Isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani dalle fette miocardici Vibratome-Cut

Riepilogo

Presentato è un protocollo per l'isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani e animali da fette miocardici tagliate con vibratome. È possibile ottenere rese elevate di cellule tolleranti al calcio (fino a 200 cellule/mg) da piccole quantità di tessuto (<50 mg). Il protocollo è applicabile al miocardio esposto all'ischemia fredda fino a 36 h.

Abstract

L'isolamento dei miociti cardiaci ventricolari dai cuori animali e umani è un metodo fondamentale nella ricerca cardiaca. I cardiomiociti animali sono comunemente isolati dalla perfusione coronarica con enzimi digestivi. Tuttavia, isolare i cardiomiociti umani è difficile perché gli esemplari miocardici umani di solito non consentono la perfusione coronarica e protocolli di isolamento alternativi producono scarse rese di cellule vitali. Inoltre, gli esemplari miocardiali umani sono rari e regolarmente disponibili presso le istituzioni con cardiochirurgia in loco. Ciò ostacola la traduzione dei risultati dai cardiomiociti animali a quello umano. Descritto qui è un protocollo affidabile che consente l'isolamento efficiente dei miociti ventricolari dal miocardio umano e animale. Per aumentare il rapporto superficie-volume riducendo al minimo i danni alle cellule, le fette di tessuto miocardiale di 300 m di spessore vengono generate da campioni miocardici con un vibrato. Le fette di tessuto vengono poi digerito con proteasi e collagenasi. Il miocardio del ratto è stato utilizzato per stabilire il protocollo e quantificare le rese dei miociti vitali e tolleranti al calcio mediante il conteggio delle cellule citometriche di flusso. Il confronto con il metodo di parti di tessuto comunemente usato ha mostrato rese significativamente più elevate di cardiomiociti a forma di asta (41,5 x 11,9 contro 7,89 x 3,6%, p < 0,05). Il protocollo è stato tradotto in miocardio umano in mancanza e non in mancanza, dove le rese erano simili a quelle del miocardio di ratto e, ancora una volta, nettamente più elevate rispetto al metodo del pezzo di tessuto (45,0 x 15,0 contro 6,87 : 5,23 cellule/mg, p < 0,05). In particolare, con il protocollo presentato è possibile isolare un numero ragionevole di cardiomiociti umani vitali (9-200 cellule/mg) da quantità minime di tessuto (<50 mg). Così, il metodo è applicabile al miocardio sano e in mancanza da cuori umani e animali. Inoltre, è possibile isolare i miociti eccitabili e contrattili da campioni di tessuto umano conservati fino a 36 h in soluzione cardioplegica fredda, rendendo il metodo particolarmente utile per i laboratori presso le istituzioni senza cardiochirurgia in loco.

Introduzione

Una tecnica seminale che ha spianato la strada a importanti approfondimenti sulla fisiologia cardiomiocite è l'isolamento dei cardiomiociti ventricolari viventi dai cuori intatti¹. I cardiomiociti isolati possono essere utilizzati per studiare la normale struttura cellulare e la funzione, o le conseguenze degli esperimenti in vivo; ad esempio, per valutare i cambiamenti nell'elettrofisiologia cellulare o nell'accoppiamento eccitazione-contrazione nei modelli animali di malattia cardiaca. Inoltre, cardiomiociti isolati possono essere utilizzati per la coltura cellulare, interventi farmacologici, trasferimento genico, ingegneria tissunte, e molte altre applicazioni. Pertanto, metodi efficienti per l'isolamento cardiomiocato sono di fondamentale importanza per la ricerca cardiaca di base e traslazionale.

I cardiomiociti di piccoli mammiferi, come i roditori, e da mammiferi più grandi, come maiali o cani, sono comunemente isolati dalla perfusione coronarica del cuore con soluzioni contenenti collagene grezze e/o proteasi. Questo è stato descritto come il metodo "gold standard" per l'isolamento cardiomiocato, con conseguente resa fino al 70% delle cellule vitali². L'approccio è stato utilizzato anche con i cuori umani, con conseguente cardiomiocazione accettabile produce^3,4,5. Tuttavia, poiché la perfusione coronarica è fattibile solo se il cuore intatto o un grande cuneo miocardiale contenente un ramo dell'arteria coronaria è disponibile, la maggior parte degli esemplari cardiaci umani non sono adatti a questo approccio a causa delle loro piccole dimensioni e della mancanza di una vascolatura appropriata. Pertanto, l'isolamento dei cardiomiociti umani è impegnativo.

I campioni miocardali umani sono per lo più costituiti da blocchi di tessuto di dimensioni variabili (circa 0,5 x 0,5 x 0,5 cm a 2 x 2 x 2 cm), ottenuti attraverso biopsie endomiocardali⁶, miectomie setttiva⁷, impianti VAD⁸, o da cuori espiantati⁹. Le procedure più comuni per l'isolamento cardiomiocato iniziano con l'amatare il tessuto utilizzando forbici o un bisturi. I contatti tra cellule vengono poi interrotti dall'immersione nei tamponi senza calcio o a basso contenuto di calcio. Questo è seguito da più passaggi di digestione con estratti di enzimi grezzi o enzimi purificati come proteasi (ad esempio, trypsina), collagenasi, ialuronidae, o elastase, con conseguente disintegrazione della matrice extracellulare e liberazione dei cardiomiociti. In una fase finale, critica, una concentrazione fisiologica di calcio deve essere accuratamente ripristinata, o il danno cellulare può verificarsi a causa del calcio-paradosso^10,11,12. Questo approccio di isolamento è conveniente, ma in genere inefficiente. Per esempio, uno studio ha scoperto che quasi 1 g di tessuto miocardiale era necessario per ottenere un numero sufficiente di cardiomiociti adatti per esperimenti successivi¹³. Una possibile ragione per basse rese è il metodo relativamente duro di macinare il tessuto. Questo può danneggiare in particolare i cardiomiociti situati ai bordi del pezzo anche se questi miociti sono più probabilità di essere rilasciato dalla digestione ezimatica.

Un altro aspetto che può influenzare l'efficienza di isolamento e la qualità delle cellule ottenute da campioni umani è la durata dell'ischemia del tessuto. La maggior parte dei protocolli menzionano i tempi di trasporto brevi al laboratorio come prerequisito per buoni risultati. Questo limita lo studio dei cardiomiociti ventricolari umani ai laboratori con strutture di cardiochirurgia nelle vicinanze. Insieme, queste restrizioni ostacolano la verifica di importanti risultati da modelli animali nei cardiomiociti umani. Sono quindi auspicabili protocolli di isolamento migliorati che consentono rese elevate di cardiomiocazione da piccole quantità di tessuto, preferibilmente senza gravi danni dopo lunghi tempi di trasporto.

Descritto qui è un protocollo di isolamento basato sulla digestione ezimatica di sottili fette di tessuto miocardiale generate con un vibratome^14,15. Dimostriamo che l'isolamento dalle fette di tessuto è molto più efficiente di quello dei pezzi di tessuto macinati con le forbici. Il metodo descritto non solo consente elevate rese di cardiomiociti umani vitali da piccole quantità di tessuto miocardico, ma è applicabile anche ai campioni immagazzinati o trasportati in soluzione cardioplegica fredda per un massimo di 36 h.

Protocollo

Tutti gli esperimenti con i ratti sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali Mittelfranken, Baviera, Germania. La raccolta e l'uso di campioni di tessuto cardiaco umano è stato approvato dagli Institutional Review Boards dell'Università di Erlangen-Nornberg e della Ruhr-University Bochum. Gli studi sono stati condotti secondo le linee guida della Dichiarazione di Helsinki. I pazienti hanno dato il loro consenso informato scritto prima della raccolta dei tessuti.

I ratti Wistar femminili (150-200 g) sono stati ottenuti commercialmente, anetitizzati iniettando 100 mg/kg di tiopentale-sodio intraperitonealmente, ed eutanasia dalla lussazione cervicale seguita da toracacotomia ed escissione del cuore. I campioni di tessuto cardiaco umano sono stati raccolti dal nucleo apico sinistro-ventricolare durante l'impianto di dispositivi di assistenza meccanica, dalla myectomia settica, dalla tetralogia della chirurgia correttiva di Fallot o dalla parete libera sinistra-ventricolare dei cuori espiantati. Il seguente protocollo descrive l'isolamento dal tessuto ventricolare umano. L'isolamento dei cardiomiociti del ratto è stato eseguito di conseguenza, ma con diversi enzimi (vedi Tabella dei Materiali). Un flusso di lavoro schematico del protocollo è illustrato nella Figura 1.

1. Preparazione di buffer, soluzioni ed enzimi

1. Preparare i buffer e le soluzioni come elencato nella tabella 1.
2. Soluzioni di riscaldamento 1, 2, 3 e la soluzione di Tyrode modificata a 37 gradi centigradi. Conservare la soluzione di taglio a 4 gradi centigradi fino all'uso.
   NOTA: per 1–2 fette miocardali sono necessarie per un totale di circa 15 mL, 8 mL e 5 mL di soluzioni 1, 2 e 3 sono necessari per l'isolamento in un piatto di coltura tissure da 35 mm. Scalare di conseguenza per gli isolamenti miociti simultanei in più piatti. La soluzione di taglio può essere congelata e mantenuta a -20 gradi centigradi per diversi mesi.
3. Pesare 1 mg di proteinasi XXIV (vedi Tabella dei materiali) in un tubo di centrifugazione prechilled di 15 mL e conservare sul ghiaccio fino all'uso. Questo è per l'elaborazione di un campione. Aumentare l'importo di conseguenza. Non mescolare la proteinasi e il collagene.
4. Pesare 8 mg di CLSI collagenase (vedi Tabella dei Materiali) in un tubo di centrifugamento prechilled 15 mL e conservare sul ghiaccio fino all'uso. Questo è per l'elaborazione di un campione. Aumentare l'importo di conseguenza. Non mescolare la proteinasi e il collagene.
   CAUTION: Indossare una maschera per il viso o lavorare sotto un cappuccio di fumi per evitare l'inalazione di polvere enzimatica.
   NOTA: L'attività enzimatica può variare in lotti diversi. Pertanto, la concentrazione ottimale può differire e deve essere determinata con ogni enzima appena acquistato¹⁶.

2. Stoccaggio e trasporto di tessuto miocardiale

1. Conservare e trasportare campioni cardiaci umani in soluzione di taglio raffreddata a 4 gradi centigradi (Tabella 1).
2. Utilizzare la stessa soluzione per un'ulteriore lavorazione dei tessuti e affettatura vibrato.
   NOTA: Le biopsie e i campioni di cuore chirurgico devono essere trasferiti immediatamente alla soluzione di taglio a 4 gradi centigradi e possono quindi essere conservati o trasportati a 4 gradi centigradi per un massimo di 36 h prima dell'applicazione del presente protocollo.

3. Lavorazione e sezionamento del tessuto

NOTA: Il protocollo per il sezionamento dei tessuti segue Fischer et al.¹⁵.

1. Taglio del blocco di tessuto
   CAUTION: Il tessuto cardiaco umano è potenzialmente infettivo. Utilizzare sempre l'usura protettiva e seguire le norme di sicurezza del vostro istituto. Maneggiare con attenzione le lame usate e scartare nei contenitori di sicurezza.
   1. Mettere il campione in un piatto di coltura tissunte da 100 mm riempito con una soluzione di taglio a freddo da 20 mL e conservarlo su una piastra raffreddata di 4 gradi centigradi.
   2. Rimuovere il tessuto fibrotico in eccesso e il grasso epicardiale con un bisturi. In caso di campione transmurale, rimuovere gli strati di trabeculae e tessuti vicino all'endocardio.
      NOTA: Il tessuto fibrotico è rigido e appare bianco. Il grasso è tipicamente morbido e appare da bianco a giallo. Gli strati di tessuto trabeculae ed endocardili possono essere identificati dalla loro composizione di tessuto sciolto e da un orientamento della fibra non allineato rispetto al miocardio degli strati epicardiali
   3. Per una lavorazione ottimale del vibratome, tagliare blocchi di tessuto rettangolari di circa 8 mm x 8 mm x 8 mm con un bisturi da un campione di tessuto più grande. Per le biopsie più piccole saltare questo passaggio e passare all'incorporamento di agarose.
2. Incorporare il tessuto cardiaco nell'agarose a basso punto di fusione
   1. Far bollire 400 mg di agarose a basso punto di fusione in 10 mL di soluzione di taglio in un bicchiere di vetro.
      CAUTION: Indossare guanti e occhiali di sicurezza per evitare ustioni. Maneggiare vetreria calda solo con usura di protezione termica.
   2. Riempire una siringa da 10 mL con il gel agarose caldo e disciolto. Sigillare la siringa e lasciare che l'agarose sia equilibrato in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per almeno 15 minuti.
   3. Utilizzare le forcelle per posizionare il campione cardiaco tagliato o la biopsia in un piatto pulito di coltura tissutale da 35 mm con l'epicentro rivolto verso il basso e rimuovere il liquido in eccesso con un tampone sterile.
   4. Versare l'agarose equilibrata (punto 3.2.2) sul tessuto svuotando la siringa. Fissare il tessuto contro il movimento con le forcelle mentre versa l'agarose. Assicurarsi che il tessuto sia completamente immerso nell'agarose.
   5. Posizionare immediatamente il piatto sul ghiaccio e lasciare che l'agarose solidifica per 10 min.
3. Affettare il miocardio
   1. Montare una nuova lama di rasoio sul supporto della lama del vibratome e calibrare il vibratomo regolando la deflessione z della lama, se possibile.
      NOTA: questo protocollo utilizza un vibratome con un dispositivo di calibrazione a infrarossi per allineare la lama in posizione orizzontale con una minima deviazione z (deflessione misurata <0,1 m).
   2. Utilizzare un bisturi per accisa su un blocco di tessuto agarose che si adatta al supporto del campione del vibratome. Per garantire la stabilità, assicurarsi che il tessuto sia ancora sufficientemente immerso nell'agarose (margini di agarose - 8 mm).
   3. Fissare il blocco di agarose al supporto del campione con un sottile strato di colla cianoacrilato e pressione delicata.
   4. Posizionare il supporto del campione con il tessuto nel bagno vibratome. Riempire il bagno con la soluzione di taglio e tenere a 4-6 gradi centigradi per tutta la lavorazione con ghiaccio tritato, riempito nel serbatoio di raffreddamento esterno del vibratome.
   5. Generare fette spesse 300 m con una velocità di avanzamento di 0,1 mm/s, una frequenza oscillante di 80 Hz, un'ampiezza laterale di 1,5 mm e un angolo di lama di 15 gradi. Quando si maneggiano le fette, tenere l'agarose invece del tessuto stesso per evitare danni ai tessuti. Conservare le fette nella soluzione di taglio a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 h, se necessario.
      NOTA: I cardiomiociti sono orientati in parallelo all'epicardio. Pertanto, è importante tagliare in parallelo all'epicardio per evitare danni eccessivi di miocita. Si consiglia di scartare le prime 1-3 fette, in quanto solo le fette uniformi di spessore costante devono essere utilizzate per l'isolamento. Per le piccole biopsie tissu/tessuto, tuttavia, scartare solo la prima fetta.
   6. Controllare l'allineamento dei cardiomiocti sotto un microscopio leggero standard con un ingrandimento di 40-100x.

4. Digestione dei tessuti

1. Posizionare la piastra di calore sullo shaker di laboratorio e riscaldarla a 37 gradi centigradi. Avviare lo shaker di laboratorio a 65 giri/min.
2. Sciogliere la proteinasi (preparata al punto 1.3) in 2 mL della soluzione 1 (passo 1.1 e 1.2) e incubare a 37 gradi centigradi fino all'uso. Non mescolare la proteinasi e il collagene.
3. Sciogliere il collagene (preparato al punto 1.4) in 2 mL della soluzione 1 (passo 1.1 e 1.2) e incubare a 37 gradi centigradi fino all'uso. Non mescolare la proteinasi e il collagene.
   CAUTION: Indossare occhiali protettivi e guanti, perché gli enzimi disciolti possono causare lesioni cutanee e oculari.
4. Aggiungere il cloruro di calcio (CaCl₂) alla soluzione contenente collagenasi (preparata al punto 4.3) ad una concentrazione finale di 5 M.
5. Utilizzare le forcelle per trasferire una fetta di tessuto dal bagno vibratomo a un piatto pulito di coltura tissutale da 60 mm riempito con 5 mL di soluzione di taglio prechilled (passo 1.1 e 1.2) e tenere sul ghiaccio.
6. Rimuovere con cura l'agarose dal tessuto miocardiale con lama o forcelle.
   NOTA: Evitare l'eccesso di tensione e lo stress da taglio sulle fette miocardici, perché possono danneggiare i cardiomiociti.
7. Per eseguire il lavaggio iniziale, posizionare un piatto pulito di coltura del tessuto di 35 mm sulla piastra di calore e riempirlo con 2 mL di soluzione preriscaldato (37 gradi centigradi) 1. Trasferire 1-2 fette miocardali sul piatto preparato con le forpe. Aspirare la soluzione con una pipetta da 1 mL ed eseguire i passaggi di lavaggio 2x per rimuovere i resti della soluzione di taglio.
   NOTA: Non aspirare le fette cardiache. Le soluzioni e le fette devono rimanere ad una temperatura costante di 35 gradi centigradi sulla piastra di calore agitata. Se necessario, regolare la temperatura della piastra di calore.
8. Rimuovere la soluzione 1 dal piatto e aggiungere 2 mL della soluzione proteinasi (punto 4.2). Incubare per 12 minuti sulla piastra di calore a 65 rpm.
9. Lavare 2x con 2 mL di soluzione preriguermata 1 (37 gradi centigradi).
10. Rimuovere la soluzione 1 dal piatto e aggiungere 2 mL di soluzione di collagenase (punti 4.3 e 4.4). Incubare almeno 30 min sulla piastra di calore a 65 rpm.
11. Controllare i miociti individuali gratuiti a 30, 35, 40 min, ecc., mettendo il piatto sotto un microscopio leggero. Lavorate rapidamente per evitare un raffreddamento significativo della soluzione.
    NOTA: Il tempo di digestione richiesto può variare a seconda della costituzione dei tessuti e del grado di fibrosi. Non appena il tessuto diventa visibilmente morbido e si dissocia facilmente quando viene tirato delicatamente, è stato raggiunto il tempo di digestione ottimale. Se è disponibile un tessuto sufficiente, diverse fette possono essere digeriti in parallelo con tempi di digestione variabili.
12. Quando il tessuto viene digerito e i singoli miociti sono visibili (punto 4.11), lavare 2x con 2 mL di soluzione preriguerrata 2 (37 gradi centigradi) e riempire nuovamente con 2 mL.

5. Dissociazione dei tessuti

1. Dissociare le fette di tessuto digerito con le forcate tirando con attenzione le fibre a parte.
2. Pipetta con attenzione più volte con una pipetta Pasteur monoioio (diametro di apertura >2 mm).
   NOTA: L'uso di forcette e pipettamento può indurre stress meccanico e causare danni da cardiomiocite. Tuttavia, è un passo cruciale per la separazione delle cellule. Utilizzare le forcepi fini per ridurre al minimo i danni alle cellule e dissociare attentamente le fette in pezzi più piccoli.
3. Controllare i cardiomiociti a forma di asta liberati al microscopio leggero.

6. Reintroduzione della concentrazione fisiologica di calcio

1. Aumentare lentamente la concentrazione di calcio da 5 M a 1,5 mM mentre si agita a 35 gradi centigradi sulla piastra di calore. Utilizzare soluzioni di stock CaCl₂ da 10 mM e 100 mM. Passaggi consigliati: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1.200, 1.500 M. Consentire alle cellule di adattarsi ai livelli di calcio aumentati in intervalli di incubazione di 5 minuti tra ogni passaggio.
2. Rimuovere i pezzi di tessuto non digeriti con attenzione con le fopate o filtrare le sospensioni cellulari attraverso una rete di nylon con dimensioni di poro di 180 m alla fine dell'aumento del calcio.

7. Rimozione dell'agente disaccoppiamento meccanico

1. Fermare l'agitazione e rimuovere lentamente un terzo della soluzione (700 L) dall'alto con una pipetta da 1.000 L. Evitare l'aspirazione dei cardiomiociti.
   NOTA: Se il tessuto non digerito è stato rimosso, i cardiomiociti si accumulano al centro del piatto, il che facilita l'aspirazione di una soluzione senza cellule. In caso contrario, trasferire la soluzione cellulare in un tubo di centrifuga di 15 mL e consentire alle cellule di sedimentarsi per 10 min a 35 gradi centigradi, quindi aspirare 700 L del supernante e scartare, risospendere le cellule, trasferirle in un piatto di coltura velico di 35 mm e procedere con il punto 7.2.
2. Aggiungere 700 L della soluzione 3 alle cellule, riprendere l'agitazione sulla piastra di calore e incubare per 10 min.
3. Ripetere i passaggi 7.1 e 7.2.
4. Trasferire la soluzione in un tubo di centrifuga di 15 mL e lasciare che i cardiomiociti si sedimentino per un minimo di 10 min e un massimo di 30 min a temperatura ambiente o girare a 50 x g per 1 min. Rimuovere completamente il supernatant e risuspendere nella soluzione di Tyrode modificata o nel buffer di sperimentazione desiderato.
   NOTA: i cardiomiociti possono essere conservati nella soluzione di Tyrode modificata(Tabella 1) per diverse ore a 37 gradi centigradi e 5% di CO_{2 prima} dell'uso.
5. Verificare la qualità delle cellule con un microscopio leggero standard con ingrandimento 40x e 200x.
   NOTA: Circa il 30-50% dei cardiomiociti deve essere a forma di asta, liscio senza bleb di membrana e visualizzare chiare striature incrociate. Solo il 5-10% delle cellule vitali dovrebbe mostrare contrazioni spontanee.

Risultati

Per verificare l'efficienza dell'isolamento, il protocollo è stato utilizzato con il miocardio di ratto e il numero risultante di miociti vitali è stato confrontato con i numeri ottenuti dall'isolamento tramite perfusione coronarica e dall'isolamento da piccoli blocchi di tessuto (isolamento dei blocchi, Figura 2). L'isolamento dei blocchi e l'isolamento dalle fette di tessuto sono stati eseguiti dagli stessi cuori. Per l'isolamento tramite perfusione coronarica, tuttavia, è stato utilizz...

Discussione

Anche se l'isolamento dei cardiomiociti viventi è stato stabilito più di 40 anni fa ed è ancora un prerequisito per molti approcci sperimentali nella ricerca cardiaca, rimane una tecnica difficile con esiti imprevedibili. L'isolamento dei cardiomiocite tramite perfusione delle arterie coronarie con soluzione enzimatica è comunemente usato per i cuori di piccoli animali e produce un gran numero di cellule vitali. Tuttavia, ciò richiede un sistema e una competenza relativamente complessi. Inoltre, la maggior parte dei...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
2,3-butanedionemonoxime	Carl Roth	3494.1	Purity>99%
Bovine serum albumin	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
Creatine monohydrate	Alfa Aesar	B250009
Glucose	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3
KCl	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
L-glutamic acid	Fluka Biochemica	49450
Low melting-point agarose	Carl Roth	6351.5
MgCl2 x 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Taurine	Sigma Aldrich	T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher Scientific	D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I	Worthington	LS004196	Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II	Worthington	LS004176	Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg)
Protease XIV	Sigma Aldrich	P8038	Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV	Sigma Aldrich	P5147	Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa)	BD Bioscience	649225
Centrifuge tube, 15 mL	Corning	430790
Centrifuge tube, 50 mL	Corning	430829
Compact shaker	Edmund Bühler	KS-15 B control	Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes	Carl Roth	EA65.1	For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps	FST	11271-30
Heatblock	VWR	BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm	Merck	NY8H04700
TC Dish 100, Standard	Sarstedt	83.3902
TC Dish 35, Standard	Sarstedt	83.3900
TC Dish 60, Standard	Sarstedt	83.3901
Vibratome (VT1200S)	Leica	1491200S001	Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection