בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

Summary

מוצג הוא פרוטוקול לבידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים ובעלי חיים מפרוסות שריר הלב לחתוך vibratome. תפוקות גבוהות של תאים סובלניים סידן (עד 200 תאים / מ"ג) ניתן להשיג כמויות קטנות של רקמה (<50 מ"ג). הפרוטוקול ישים על שריר הלב החשוף לאישמיה קרה עד 36 שעות.

Abstract

הבידוד של מיוציטים לבביים חדריים מלב בעלי חיים ולבבות אנושיים היא שיטה בסיסית במחקר לב. קרדיומיוציטים בעלי חיים מבודדים בדרך כלל על ידי עירוי כלילית עם אנזימי עיכול. עם זאת, בידוד cardiomyocytes אנושי הוא מאתגר כי דגימות שריר הלב האנושי בדרך כלל אינם מאפשרים זינגה כלילית, פרוטוקולי בידוד חלופי לגרום לתשואות נמוכות של תאים קיימא. בנוסף, דגימות שריר הלב האנושי הן נדירות ותו זמינות רק באופן קבוע במוסדות עם ניתוח לב באתר. זה פוגע בתרגום של ממצאים מהחיות לקרדיומיוציטים אנושיים. מתואר כאן הוא פרוטוקול אמין המאפשר בידוד יעיל של מיוציטים חדריים מגוף שריר הלב אנושי ובעלי חיים. כדי להגדיל את יחס פני השטח לנפח תוך מזעור נזק לתא, רקמת שריר הלב פרוסות 300 μm עבה נוצרים מדגימות שריר הלב עם ויברטום. פרוסות רקמות מתעכלות לאחר מכן עם פרוטאז וcollagenase. עכברוש שריר הלב שימש כדי לבסס את הפרוטוקול ולכרות את התשואות של מיוציטים קיימא, סידן סובלני על ידי ספירת תאים ציטומטרי זרימה. השוואה עם שיטת נתח רקמות הנפוץ הראה תשואות גבוהות באופן משמעותי של cardiomyocytes בצורת מוט (41.5 ± 11.9 לעומת 7.89 ± 3.6%, p < 0.05). הפרוטוקול תורגם לכישלון ולא נכשל שריר הלב האנושי, שם התשואות היו דומות כמו שריר הלב חולדה, ושוב, גבוה באופן ניכר מאשר עם שיטת נתח רקמות (45.0 ± 15.0 לעומת 6.87 ± 5.23 תאים / מ"ג, p < 0.05). במיוחד, עם הפרוטוקול שהוצג ניתן לבודד מספרים סבירים של cardiomyocytes אנושי קיימא (9-200 תאים / מ"ג) מכמויות מינימליות של רקמה (<50 מ ג). לפיכך, השיטה ישימה על שריר הלב בריא ונכשל הן מלבבות האדם והן מלב בעלי החיים. יתר על כן, ניתן לבודד מיוציטים מרגשים והתכווצות מדגימות רקמות אנושיות המאוחסנים עד 36 שעות בתמיסה קרדיופלגית קרה, מה שהופך את השיטה שימושית במיוחד עבור מעבדות במוסדות ללא ניתוח לב באתר.

Introduction

טכניקה שסללה את הדרך לתובנות חשובות על פיזיולוגיה cardiomyocyte היא הבידוד של cardiomyocytes חדרי חיים מלבבות שלמים¹. cardiomyocytes מבודד יכול לשמש כדי ללמוד מבנה תאי נורמלי ותפקוד, או את ההשלכות של ניסויי vivo; לדוגמה, כדי להעריך שינויים אלקטרופיזיולוגיה תאית או צימוד התכווצות-ריתוך במודלים של בעלי חיים של מחלות לב. בנוסף, cardiomyocytes מבודד יכול לשמש עבור תרבות תאים, התערבויות תרופתיות, העברת גנים, הנדסת רקמות, ויישומים רבים אחרים. לכן, שיטות יעילות לבידוד cardiomyocyte הן בעל ערך בסיסי למחקר לב בסיסי ותרגום.

קרדיומיוציטים מיונקים קטנים, כגון מכרסמים, ומיונקים גדולים יותר, כגון חזירים או כלבים, מבודדים בדרך כלל על ידי תסיסה כלילית של הלב עם פתרונות המכילים קולאזנס גולמי ו/או פרוטאזים. זה תואר כשיטה "תקן זהב" לבידוד cardiomyocyte, וכתוצאה מכך תשואות של עד 70% של תאים קיימא². הגישה שימשה גם עם לב אנושי, וכתוצאה מכך ניבים cardiomyocyte^{מקובל 3,,4,5}. עם זאת, מכיוון שזמיה כלילית אפשרית רק אם הלב השלם או טריז שריר הלב הגדול המכיל ענף עורק כלילי זמין, רוב דגימות הלב האנושיות אינן מתאימות לגישה זו בשל גודלן הקטן והיעדר כלי דם מתאימים. לכן, הבידוד של קרדיומיוציטים אנושיים הוא מאתגר.

דגימות שריר הלב האנושי מורכבות בעיקר נתחי רקמה בגודל משתנה (כ 0.5 x 0.5 x 0.5 ס"מ עד 2 x 2 ס"מ), שהושגו באמצעות ביופסיות אנדומיוקרדיאליות⁶, myectomies^{מחיצה 7}, השתלות VAD⁸, או^{מלבבות מושתלים 9}. ההליכים הנפוצים ביותר לבידוד cardiomyocyte להתחיל עם טחינה הרקמה באמצעות מספריים או אזמל. מגעים מתא לתא משובשים לאחר מכן על ידי טבילה במאגרי סידן או סידן נמוך. זה מלווה שלבי עיכול מרובים עם תמציות אנזים גולמי או אנזימים מטוהרים כמו פרוטאזים (למשל, שלושה נסיפסין), קולגן, היאלורונידאז, או אלסטאז, וכתוצאה מכך התפוררות של מטריצה חוץ תאית ושחרור של קרדיומיוציטים. בשלב סופי וקריטי, יש לשחזר בזהירות ריכוז סידן פיזיולוגי, או שנגרם נזק תאי בשל פרדוקס^{הסידן 10,,11,,12}. גישת בידוד זו נוחה אך בדרך כלל לא יעילה. לדוגמה, מחקר אחד מצא כי כמעט 1 גרם של רקמת שריר הלב נדרש כדי להשיג מספר מספיק של cardiomyocytes מתאים לניסויים הבאים¹³. סיבה אפשרית לתשואות נמוכות היא השיטה הקשה יחסית של טחנת הרקמה. זה עלול לגרום נזק במיוחד cardiomyocytes ממוקם בשולי הנתח למרות מיוציטים אלה נוטים ביותר להשתחרר על ידי עיכול אנזימטי.

היבט נוסף שעשוי להשפיע על יעילות הבידוד ואיכות התאים המתקבלים מדגימות אנושיות הוא משך הזמן של איסכמיה של רקמות. רוב הפרוטוקולים מזכירים זמני הובלה קצרים למעבדה כתור מוקדם לתוצאות טובות. זה מגביל את המחקר של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים למעבדות עם מתקני ניתוח לב בקרבת מקום. יחד, הגבלות אלה פוגעות באימות ממצאים חשובים ממודלים של בעלי חיים בקרדיומיוציטים אנושיים. פרוטוקולי בידוד משופרים המאפשרים תפוקות קרדיומיוציט גבוהות מכמויות קטנות של רקמות, רצוי ללא נזק רציני לאחר זמני הובלה ממושכים, ולכן רצויים.

מתואר כאן פרוטוקול בידוד המבוסס על העיכול האנזימטי של פרוסות רקמת שריר הלב דקה שנוצר עם vibratome^14,15. אנו מוכיחים כי בידוד מפרוסות רקמות הוא הרבה יותר יעיל מזה מחתיכות רקמה טחון עם מספריים. השיטה המתוארת לא רק מאפשרת תפוקה גבוהה של cardiomyocytes אנושי קיימא מכמויות קטנות של רקמת שריר הלב, אלא גם ישימה דגימות המאוחסנות או מועברות בתמיסה קרדיופלגית קרה עד 36 שעות.

Protocol

כל הניסויים בחולדות אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש Mittelfranken, בוואריה, גרמניה. איסוף ושימוש בדגימות רקמת לב אנושית אושר על ידי ועדות הביקורת המוסדיות של אוניברסיטת ארנגן-נירנברג ואוניברסיטת רוהר בוכום. מחקרים נערכו על פי הנחיות הצהרת הלסינקי. המטופלים נתנו את הסכמתם הכתובה לפני איסוף רקמות.

חולדות Wistar נקבה (150-200 גרם) הושגו מסחרית, מותאם על ידי הזרקת 100 מ"ג/ק"ג של תיופנטל נתרן תוך-פריצינלי, והמתת חסד על ידי נקע צוואר הרחם ואחריו ניקור חזה וחתך של הלב. דגימות רקמת לב אנושית נאספו מהליבה השמאלית-חדרית במהלך השתלת מכשירי סיוע מכניים, מניתוח מיסטרה של מחיצה, מטטרולוגיה של ניתוח מתקן של פאלוט, או מקיר החדר השמאלי החופשי של לבבות שנשתלו. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד מרקמות חדר האדם. הבידוד של קרדיומיוציטים חולדה בוצע בהתאם, אבל עם אנזימים שונים (ראה טבלת חומרים). זרימת עבודה סכמטית של הפרוטוקול מאוירת באות 1.

1. הכנת מאגרים, פתרונות ואנזימים

1. הכן מאגרים ופתרונות כמפורט בטבלה 1.
2. מחממים פתרונות 1, 2, 3 והפתרון של Tyrode ששונה ל- 37°C. אחסן את פתרון החיתוך ב- 4 °C עד לשימוש.
   הערה: עבור 1-2 פרוסות שריר הלב בסך הכל כ 15 מ"ל, 8 מ"ל, ו 5 מ"ל של פתרונות 1, 2, ו 3 נדרשים לבידוד בצלחת אחת 35 מ"מ תרבות רקמות. קנה מידה בהתאם לבידודים בו-זמנית במנות מרובות. פתרון חיתוך ניתן להקפיא ולהיות כל הזמן ב -20 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים.
3. לשקול 1 מ"ג של חלבון XXIV (ראה טבלת חומרים)לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל prechilled ולאחסן על קרח עד לשימוש. זה לעיבוד מדגם אחד. להגדיל את הסכום בהתאם. אין לערבב את החלבונים ואת הקולגן.
4. לשקול 8 מ"ג של קולגן CLSI (ראה טבלת חומרים)לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל prechilled ולאחסן על קרח עד לשימוש. זה לעיבוד מדגם אחד. להגדיל את הסכום בהתאם. אין לערבב את החלבונים ואת הקולגן.
   התראה: תחבשו מסכת פנים או תעבדו מתחת למכסה מנוע אדים כדי למנוע שאיפת אבקת אנזימים.
   הערה: פעילות האנזימים עשויה להשתנות בהמון שונה. לכן, הריכוז האופטימלי עשוי להיות שונה ויש לקבוע עם כל אנזים שנרכש לאחרונה¹⁶.

2. אחסון והובלה של רקמת שריר הלב

1. לאחסן ולהעביר דגימות לב אנושיות בקירור, 4 ° C חיתוך פתרון(שולחן 1).
2. השתמש באותו פתרון לעיבוד רקמות נוסף וחיתוך ויברטום.
   הערה: ביופסיות ודגימות לב כירורגיות יש להעביר באופן מיידי לפתרון חיתוך ב 4 °C ולאחר מכן ניתן לאחסן או להעביר ב 4 ° C לכל היותר 36 שעות לפני היישום של פרוטוקול זה.

3. עיבוד וחיתוך של הרקמה

הערה: הפרוטוקול לחיתוך רקמות עוקב פישר ואח^'15.

1. גזירה של בלוק הרקמה
   התראה: רקמת לב אנושית עלולה להיות מדבקת. השתמש תמיד בבגדי מגן ובצע את תקנות הבטיחות של המוסד שלך. לטפל בזהירות להבים בשימוש להשליך במכולות בטיחות.
   1. מניחים את הדגימה בצלחת תרבות רקמות של 100 מ"מ מלאה בתמיסת חיתוך קרה של 20 מ"ל ולשמור על צלחת מקורר של 4 מעלות צלזיוס.
   2. הסר עודפי רקמה פיברוטית ושומן אפיארדיאלי עם אזמל. במקרה של דגימה transmural, להסיר שכבות trabeculae ורקמות ליד אנדוקארדיום.
      הערה: רקמה פיברוטית נוקשה ומופיעה לבנה. שומן הוא בדרך כלל רך ומופיע לבן לצהוב. שכבות טרבקולה ורקמות אנדוקרדיאליות ניתן לזהות מהרכב הרקמה הרופפת שלהם וכיוון סיבים לא מיושר בהשוואה שריר הלב של שכבות epicardial
   3. לעיבוד ויברטום אופטימלי, לחתוך בלוקים רקמה מלבנית של כ 8 מ"מ x 8 מ"מ x 8 מ"מ עם אזמל מדגימה רקמות גדולה יותר. עבור ביופסיות קטנות יותר לדלג על שלב זה ולעבור להטביעה agarose.
2. הטבעת רקמת לב באגזום בנקודת התכה נמוכה
   1. להרתיח 400 מג של נקודת התכה נמוכה agarose ב 10 מל של תמיסת חיתוך ב זכוכית.
      התראה: לבש כפפות ומשקפיים בטיחות כדי למנוע כוויות. לטפל בכלי זכוכית חמים רק עם בלאי הגנה מפני חום.
   2. מלאו מזרק של 10 מ"ל בג'ל אגרוז חם ומומס. לאטום את המזרק ולאפשר agarose כדי לשוויון באמבט מים 37 מעלות C לפחות 15 דקות.
   3. השתמשו במקציות כדי למקם את דגימת הלב הקצוצות או הביופסיה לצלחת נקייה של תרבות רקמות של 35 מ"מ עם האפיקארדיום פונה כלפי מטה ולהסיר נוזל עודף עם ספוגית סטרילית.
   4. יוצקים את האנגרוז המוגן (שלב 3.2.2) על הרקמה על ידי ריקון המזרק. לאבטח את הרקמה נגד תנועה עם ממחטות תוך שפיכת agarose. ודא כי הרקמה שקועה לחלוטין agarose.
   5. מניחים מיד את המנה על קרח ולתת לאגרוז להתבסס במשך 10 דקות.
3. חיתוך שריר הלב
   1. הר סכין גילוח חדש למחזיק הלהב של הרטט ולכייל את הרטט על-ידי כוונון הסטת z של הלהב במידת האפשר.
      הערה: פרוטוקול זה משתמש ברטט עם התקן כיול בסיוע אינפרא-אדום כדי ליישר את הלהב במיקום אופקי עם סטיית z מינימלית (הסטה מדודה <0.1 μm).
   2. השתמשו באזמל כדי לחסום רקמת א-גרוז שמתאימה למחזיק הדגימה של הויברטום. כדי להבטיח יציבות, ודא כי הרקמה עדיין שקועה מספיק באגרוז (שולי agarose - 8 מ"מ).
   3. לתקן את בלוק agarose למחזיק הדגימה עם שכבה דקה של דבק cyanoacrylate ולחץ עדין.
   4. מניחים את מחזיק הדגימה עם הרקמה לתוך אמבט הרטט. ממלאים את האמבטיה בתמיסת חיתוך ולשמור על 4-6 °C לאורך כל העיבוד עם קרח כתוש, מלא במיכל הקירור בחוץ של vibratome.
   5. צור פרוסות בעובי 300 μm במהירות מתקדמת של כ-0.1 מ"מ לשעה, תדר נדנוד של 80 הרץ, משרעת רוחבית של 1.5 מ"מ וזווית להב של 15°. בעת טיפול פרוסות, להחזיק את agarose במקום הרקמה עצמה כדי למנוע נזק לרקמות. אחסן את הפרוסות בתמיסת החיתוך ב- 4 °C למשך 2 שעות לכל היותר, במידת הצורך.
      הערה: Cardiomyocytes הם מונחה במקביל epicardium. לכן, חשוב לחתוך במקביל epicardium כדי למנוע נזק מיוצייט מוגזם. מומלץ להיפטר מ-1-3 הפרוסות הראשונות, מכיוון שיש להשתמש רק בפרוסות אחידות של עובי קבוע לבידוד. עבור ביופסיות רקמות קטנות, עם זאת, רק להשליך את הפרוסה הראשונה.
   6. בדוק יישור cardiomyocyte תחת מיקרוסקופ אור סטנדרטי עם הגדלה של 40-100x.

4. עיכול רקמות

1. מניחים את לוחית החום על שייקר המעבדה וחממים אותה ל-37 מעלות צלזיוס. הפעל את שייקר המעבדה ב65 סל"ד.
2. ממיסים את החלבונים (שהוכנו בשלב 1.3) ב-2 מ"ל של פתרון 1 (שלב 1.1 ו-1.2) ותדגירה ב-37°C עד לשימוש. אין לערבב את החלבונים ואת הקולגן.
3. ממיסים את הקולגן (שהוכן בשלב 1.4) ב- 2 מ"ל של פתרון 1 (שלב 1.1 ו- 1.2) ותדגירה ב- 37 °C עד לשימוש. אין לערבב את החלבונים ואת הקולגן.
   התראה: ללבוש משקפי מגן וכפפות, כי אנזימים מומסים יכולים לגרום לפציעות עור ועין.
4. הוסף סידן כלוריד (CaCl₂₎קולגן המכיל פתרון (מוכן בשלב 4.3) לריכוז סופי של 5 μM.
5. השתמשו במרטטים כדי להעביר פרוסת רקמה מאמבט הרטט לצלחת נקייה של תרבות רקמות של 60 מ"מ מלאה בתמיסת חיתוך מקצטת מראש ב-5 מ"ל (שלב 1.1 ו-1.2) ולשמור על קרח.
6. בזהירות להסיר את agarose מרקמות שריר הלב עם להב או משקולות.
   הערה: הימנע מתח עודף ולחץ גהה על פרוסות שריר הלב, כי הם יכולים לפגוע cardiomyocytes.
7. כדי לבצע את השטיפה הראשונית, מניחים צלחת נקייה של תרבות רקמות 35 מ"מ על צלחת החום ומלאו אותה בתמיסה של 2 מ"ל (37°C) 1. מעבירים 1-2 פרוסות שריר הלב לצלחת המוכנה עם מפסים. שאף את הפתרון עם פיפטה 1 מ"ל ולבצע את שלבי השטיפה 2x כדי להסיר שרידים של פתרון חיתוך.
   הערה: אין לאכוף את פרוסות הלב. הפתרונות והפרוסות צריכים להישאר בטמפרטורה קבועה של 35 מעלות צלזיוס על לוח החום הנסער. כוונן את טמפרטורת לוחית החום במידת הצורך.
8. הסר את הפתרון 1 מהצלחת והוסף 2 מ"ל של תמיסת החלבונים (שלב 4.2). דגירה במשך 12 דקות על צלחת החום ב 65 סל"ד.
9. לשטוף 2x עם 2 מ"ל של פתרון טרום חם 1 (37 ° C).
10. הסר את הפתרון 1 מהצלחת והוסף 2 מ"ל של פתרון קולגנאז (שלבים 4.3 ו- 4.4). דגירה לפחות 30 דקות על לוח החום ב 65 סל"ד.
11. בדוק מיוציטים בודדים בחינם ב 30, 35, 40 דקות, וכו ', על ידי הצבת המנה תחת מיקרוסקופ אור. עבוד במהירות כדי למנוע קירור משמעותי של הפתרון.
    הערה: זמן העיכול הנדרש עשוי להשתנות בהתאם לחוקת הרקמה ולדרגת הפיברוזיס. ברגע הרקמה מקבל רך באופן ניכר ומנתק בקלות כאשר משך בעדינות, זמן העיכול האופטימלי כבר הגיע. אם יש מספיק רקמות זמינות, ניתן לעכל מספר פרוסות במקביל לתקופות עיכול שונות.
12. כאשר הרקמה מתעכלת ומיוציטים בודדים גלויים (שלב 4.11), לשטוף 2x עם 2 מ"ל של פתרון טרום חמם 2 (37 ° C) ולמלא שוב עם 2 מ"ל.

5. ניתוב רקמות

1. ניתכו את פרוסות הרקמה המעוכלות במלקות על ידי משיכת הסיבים בזהירות.
2. בזהירות פיפטה מספר פעמים עם פיפת פסטר חד-פעמיים (קוטר פתיחה >2 מ"מ).
   הערה: השימוש במלחציים ו pipetting יכול לגרום למתח מכני ולגרום נזק cardiomyocyte. עם זאת, זהו צעד מכריע להפרדה של התאים. השתמש בממצקים עדינים כדי למזער נזק לתאים ולנתק בזהירות את הפרוסות לחתיכות קטנות יותר.
3. בדוק את קרדיומיוציטים בצורת מוט משוחררים מתחת למיקרוסקופ האור.

6. שיקום ריכוז הסידן הפיזיולוגי

1. לאט להגדיל את ריכוז הסידן מ 5 μM כדי 1.5 mM תוך כדי עצבנות ב 35 מעלות צלזיוס על צלחת החום. השתמש בפתרונות מניות של 10 מ"מ ו- 100_מ"מ. שלבים מומלצים: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1,200, 1,500 μM. לאפשר לתאים להסתגל לרמות הסידן מוגברת במרווחי דגירה 5 דקות בין כל שלב.
2. הסר נתחי רקמה מעומצמים בזהירות עם ממחטות או לסנן את מתלי התא דרך רשת ניילון עם גודל נקבוביות 180 μm בסוף עלייה בסידן.

7. הסרת סוכן ניתק מכני

1. להפסיק את התסיסה ולהסיר לאט שליש מהפתרון (~ 700 μL) מההתחלה עם 1,000 μL pipette. הימנע משאיפה של cardiomyocytes.
   הערה: אם רקמה לא אוכלז הוסר, cardiomyocytes יצטברו במרכז המנה, אשר מקל על השאיפה של פתרון ללא תאים. אם לא, להעביר את פתרון התא צינור צנטריפוגה 15 מ"ל ולאפשר לתאים לשקע במשך 10 דקות ב 35 ° C, לאחר מכן לשאוף 700 μL של supernatant ולהיפטר, לתוסף את התאים, להעביר אותם בחזרה לצלחת תרבות רקמות 35 מ"מ ולהמשיך עם שלב 7.2.
2. להוסיף 700 μL של פתרון 3 לתאים, לחדש את התסיסה על לוח החום דגירה במשך 10 דקות.
3. חזור על שלבים 7.1 ו- 7.2.
4. להעביר את הפתרון 15 mL צנטריפוגה צינור ולאפשר cardiomyocytes לחשמל למינימום של 10 דקות ומקסימום של 30 דקות בטמפרטורת החדר או ספין ב 50 x g עבור 1 דקות. הסר את supernatant לחלוטין וsspend בפתרון של Tyrode שונה או מאגר הניסויים הרצוי.
   הערה: ניתן לאחסן Cardiomyocytes בתמיסה של Tyrode שונה (טבלה 1) במשך מספר שעות ב 37 °C ו 5% CO₂ לפני השימוש.
5. אמת את איכות התא עם מיקרוסקופ אור סטנדרטי בהגדלה של 40x ו- 200x.
   הערה: כ-30%-50% מהקרדיומיוציטים צריכים להיות בצורת מוט, חלקים ללא ממברנה, ולהציג פלגים צולבים ברורים. רק 5-10% מהתאים ה קיימא צריך להראות התכווצויות ספונטניות.

תוצאות

כדי לאמת את יעילות הבידוד, הפרוטוקול שימש עם שריר הלב חולדה ומספר המיוציטים קיימא כתוצאה מכך הושווה למספרים שהושגו על ידי בידוד באמצעות זביה כלילית ועל ידי בידוד מחתיכות רקמות קטנות (בידוד נתחים, איור 2). בידוד נתחים ובידוד מפרוסות רקמות בוצעו מאותם לבבות. לבידוד באמצעות עי...

Discussion

למרות הבידוד של cardiomyocytes חיים הוקמה לפני יותר מ 40 שנים והוא עדיין תנאי מוקדם עבור גישות ניסיוניות רבות במחקר לב, זה נשאר טכניקה קשה עם תוצאות בלתי צפויות. בידוד Cardiomyocyte באמצעות שאיפה של העורקים הכליליים עם תמיסת אנזים משמש בדרך כלל עבור לבבות של בעלי חיים קטנים ומניב מספר גדול של תאים קיימא. ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
2,3-butanedionemonoxime	Carl Roth	3494.1	Purity>99%
Bovine serum albumin	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
Creatine monohydrate	Alfa Aesar	B250009
Glucose	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3
KCl	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
L-glutamic acid	Fluka Biochemica	49450
Low melting-point agarose	Carl Roth	6351.5
MgCl2 x 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Taurine	Sigma Aldrich	T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher Scientific	D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I	Worthington	LS004196	Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II	Worthington	LS004176	Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg)
Protease XIV	Sigma Aldrich	P8038	Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV	Sigma Aldrich	P5147	Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa)	BD Bioscience	649225
Centrifuge tube, 15 mL	Corning	430790
Centrifuge tube, 50 mL	Corning	430829
Compact shaker	Edmund Bühler	KS-15 B control	Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes	Carl Roth	EA65.1	For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps	FST	11271-30
Heatblock	VWR	BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm	Merck	NY8H04700
TC Dish 100, Standard	Sarstedt	83.3902
TC Dish 35, Standard	Sarstedt	83.3900
TC Dish 60, Standard	Sarstedt	83.3901
Vibratome (VT1200S)	Leica	1491200S001	Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection