Isolement des cardiomyocytes ventriculaires humains des tranches myocardales vibratoires-cut

Résumé

Présenté est un protocole pour l’isolement des cardiomyocytes ventriculaires humains et animaux des tranches myocardales vibratoires. Des rendements élevés de cellules tolérantes au calcium (jusqu’à 200 cellules/mg) peuvent être obtenus à partir de petites quantités de tissus (<50 mg). Le protocole s’applique au myocarde exposé à l’ischémie froide jusqu’à 36 h.

Résumé

L’isolement des myocytes cardiaques ventriculaires des cœurs animaux et humains est une méthode fondamentale dans la recherche cardiaque. Les cardiomyocytes animaux sont généralement isolés par perfusion coronaire avec des enzymes digestives. Cependant, isoler les cardiomyocytes humains est difficile parce que les spécimens myocardiques humains ne permettent généralement pas la perfusion coronaire, et les protocoles d’isolement alternatifs entraînent de faibles rendements de cellules viables. En outre, les spécimens myocardes humains sont rares et ne sont disponibles que régulièrement dans les établissements où la chirurgie cardiaque est sur place. Cela entrave la traduction des résultats des cardiomyocytes animaux aux cardiomyocytes humains. Décrit ici est un protocole fiable qui permet l’isolement efficace des myocytes ventriculaires du myocarde humain et animal. Pour augmenter le rapport surface-volume tout en minimisant les dommages cellulaires, des tranches de tissu myocardique de 300 μm d’épaisseur sont générées à partir de spécimens myocardiaux avec un vibratome. Les tranches de tissu sont ensuite digérées avec la protéase et la collagènease. Le myocarde de rat a été employé pour établir le protocole et quantifier des rendements des myocytes viables et tolérants de calcium par le comptage de cellules fluage-cytométriques. La comparaison avec la méthode couramment utilisée en morceaux de tissu a montré des rendements significativement plus élevés de cardiomyocytes en forme de tige (41,5 ± 11,9 contre 7,89 ± 3,6 %, p < 0,05). Le protocole a été traduit par un myocarde humain défaillant et non défaillant, où les rendements étaient semblables à ceux du myocarde de rat et, encore une fois, nettement plus élevés qu’avec la méthode des morceaux de tissu (45,0 ± 15,0 contre 6,87 ± 5,23 cellules/mg, p < 0,05). Notamment, avec le protocole présenté, il est possible d’isoler un nombre raisonnable de cardiomyocytes humains viables (9–200 cellules/mg) à partir de quantités minimales de tissu (<50 mg). Ainsi, la méthode s’applique au myocarde sain et défaillant des cœurs humains et animaux. En outre, il est possible d’isoler les myocytes excitables et contractiles des spécimens de tissus humains stockés jusqu’à 36 h dans une solution cardioplégique froide, rendant la méthode particulièrement utile pour les laboratoires des établissements sans chirurgie cardiaque sur place.

Introduction

Une technique séminale qui a ouvert la voie à des idées importantes dans la physiologie cardiomyocyte est l’isolement des cardiomyocytes ventriculaires vivants des coeurs intacts¹. Les cardiomyocytes isolés peuvent être utilisés pour étudier la structure et la fonction cellulaires normales, ou les conséquences des expériences in vivo; par exemple, évaluer les changements dans l’électrophysiologie cellulaire ou le couplage excitation-contraction dans les modèles animaux de maladies cardiaques. En outre, les cardiomyocytes isolés peuvent être utilisés pour la culture cellulaire, les interventions pharmacologiques, le transfert de gènes, l’ingénierie tissulaire, et beaucoup d’autres applications. Par conséquent, les méthodes efficaces pour l’isolement cardiomyocyte sont d’une valeur fondamentale à la recherche cardiaque fondamentale et translationnelle.

Les cardiomyocytes de petits mammifères, tels que les rongeurs, et de grands mammifères, comme les porcs ou les chiens, sont généralement isolés par perfusion coronaire du cœur avec des solutions contenant des collagèneases brutes et/ou des protéases. Ceci a été décrit comme la méthode « étalon-or » pour l’isolement de cardiomyocyte, ayant pour résultat des rendements allant jusqu’à 70% des cellules viables². L’approche a également été utilisée avec les cœurs humains, résultant en rendements cardiomyocyte acceptables^3,4,5. Cependant, parce que la perfusion coronaire n’est possible que si le cœur intact ou un grand coin myocardique contenant une branche de l’artère coronaire est disponible, la plupart des spécimens cardiaques humains ne sont pas adaptés à cette approche en raison de leur petite taille et un manque de vascularisation appropriée. Par conséquent, l’isolement des cardiomyocytes humains est difficile.

Les spécimens myocardiaux humains se composent principalement de morceaux de tissu de taille variable (environ 0,5 x 0,5 x 0,5 cm à 2 x 2 x 2 cm), obtenus par biopsies endomyocardiales⁶, myectomies septales⁷, implantations VAD⁸, ou à partir de cœurs explantés⁹. Les procédures les plus courantes pour l’isolement cardiomyocyte commencent par hacher le tissu à l’aide de ciseaux ou d’un scalpel. Les contacts cellule-cellule sont ensuite perturbés par immersion dans des tampons sans calcium ou à faible teneur en calcium. Elle est suivie de multiples étapes de digestion avec des extraits d’enzymes brutes ou des enzymes purifiées comme les protéases (p. ex., la trypsine), la collagène, l’hyaluronidase ou l’élastase, entraînant une désintégration de la matrice extracellulaire et la libération des cardiomyocytes. Dans une dernière étape critique, une concentration physiologique de calcium doit être soigneusement restaurée, ou des dommages cellulaires peuvent se produire en raison du calcium-paradoxe^10,11,12. Cette approche d’isolement est pratique mais généralement inefficace. Par exemple, une étude a révélé que près d’un g de tissu myocardique était nécessaire pour obtenir un nombre suffisant de cardiomyocytes adaptés aux expériences ultérieures¹³. Une raison possible de faibles rendements est la méthode relativement dure de hacher le tissu. Cela peut particulièrement endommager les cardiomyocytes situés sur les bords des morceaux bien que ces myocytes soient les plus susceptibles d’être libérés par la digestion enzymatique.

Un autre aspect qui peut influencer l’efficacité d’isolement et la qualité des cellules obtenues à partir de spécimens humains est la durée de l’ischémie tissulaire. La plupart des protocoles mentionnent les délais de transport courts au laboratoire comme condition préalable à de bons résultats. Cela limite l’étude des cardiomyocytes ventriculaires humains aux laboratoires avec des installations de chirurgie cardiaque à proximité. Ensemble, ces restrictions entravent la vérification des résultats importants des modèles animaux dans les cardiomyocytes humains. Il est donc souhaitable d’améliorer les protocoles d’isolement qui permettent des rendements cardiomyocytes élevés à partir de petites quantités de tissus, de préférence sans dommages graves après des périodes de transport prolongées.

Décrit ici est un protocole d’isolement basé sur la digestion enzymatique de fines tranches de tissu myocardique générées avec un vibratome^14,15. Nous démontrons que l’isolement des tranches de tissu est beaucoup plus efficace que celui des morceaux de tissu hachés avec des ciseaux. La méthode décrite permet non seulement des rendements élevés de cardiomyocytes humains viables à partir de petites quantités de tissu myocardique, mais elle s’applique également aux spécimens stockés ou transportés dans une solution cardioplégique froide jusqu’à 36 h.

Protocole

Toutes les expériences avec des rats ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux Mittelfranken, Bavière, Allemagne. La collecte et l’utilisation d’échantillons de tissus cardiaques humains ont été approuvées par les commissions d’examen institutionnelles de l’Université d’Erlangen-Nürnberg et du Bochum de la Ruhr-Université. Des études ont été menées conformément aux lignes directrices de la Déclaration d’Helsinki. Les patients ont donné leur consentement écrit en connaissance de cause avant la collecte des tissus.

Des rats wistar femelles (150–200 g) ont été obtenus commercialement, anesthésiés en injectant 100 mg/kg de thiopental-sodium intrapéritoneally, et euthanasiés par dislocation cervicale suivie de la thoracotomie et de l’excision du coeur. Des échantillons humains de tissu cardiaque ont été prélevés dans le noyau apical du ventriculaire gauche pendant l’implantation de dispositifs d’assistance mécanique, de la myectomie septale, de la tétralogie de la chirurgie corrective de Fallot, ou de la paroi libre de ventriculaire gauche des coeurs explantés. Le protocole suivant décrit l’isolement du tissu ventriculaire humain. L’isolement des cardiomyocytes de rat a été exécuté en conséquence, mais avec différentes enzymes (voir tableau des matériaux). Un flux de travail schématique du protocole est illustré à la figure 1.

1. Préparation de tampons, de solutions et d’enzymes

1. Préparer les tampons et les solutions énumérés dans le tableau 1.
2. Solutions d’échauffement 1, 2, 3 et solution tyrode modifiée à 37 °C. Conserver la solution de coupe à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
   REMARQUE : Pour 1 à 2 tranches de myocarde, un total d’environ 15 mL, 8 mL et 5 mL de solutions 1, 2 et 3 sont nécessaires pour l’isolement dans un plat de culture tissulaire de 35 mm. Augmentez en conséquence pour les isolements simultanés de myocyte dans plusieurs plats. La solution de coupe peut être congelée et conservée à -20 °C pendant plusieurs mois.
3. Peser 1 mg de protéinase XXIV (voir tableau des matériaux)dans un tube de centrifugeuse de 15 ml préchillé et conserver sur la glace jusqu’à l’utilisation. Il s’agit pour le traitement d’un échantillon. Augmentez le montant en conséquence. Ne mélangez pas la protéinase et la collagènease.
4. Pesez 8 mg de collagènease CLSI (voir Tableau des matériaux)dans un tube de centrifugeuse préchillé de 15 mL et rangez-les sur la glace jusqu’à l’utilisation. Il s’agit pour le traitement d’un échantillon. Augmentez le montant en conséquence. Ne mélangez pas la protéinase et la collagènease.
   ATTENTION : Portez un masque facial ou travaillez sous une hotte de fumée pour éviter l’inhalation de poudre enzymatique.
   REMARQUE : L’activité enzymatique peut varier en différents lots. Par conséquent, la concentration optimale peut différer et doit être déterminée avec chaque enzyme nouvellement achetée¹⁶.

2. Stockage et transport de tissus myocardiques

1. Conserver et transporter des échantillons cardiaques humains dans une solution de coupe refroidie à 4 °C (tableau 1).
2. Utilisez la même solution pour le traitement des tissus et le tranchage vibromètre.
   REMARQUE : Les biopsies et les échantillons cardiaques chirurgicaux doivent être transférés immédiatement à la solution de coupe à 4 °C et peuvent ensuite être stockés ou transportés à 4 °C pendant un maximum de 36 h avant l’application de ce protocole.

3. Traitement et tranchage du tissu

NOTE : Le protocole pour le tranchage des tissus suit Fischer et coll.¹⁵.

1. Coupe du bloc tissulaire
   ATTENTION : Le tissu cardiaque humain est potentiellement infectieux. Utilisez toujours l’usure protectrice et respectez les règles de sécurité de votre établissement. Manipuler soigneusement les lames usagées et les jeter dans des contenants de sécurité.
   1. Placer le spécimen dans un plat de culture tissulaire de 100 mm rempli d’une solution de coupe à froid de 20 mL et conserver sur une plaque refroidie de 4 °C.
   2. Enlever l’excès de tissu fibrotique et la graisse épicardiale avec un scalpel. Dans le cas d’un spécimen transmural, enlever les trabeculae et les couches de tissu près de l’endocardium.
      REMARQUE : Le tissu fibrotique est raide et semble blanc. La graisse est généralement molle et semble blanche à jaune. Les couches de trabeculae et de tissu endocardial peuvent être identifiées à partir de leur composition de tissu lâche et d’une orientation de fibre non alignée comparée au myocarde des couches épicardiales
   3. Pour un traitement optimal du vibromètre, coupez des blocs de tissu rectangulaire d’environ 8 mm x 8 mm x 8 mm avec un scalpel d’un plus grand spécimen de tissu. Pour les biopsies plus petites sauter cette étape et passer à l’intégration agarose.
2. Intégration de tissus cardiaques dans l’agarose à faible point de fusion
   1. Faire bouillir 400 mg d’agarose à faible point de fusion dans 10 mL de solution de coupe dans un bécher en verre.
      ATTENTION : Portez des gants et des lunettes de sécurité pour éviter les brûlures. Manipuler la verrerie chaude seulement avec l’usure de protection de chaleur.
   2. Remplir une seringue de 10 mL avec le gel agarose chaud et dissous. Sceller la seringue et laisser l’agarose équilibrer dans un bain d’eau de 37 °C pendant au moins 15 min.
   3. Utilisez des forceps pour placer le spécimen cardiaque ou la biopsie paré dans un plat propre de culture tissulaire de 35 mm avec l’épicardium orienté vers le bas et enlever l’excès de liquide à l’aide d’un écouvillon stérile.
   4. Verser l’agarose équilibrée (étape 3.2.2) sur le tissu en vidant la seringue. Fixer le tissu contre le mouvement avec des forceps tout en versant l’agarose. Assurez-vous que le tissu est complètement immergé dans l’agarose.
   5. Déposer immédiatement le plat sur la glace et laisser l’agarose se solidifier pendant 10 min.
3. Trancher le myocarde
   1. Montez une nouvelle lame de rasoir sur le support de lame du vibratome et calibrez le vibratome en ajustant si possible la déviation z de la lame.
      REMARQUE : Ce protocole utilise un vibratome avec un dispositif d’étalonnage assisté par infrarouge pour aligner la lame en position horizontale avec une déviation minimale en z (déviation mesurée <0,1 μm).
   2. Utilisez un scalpel pour exciser un bloc de tissu agarose qui s’adapte au support du vibratome. Pour assurer la stabilité, assurez-vous que le tissu est encore suffisamment immergé dans l’agarose (marges agarose ≥ 8 mm).
   3. Fixer le bloc agarose sur le support du spécimen avec une fine couche de colle cyanoacrylate et une légère pression.
   4. Placez le porte-spécimen avec le tissu dans le bain vibratoire. Remplissez le bain de solution de coupe et maintenez-le à 4–6 °C tout au long du traitement avec de la glace concassée, rempli dans le réservoir de refroidissement externe du vibratome.
   5. Générer des tranches de 300 μm d’épaisseur avec une vitesse d’avancement de ≤0,1 mm/s, une fréquence oscillante de 80 Hz, une amplitude latérale de 1,5 mm et un angle de lame de 15°. Lors de la manipulation des tranches, maintenez l’agarose au lieu du tissu lui-même pour éviter les dommages tissulaires. Conserver les tranches dans la solution de coupe à 4 °C pendant un maximum de 2 h, si nécessaire.
      REMARQUE : Les cardiomyocytes sont orientés parallèlement à l’épicardium. Par conséquent, il est important de couper en parallèle à l’épicardium pour éviter les dommages excessifs de myocyte. Il est recommandé de jeter les premières tranches 1 à 3, car seules des tranches uniformes d’épaisseur constante doivent être utilisées pour l’isolement. Pour les biopsies de petits tissus, cependant, ne jeter que la première tranche.
   6. Vérifiez l’alignement des cardiomyocytes sous un microscope léger standard avec un grossissement de 40-100x.

4. Digestion des tissus

1. Placez la plaque chauffante sur le shaker de laboratoire et faites-la chauffer à 37 °C. Démarrez le shaker de laboratoire à 65 tr/min.
2. Dissoudre la protéinase (préparée à l’étape 1.3) en 2 mL de solution 1 (étape 1.1 et 1.2) et incuber à 37 °C jusqu’à l’utilisation. Ne mélangez pas la protéinase et la collagènease.
3. Dissoudre la collagènease (préparée à l’étape 1.4) dans 2 mL de solution 1 (étape 1.1 et 1.2) et incuber à 37 °C jusqu’à l’utilisation. Ne mélangez pas la protéinase et la collagènease.
   ATTENTION : Portez des lunettes et des gants de protection, car les enzymes dissoutes peuvent causer des blessures à la peau et aux yeux.
4. Ajouter le chlorure de calcium (CaCl₂₎à la solution contenant de la collagènease (préparée à l’étape 4.3) à une concentration finale de 5 μM.
5. Utilisez des forceps pour transférer une tranche de tissu du bain vibratoire vers un plat propre de culture tissulaire de 60 mm rempli de 5 mL de solution de coupe préchillée (étape 1.1 et 1.2) et garder sur la glace.
6. Retirez soigneusement l’agarose du tissu myocardique à l’aide d’une lame ou d’un forceps.
   REMARQUE : Évitez l’excès de tension et le stress de cisaillement sur les tranches de myocarde, car ils peuvent endommager les cardiomyocytes.
7. Pour effectuer le lavage initial, placez un plat propre de culture tissulaire de 35 mm sur la plaque chauffante et remplissez-le de 2 mL de solution préguerre (37 °C) 1. Transférer 1 à 2 tranches de myocarde dans le plat préparé avec des forceps. Apirate la solution avec une pipette de 1 mL et effectuer les étapes de lavage 2x pour enlever les restes de la solution de coupe.
   REMARQUE : Ne pas aspirate les tranches cardiaques. Les solutions et les tranches doivent rester à une température constante de 35 °C sur la plaque chauffante agitée. Ajuster la température de la plaque thermique si nécessaire.
8. Retirer la solution 1 du plat et ajouter 2 mL de la solution protéinase (étape 4.2). Incuber pendant 12 min sur la plaque chauffante à 65 tr/min.
9. Laver 2x avec 2 mL de solution préguerre 1 (37 °C).
10. Retirer la solution 1 du plat et ajouter 2 mL de solution de collagène (étapes 4.3 et 4.4). Incuber au moins 30 min sur la plaque chauffante à 65 tr/min.
11. Vérifiez les myocytes individuels gratuits à 30, 35, 40 min, etc., en plaçant le plat sous un microscope léger. Travaillez rapidement pour éviter un refroidissement significatif de la solution.
    REMARQUE : Le temps de digestion requis peut varier en fonction de la constitution tissulaire et du degré de fibrose. Dès que le tissu devient visiblement mou et se dissocie facilement lorsqu’il est doucement tiré, le temps de digestion optimal a été atteint. Si suffisamment de tissu est disponible, plusieurs tranches peuvent être digérées en parallèle avec des temps de digestion variables.
12. Lorsque le tissu est digéré et que les myocytes individuels sont visibles (étape 4.11), lavez 2x avec 2 mL de solution préguerre 2 (37 °C) et remplissez à nouveau de 2 mL.

5. Dissociation tissulaire

1. Dissocier les tranches de tissu digérées au forceps en retirant soigneusement les fibres.
2. Soigneusement pipette plusieurs fois avec une pipette Pasteur à usage unique (diamètre d’ouverture >2 mm).
   REMARQUE : L’utilisation de forceps et de pipetage peut induire un stress mécanique et causer des dommages aux cardiomyocytes. Cependant, il s’agit d’une étape cruciale pour la séparation des cellules. Utilisez des forceps fins pour minimiser les dommages aux cellules et dissociez soigneusement les tranches en petits morceaux.
3. Vérifiez les cardiomyocytes libérés en forme de tige sous le microscope léger.

6. Réintroduction de la concentration physiologique de calcium

1. Augmenter lentement la concentration de calcium de 5 μM à 1,5 mM tout en agitant à 35 °C sur la plaque chauffante. Utilisez des solutions de stock de 10 mM et 100 mM CaCl_2. Étapes recommandées : 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1 200, 1 500 μM. Permettre aux cellules de s’adapter aux niveaux accrus de calcium dans des intervalles d’incubation de 5 min entre chaque étape.
2. Retirez soigneusement les morceaux de tissu non digérés avec des forceps ou filtrez la suspension cellulaire à travers un maillage en nylon avec une taille de pore de 180 μm à la fin de l’augmentation du calcium.

7. Retrait de l’agent de découplage mécanique

1. Arrêter l’agitation et retirer lentement un tiers de la solution (~700 μL) du haut avec une pipette de 1 000 μL. Évitez l’aspiration des cardiomyocytes.
   REMARQUE : Si le tissu non digéré a été enlevé, les cardiomyocytes s’accumuleront dans le centre du plat, ce qui facilite l’aspiration de la solution sans cellules. Si ce n’est pas le cas, transférer la solution cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 mL et laisser les cellules se sédimenter pendant 10 min à 35 °C, puis remplacer 700 μL du supernatant et jeter, resuspender les cellules, les transférer dans un plat de culture tissulaire de 35 mm et procéder à l’étape 7.2.
2. Ajouter 700 μL de solution 3 aux cellules, reprendre l’agitation sur la plaque chauffante et incuber pendant 10 min.
3. Répétez les étapes 7.1 et 7.2.
4. Transférer la solution dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et laisser les cardiomyocytes dans les sédiments pendant au moins 10 min et un maximum de 30 min à température ambiante ou tourner à 50 x g pendant 1 min. Retirez complètement le supernatant et resuspendez dans la solution de Tyrode modifiée ou dans le tampon d’expérimentation souhaité.
   REMARQUE : Les cardiomyocytes peuvent être stockés dans la solution de Tyrode modifiée (tableau 1) pendant plusieurs heures à 37 °C et 5 % de CO₂ avant utilisation.
5. Vérifiez la qualité de la cellule avec un microscope léger standard au grossissement 40x et 200x.
   REMARQUE : Environ 30 à 50 % des cardiomyocytes doivent être en forme de tige, lisses sans taches de membrane et afficher des stries croisées claires. Seulement 5 à 10% des cellules viables devraient montrer des contractions spontanées.

Résultats

Pour vérifier l’efficacité de l’isolement, le protocole a été utilisé avec le myocarde de rat et le nombre résultant de myocytes viables a été comparé aux nombres obtenus par isolement par perfusion coronaire et par isolement de petits morceaux de tissu (isolement de morceaux, Figure 2). L’isolement et l’isolement des morceaux des tranches de tissu ont été exécutés des mêmes coeurs. Pour l’isolement par perfusion coronaire, cependant, le coeur entier a été employé....

Discussion

Bien que l’isolement des cardiomyocytes vivants ait été établi il y a plus de 40 ans et demeure une condition préalable à de nombreuses approches expérimentales dans la recherche cardiaque, il demeure une technique difficile avec des résultats imprévisibles. L’isolement cardiomyocyte par perfusion des artères coronaires avec solution enzymatique est couramment utilisé pour les cœurs de petits animaux et donne un grand nombre de cellules viables. Toutefois, cela nécessite un système et une expertise relat...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
2,3-butanedionemonoxime	Carl Roth	3494.1	Purity>99%
Bovine serum albumin	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
Creatine monohydrate	Alfa Aesar	B250009
Glucose	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3
KCl	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
L-glutamic acid	Fluka Biochemica	49450
Low melting-point agarose	Carl Roth	6351.5
MgCl2 x 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Taurine	Sigma Aldrich	T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher Scientific	D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I	Worthington	LS004196	Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II	Worthington	LS004176	Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg)
Protease XIV	Sigma Aldrich	P8038	Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV	Sigma Aldrich	P5147	Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa)	BD Bioscience	649225
Centrifuge tube, 15 mL	Corning	430790
Centrifuge tube, 50 mL	Corning	430829
Compact shaker	Edmund Bühler	KS-15 B control	Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes	Carl Roth	EA65.1	For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps	FST	11271-30
Heatblock	VWR	BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm	Merck	NY8H04700
TC Dish 100, Standard	Sarstedt	83.3902
TC Dish 35, Standard	Sarstedt	83.3900
TC Dish 60, Standard	Sarstedt	83.3901
Vibratome (VT1200S)	Leica	1491200S001	Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection