人体心室心肌细胞与颤音-切切心肌切片分离

摘要

呈现是将人类和动物心室心肌细胞与振动切切心肌切片分离的协议。耐钙细胞（高达200个细胞/毫克）的高产量可以从少量组织（<50毫克）中获得。该协议适用于暴露于冷缺血的心肌，长达36小时。

摘要

将心室心肌细胞与动物和人类心脏分离是心脏研究的基本方法。动物心肌细胞通常通过冠状动脉灌注与消化酶分离。然而，分离人类心肌细胞是具有挑战性的，因为人类心肌标本通常不允许冠状动脉灌注，而替代的分离方案导致活细胞产量低。此外，人类心肌标本是罕见的，只有定期在机构与现场心脏手术。这妨碍了从动物到人类心肌细胞的发现翻译。这里描述的是一个可靠的协议，能够有效地分离心室菌体与人类和动物的心肌。为了增加表面体积比，同时尽量减少细胞损伤，心肌组织切片300 μm厚由具有振动器的心肌标本生成。然后用蛋白酶和胶原酶消化组织切片。鼠菌通过流动细胞测量细胞计数建立协议并量化可行、耐钙的菌细胞的产量。与常用组织块法的比较显示，棒状心肌细胞的产量显著提高（41.5 ± 11.9 与 7.89 = 3.6%，p < 0.05）。该协议被转化为失败和非失败的人类心肌，其产量与大鼠心肌相似，同样明显高于组织块法（45.0 × 15.0 vs. 6.87 = 5.23细胞/毫克，p < 0.05）。值得注意的是，通过提出的协议，有可能从少量组织（<50毫克）中分离出合理数量的可行人类心肌细胞（9~200个细胞/毫克）。因此，该方法适用于来自人类和动物心脏的健康和失败的心肌。此外，在冷心肺溶液中，从储存长达36小时、长达36小时人体组织标本中分离出兴奋和收缩的菌细胞，使该方法对于无需现场心脏手术的机构实验室特别有用。

引言

一项开创性技术，为心肌细胞生理学的重要见解铺平了道路，是将活的心室心肌细胞与完整的心脏^1隔离。分离的心肌细胞可用于研究正常的细胞结构和功能，或体内实验的后果;例如，评估心脏疾病动物模型中细胞电生理学或激发-收缩耦合的变化。此外，分离的心肌细胞可用于细胞培养、药理干预、基因转移、组织工程和许多其他应用。因此，有效的心肌细胞分离方法对基础和转化心脏研究具有根本价值。

来自小型哺乳动物（如啮齿动物）和大型哺乳动物（如猪或狗）的心肌细胞通常通过心脏的冠状动脉灌注与含有粗胶原蛋白酶和/或蛋白酶的溶液分离。这被描述为心肌细胞分离的"黄金标准"方法，导致高达70%的活细胞^2。这种方法也用于人类心脏，导致^,可接受的心肌细胞产生^{3，4，5。,45}然而，由于冠状动脉灌注只有在有完整的心脏或含有冠状动脉分支的大心肌楔子可用的情况下才可行，因此大多数人类心脏标本不适合这种方法，因为它们体积小，缺乏适当的血管。因此，人类心肌细胞的分离是具有挑战性的。

人类心肌标本主要由大小可变的组织块（约0.5 x 0.5 x 0.5厘米至2×2×2厘米）组成，通过内氧心肌活检^获得6，隔膜^{心肌切除术7，VAD植入8，}或从外植心脏^9。心肌细胞分离最常见的程序从用剪刀或手术刀切碎组织开始。然后，细胞到细胞的接触被浸入无钙或低钙缓冲液中破坏。随后是多个消化步骤与粗酶提取物或纯化酶，如蛋白酶（如蛋白酶），胶原酶，红霉素酶，或弹性酶，导致细胞外基质的解体和心肌细胞的解放。在最后的关键步骤中，生理钙浓度必须仔细恢复，否则细胞损伤可能发生由于钙悖论^{10，11，12。,11,12}这种隔离方法很方便，但通常效率低下。例如，一项研究发现，需要近1克心肌组织才能获得足够数量的心肌细胞，适合随后的实验^13。产量低的一个可能原因是比较苛刻的切碎组织的方法。这可能特别损害位于块边缘的心肌细胞，尽管这些肌细胞最有可能通过酶消化释放。

可能影响从人体标本获得的细胞的分离效率和质量的另一个方面是组织缺血的持续时间。大多数协议都提到实验室的运输时间短是取得良好结果的先决条件。这限制了人类心室心肌细胞的研究，而实验室有附近的心脏手术设施。总之，这些限制妨碍了人类心肌细胞动物模型的重要发现验证。因此，改进的分离方案，允许从少量组织中产生高心肌细胞，最好在延长运输时间后不会造成严重伤害。

这里描述的是一个隔离协议，基于酶消化的薄心肌组织切片产生的振动体^{14，15。14,}我们证明，与用剪刀切碎的组织块分离组织切片的效率要高得多。所述方法不仅允许从少量心肌组织中高产量的活人心肌细胞，而且适用于在冷心肺溶液中储存或运输的标本，时间长达36小时。

研究方案

所有大鼠实验都得到德国巴伐利亚州米特尔弗兰肯动物护理和使用委员会的批准。埃尔兰根-纽伦堡大学和鲁尔-波鸿大学机构审查委员会批准了人体心脏组织样本的收集和使用。根据《赫尔辛基宣言》准则进行了研究。患者在组织采集前给予书面知情同意。

雌性威斯塔大鼠（150–200克）通过注射100毫克/千克的硫化钠进行麻醉，通过宫颈脱位安乐死，然后进行胸腔切除术和心脏切除。在植入机械辅助装置期间，从左心室腹膜核心采集人体心脏组织样本，从隔膜乳房切除术，从法洛特矫正手术的四部曲中，或从切除心脏的自由左心室壁采集。以下协议描述了与人体心室组织的分离。大鼠心肌细胞的分离是相应的，但使用不同的酶（见材料表）。图 1 中显示了协议的原理图工作流。

1. 缓冲液、溶液和酶的制备

1. 准备表 1 中列出的 缓冲区和解决方案。
2. 将溶液 1、2、3 和经过修改的 Tyrode 溶液加热到 37°C。 将切割溶液存放在4°C，直到使用。
   注:对于 1~2 个心肌切片，在一个 35 mm 组织培养皿中分离所需的溶液 1、2 和 3 总共需要约 15 mL、8 mL 和 5 mL 溶液。相应地扩大，在多个菜肴中同时分离菌细胞。切割溶液可以冷冻并保持在-20°C几个月。
3. 重1毫克蛋白酶XXIV（ 见材料表）到预冷15mL离心管中，储存在冰上直到使用。这是用于处理一个样本。相应地增加金额。不要混合蛋白酶和胶原酶。
4. 重量8毫克胶原酶CLSI（ 见材料表）到预冷15mL离心管和储存在冰上，直到使用。这是用于处理一个样本。相应地增加金额。不要混合蛋白酶和胶原酶。
   注意:戴面罩或在烟罩下工作，避免吸入酶粉。
   注:酶活性可能因不同地段而异。因此，最佳浓度可能不同，应与每新购买的酶^16确定。

2. 心肌组织的储存和运输

1. 储存和运输人体心脏样品在冷却，4°C切割溶液（表1）。
2. 使用相同的溶液进行进一步的组织处理和振动切片。
   注:活检和手术心脏样本应立即转移到4°C的切割溶液中，然后在4°C下储存或运输，最长36小时，然后再应用本协议。

3. 组织加工和切片

注:组织切片协议遵循费舍尔等人^15。

1. 组织块的修剪
   注意:人体心脏组织具有潜在的传染性。始终使用防护服，并遵守您机构的安全规定。小心处理用过的刀片，并丢弃在安全容器中。
   1. 将试样放入充满 20 mL 冷切溶液的 100 mm 组织培养盘中，并放在冷却的 4 °C 板上。
   2. 用手术刀去除多余的纤维组织和脂肪。在进行跨膜标本的情况下，去除内膜附近的特拉贝库莱和组织层。
      注:纤维组织僵硬，显示为白色。脂肪通常是软的，显示为白色到黄色。与史诗层的心肌相比，可以从其松散的组织组成和不对齐的纤维方向中识别出特拉贝库拉和心内组织层
   3. 为了获得最佳的振动器处理，用较大组织标本的手术刀切割约 8 mm x 8 mm x 8 mm 的矩形组织块。对于较小的活检跳过此步骤，并移动到阿加罗斯嵌入。
2. 将心脏组织嵌入低熔点糖中
   1. 在玻璃烧杯中10 mL的切割溶液中煮沸400毫克低熔点阿加糖。
      注意:戴上手套和安全眼镜，避免烧伤。仅使用防热磨损处理热玻璃器皿。
   2. 用热、溶解的阿加罗斯凝胶填充 10 mL 注射器。密封注射器，让糖在 37 °C 水浴中平衡至少 15 分钟。
   3. 使用钳子将修剪过的心脏标本或活检放入干净的 35 mm 组织培养盘中，将 epicardium 朝下，用无菌拭子去除多余的液体。
   4. 通过清空注射器将平衡的糖（步骤 3.2.2）倒在组织上。用钳子固定组织，防止其运动，同时浇注糖。确保组织完全浸入糖中。
   5. 立即将盘子放在冰上，让阿加罗斯凝固10分钟。
3. 切片心肌
   1. 将新的剃须刀刀片安装到振动器的刀片支架上，并尽可能通过调整刀片的 z 偏转来校准振动器。
      注:此协议使用带红外辅助校准装置的振动器，以最小的 z 偏转（测量偏转 <0.1 μm）将刀片对齐在水平位置。
   2. 使用手术刀切除适合振动器的试样支架的黄玫瑰组织块。为确保稳定性，请确保组织仍充分浸入红糖（加糖边缘 = 8 mm）。
   3. 用薄薄的一层氰酸酯胶水和温和的压力将藻糖块固定到试样支架上。
   4. 将带组织的试样支架放入振动池中。用切割溶液填充浴缸，在整个加工过程中用碎冰保持 4~6 °C，并加注振动器的外部冷却罐。
   5. 生成 300 μm 厚的切片，推进速度为 ±0.1 mm/s，振荡频率为 80 Hz，横向振幅为 1.5 mm，刀片角度为 15°。处理切片时，握住糖，而不是组织本身，以避免组织损伤。如有必要，将切片存放在切割溶液中，温度为 4°C，最长为 2 小时。
      注:心肌细胞与史诗平行。因此，重要的是要与史诗平行切割，以避免过多的菌细胞损伤。建议丢弃前 1+3 个切片，因为隔离时应只使用均匀的恒定厚度切片。然而，对于小组织活检，只丢弃第一片。
   6. 在标准光学显微镜下以 40-100 倍的放大倍率检查心肌细胞对齐。

4. 组织消化

1. 将加热板放在实验室摇床上，加热至37°C。 以 65 rpm 转速启动实验室摇床。
2. 将蛋白酶（在步骤1.3中）溶解在溶液1的2mL（步骤1.1和1.2）中，并在37°C下孵育，直到使用。不要混合蛋白酶和胶原酶。
3. 溶解胶原酶（在步骤1.4中准备）在溶液1的2mL（步骤1.1和1.2）中，并在37°C孵育，直到使用。不要混合蛋白酶和胶原酶。
   注意:佩戴防护眼镜和手套，因为溶解的酶会导致皮肤和眼睛受伤。
4. 将氯化钙 （CaCl_2）添加到含有胶原酶的溶液中（在步骤 4.3 中制备），最终浓度为 5 μM。
5. 使用钳子将组织切片从振动池转移到一个干净的 60 mm 组织培养盘中，该培养盘充满 5 mL 的预冷切液（步骤 1.1 和 1.2），并保持在冰上。
6. 小心地用刀片或钳子从心肌组织中取出糖。
   注:避免心肌切片的过度张力和剪切应力，因为它们会损害心肌细胞。
7. 要进行初始洗涤，请将干净的 35 mm 组织培养盘放在加热板上，并用 2 mL 的预预热 （37 °C） 溶液 1 填充。将1~2个心肌切片转移到用钳子准备的菜中。用 1 mL 移液器吸出溶液，并执行 2 倍的洗涤步骤以去除切割溶液的残留物。
   注:不要吸气心脏切片。溶液和切片应保持在搅拌热板上 35°C 的恒定温度。如有必要，调整热板温度。
8. 从培养皿中去除溶液1，加入2 mL的蛋白酶溶液（步骤4.2）。在 65 rpm 的加热板上孵育 12 分钟。
9. 用 2 mL 预预热溶液 1 （37 °C） 洗涤 2x。
10. 从菜中去除溶液1，加入2 mL的胶原酶溶液（步骤4.3和4.4）。在 65 rpm 转速下在热板上孵育至少 30 分钟。
11. 将盘子放在光学显微镜下，在30、35、40分钟等位置检查有无免费的个体菌质。快速工作，避免解决方案出现严重冷却。
    注:所需的消化时间可能因组织组成和纤维化程度而异。一旦组织变得明显柔软，轻轻拉扯时容易分离，就达到了最佳的消化时间。如果有足够的组织可用，几个切片可以同时消化不同的消化时间。
12. 当组织被消化，单个菌细胞可见（步骤4.11），用2 mL的预战溶液2（37°C）洗涤2x，并再次用2 mL填充。

5. 组织分离

1. 小心地将纤维拉开，将消化的组织切片与钳子分离。
2. 使用一次使用巴氏移液器（开口直径 >2 mm）小心多次移液器。
   注:使用钳子和移液可以诱发机械应力，并导致心肌细胞损伤。然而，这是细胞分离的关键步骤。使用精细钳子尽量减少细胞损伤，并小心地将切片分离成更小的切片。
3. 在光显微镜下检查释放杆状心肌细胞。

6. 生理钙浓度的再引入

1. 在加热板上以35°C搅拌时，缓慢地将钙浓度从5μM提高至1.5 mM。使用 10 mM 和 100 mM CaCl_{2 库存} 解决方案。推荐步骤:20、40、80、100、150、200、400、800、1200、1500 μM。让细胞在每步之间5分钟的孵化间隔内适应钙水平的增加。
2. 用钳子小心地去除未消化的组织块，或通过尼龙网过滤细胞悬浮液，在钙增加结束时，孔径为 180 μm。

7. 去除机械脱钩剂

1. 停止搅拌，用 1，000 μL 移液器慢慢从顶部取出三分之一溶液 （±700 μL）。避免心肌细胞的吸入。
   注:如果去除未消化的组织，心肌细胞将积聚在培养皿的中心，从而促进无细胞溶液的吸附。如果没有，将细胞溶液转移到15 mL离心管中，让细胞在35°C下沉淀10分钟，然后吸走700μL的上流液并丢弃，重新悬浮细胞，将其转移回35毫米组织培养皿，然后继续执行步骤7.2。
2. 将700μL溶液3加入细胞，在热板上恢复搅拌并孵育10分钟。
3. 重复步骤 7.1 和 7.2。
4. 将溶液转移到 15 mL 离心管中，让心肌细胞在室温下至少沉淀 10 分钟，在 50 x g 下旋转最多 30 分钟，或在 50 x g 下旋转 1 分钟。完全删除上流水，并在修改后的 Tyrode 解决方案或所需的实验缓冲区中重新暂停。
   注意:心肌细胞可以在经过改良的Tyrode溶液中储存几个小时（表1），在37°C和5%CO₂ 使用前。
5. 使用标准光学显微镜以 40 倍和 200 倍的放大倍率验证电池质量。
   注:大约30~50%的心细胞应该是棒状的，光滑无膜的出血，并显示清晰的交叉条纹。只有5~10%的活细胞应该表现出自发收缩。

结果

为了验证分离效率，该协议与大鼠心肌并一起使用，结果可行的菌细胞数量与通过冠状动脉灌注和从小组织块分离获得的数量进行比较（块分离， 图2).块分离和分离组织切片从相同的心脏执行。然而，对于通过冠状动脉灌注的隔离，使用了整个心脏。冠状灌注主要产生棒状和交叉条纹心肌细胞。与心肌切片分离，观察到的棒状细胞比例较低，但总数仍然很高。相比之下，从...

讨论

虽然活体心肌细胞的分离是在40多年前建立的，并且仍然是许多心脏研究实验方法的先决条件，但它仍然是一个难以预测的结果的技术。心肌细胞通过输注冠状动脉与酶溶液进行分离，通常用于小动物的心脏，并产生大量可行的细胞。然而，这需要一个相对复杂的系统和专门知识。此外，由于人体组织样本体积小或没有冠状动脉分支，因此不适合使用这种方法，这使得人类心肌细胞分离的新方法?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
2,3-butanedionemonoxime	Carl Roth	3494.1	Purity>99%
Bovine serum albumin	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
Creatine monohydrate	Alfa Aesar	B250009
Glucose	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3
KCl	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
L-glutamic acid	Fluka Biochemica	49450
Low melting-point agarose	Carl Roth	6351.5
MgCl2 x 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Taurine	Sigma Aldrich	T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher Scientific	D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I	Worthington	LS004196	Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II	Worthington	LS004176	Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg)
Protease XIV	Sigma Aldrich	P8038	Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV	Sigma Aldrich	P5147	Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa)	BD Bioscience	649225
Centrifuge tube, 15 mL	Corning	430790
Centrifuge tube, 50 mL	Corning	430829
Compact shaker	Edmund Bühler	KS-15 B control	Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes	Carl Roth	EA65.1	For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps	FST	11271-30
Heatblock	VWR	BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm	Merck	NY8H04700
TC Dish 100, Standard	Sarstedt	83.3902
TC Dish 35, Standard	Sarstedt	83.3900
TC Dish 60, Standard	Sarstedt	83.3901
Vibratome (VT1200S)	Leica	1491200S001	Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection