 cellules.
  5. Centrifugeuse ces cellules étiquetées magnétiquement à 180 x g pendant 3 min comme la formation d’une pastille cellulaire au fond du tube et de garder le supernatant, qui est le milieu de culture cellulaire.
  6. Ouvrez légèrement les tubes pour permettre l’échange d’air et l’incubation à 37 °C avec 5% de CO2 pendant jusqu’à 21 jours, temps de culture le long duquel les cellules forment une structure 3D cohésive qui se traduit par un sphéroïde entièrement formé. Changez le milieu deux fois par semaine.
  7. Les jours donnés, lavez les sphéroïdes deux fois avec un tampon cacodylate fait de cacodylate de 0,2 M dilué dans de l’eau déminéralisée et fixez-les à l’aide de glutaraldehyde de 2 % dans un tampon cacodylate de 0,1 M dilué dans de l’eau distillée pendant 30 min à température ambiante. Conserver les sphéroïdes fixes dans PBS jusqu’à ce qu’ils soient utilisés pour la mesure vsm ou l’imagerie TEM. Cette étape de fixation arrête tous les processus biologiques et permet une conservation à long terme.

4. Quantification des nanoparticules magnétiques en solution et en cellulo à l’aide d’un magnétomètre d’échantillon vibrant (VSM)

  1. Placez soit un volume donné de solution de nanoparticule magnétique (maximum 10 μL) soit un seul sphéroïde cellulaire dans le porte-échantillon spécialement conçu pour s’insérer dans le VSM.
  2. Insérez l’échantillon dans le VSM et analysez le décalage de l’échantillon. Placez l’échantillon à la position correspondant au maximum de magnétisation.
  3. Effectuez la première mesure à un faible champ magnétique (entre -1500 Oe et +1500 Oe) avec un taux de 20 Oe/s.
  4. Effectuez une deuxième mesure à un champ magnétique élevé (entre -30 000 Oe et +30 000 Oe) avec un taux de 200 Oe/s.

5. Analyse de microscopie électronique de transmission (TEM)

  1. Pour les solutions de nanoparticules, déposez 10 μL de la solution aqueuse sur une grille de cuivre recouverte de carbone et laissez-la sécher à température ambiante.
  2. Pour les nanoparticules intériorisées dans les cellules, comparez les sphéroïdes cellulaires fixes avec l’extrait de thé Oolong (OTE) à 0,5 % dilué dans un tampon cacodylate de 0,1 M, après correction avec 1 % de tétroxide d’osmium contenant 1,5 % de cyanoferrate de potassium, puis déshydratez dans des bains d’éthanol classés, inclus dans Epon. Trancher les ultrasections de 70 nm et les déposer sur des grilles de tonneliers.
  3. Prenez des images à l’aide d’un microscope électronique à 80 kV avec un grossissement de 1k pour l’observation de cellules entières à 40k pour l’observation des compartiments endosomaux.

Résultats

À l’aide de la synthèse assistée par micro-ondes, des nanoparticules magnétiques d’une taille de noyau monodisperse de 8,8 ± de 2,5 nm sont produites et recouvertes de citrate ou de PAA (figure 1A). Les cellules souches sont ensuite incubées avec ces nanoparticules dispersées dans le milieu de la culture à une concentration donnée pendant 30 minutes, ce qui entraîne leur endocytose et leur confinement dans les endosomes cellulaires (figure 1B). Les...

Discussion

À l’aide d’une synthèse rapide et efficace à base de micro-ondes, les nanoparticules magnétiques peuvent facilement être synthétisées, de taille contrôlée, et enduites davantage de molécules données. Une étape critique consiste à stocker le sel de fer et l’alcool de benzyle sous vide pour garder une petite dispersion dans la taille. L’alcool de benzyle agit à la fois comme solvant et ligand en même temps permettant d’obtenir directement étalonné l’oxyde de fer nu sans avoir besoin de ligands ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ces travaux ont été soutenus par l’Union européenne (projet ERC-2014-CoG MaTissE #648779). Les auteurs aimeraient reconnaître la plate-forme de caractérisation physico-chimique CNanoMat de l’Université Paris 13.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTA (1x)Life Technologies25300-054
Benzyl alcohol for synthesisSigma Aldrich8.22259
DexamethasoneSigmaD4902Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C
Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPURVWR Chemicals23367
DMEM with Glutamax ILife Technologies31966-021No sodium pyruvate, no HEPES
Ethanol absoluteVWR20821.310
Fetal Bovine SerumLife Technologies10270-106
Formalin solution 10% neutral bufferedSigmaHT5012
Hydrochloric acid, 1.0N Standardized SolutionAlfa Aesar35640
Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%)Sigma Aldrich517003
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)Corning354352
L-Ascorbic Acid 2-phosphateSigmaA8960Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water
L-ProlineSigmaP5607Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Mesenchymal Stem Cell (MSC)LonzaPT-2501
Monowave glass vialAnton Paar82723_us
Microwave reactorAnton PaarMonowave 300
MSCGM BulletKit mediumLonzaPT-3001For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2Life Technologies14190-094
Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL)Life Technologies15140-122
Poly(acrylic acid, sodium salt)Sigma Aldrich416010MW = 1200 g/mol
RPMI medium 1640, no GlutamineLife Technologies31870-025No sodium pyruvate, no HEPES
Sodium hydroxide, 1.0N Standardized SolutionAlfa Aesar35629
Sodium pyruvate solution 100mMSigmaS8636
Sterile conical centrifuge tubeFalcon35209715 mL tubes
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermo Fisher Scientific25300054
Tri-sodium citrateVWR33615.268Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for AnalysisSigma Aldrich10396430
Ultra centrifugal filterAmiconAC S510024

Références

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