Isolamento de Cardiomiócitos Ventriculares Humanos de fatias de miocárdio cortadas por vibratome

Resumo

Apresentado é um protocolo para o isolamento de cardiomiócitos ventriculares humanos e animais de fatias miocárrias cortadas por vibratome. Altos rendimentos de células tolerantes ao cálcio (até 200 células/mg) podem ser obtidos a partir de pequenas quantidades de tecido (<50 mgs). O protocolo é aplicável ao miocárdio exposto à isquemia fria por até 36 h.

Resumo

O isolamento de miócitos cardíacos ventriculares de corações animais e humanos é um método fundamental na pesquisa cardíaca. Cardiomiócitos animais são comumente isolados por perfusão coronária com enzimas digestivas. No entanto, isolar os cardiomiócitos humanos é um desafio porque os espécimes do miocárdio humano geralmente não permitem perfusão coronária, e protocolos alternativos de isolamento resultam em baixos rendimentos de células viáveis. Além disso, as amostras de miocárdio humano são raras e só estão disponíveis regularmente em instituições com cirurgia cardíaca no local. Isso dificulta a tradução de achados de cardiomiócitos animais para humanos. Descrito aqui é um protocolo confiável que permite o isolamento eficiente de miócitos ventriculares do miocárdio humano e animal. Para aumentar a relação superfície-volume, minimizando os danos celulares, as fatias de tecido miocárdio de 300 μm de espessura são geradas a partir de amostras do miocárdio com um vibratome. As fatias de tecido são então digeridas com protease e colagem. O miocárdio de rato foi usado para estabelecer o protocolo e quantificar os rendimentos de miócitos viáveis e tolerantes ao cálcio por contagem de células citométricas de fluxo. A comparação com o método de pedaço de tecido comumente utilizado mostrou rendimentos significativamente maiores de cardiomiócitos em forma de haste (41,5 ± 11,9 vs. 7,89 ± 3,6%, p < 0,05). O protocolo foi traduzido para o miocárdio humano falha e não falha, onde os rendimentos foram semelhantes aos do miocárdio de rato e, novamente, notavelmente maior do que com o método de pedaço de tecido (45,0 ± 15,0 vs. 6,87 ± 5,23 células/mg, p < 0,05). Notavelmente, com o protocolo apresentado é possível isolar números razoáveis de cardiomiócitos humanos viáveis (9-200 células/mg) de quantidades mínimas de tecido (<50 mgs). Assim, o método é aplicável ao miocárdio saudável e falhado tanto do coração humano quanto do animal. Além disso, é possível isolar miócitos excitáveis e contratuais de amostras de tecido humano armazenadas por até 36 h em solução cardioplégica fria, tornando o método particularmente útil para laboratórios em instituições sem cirurgia cardíaca no local.

Introdução

Uma técnica seminal que abriu caminho para importantes insights sobre a fisiologia do cardiomiócito é o isolamento de cardiomiócitos ventriculares vivos de corações intactos¹. Cardiomiócitos isolados podem ser usados para estudar a estrutura e função celular normal, ou as consequências de experimentos in vivo; por exemplo, avaliar alterações na eletrofisiologia celular ou acoplamento excitação-contração em modelos animais de doença cardíaca. Além disso, cardiomiócitos isolados podem ser usados para cultura celular, intervenções farmacológicas, transferência genética, engenharia de tecidos e muitas outras aplicações. Portanto, métodos eficientes para isolamento cardiomiócito são de valor fundamental para a pesquisa cardíaca básica e translacional.

Cardiomiócitos de pequenos mamíferos, como roedores, e de mamíferos maiores, como porcos ou cães, são comumente isolados pela perfusão coronária do coração com soluções contendo colagens brutas e/ou proteases. Este foi descrito como o método "padrão ouro" para o isolamento do cardiomiócito, resultando em rendimentos de até 70% das células viáveis². A abordagem também tem sido utilizada com corações humanos, resultando em rendimentos de cardiomiócitos aceitáveis^3,,4,5. No entanto, como a perfusão coronária só é viável se o coração intacto ou uma grande cunha miocárdia contendo um ramo da artéria coronária estiver disponível, a maioria dos espécimes cardíacos humanos não são adequados para esta abordagem devido ao seu pequeno tamanho e à falta de vasculatura apropriada. Portanto, o isolamento dos cardiomiócitos humanos é desafiador.

As amostras do miocárdio humano consistem principalmente em pedaços de tecido de tamanho variável (aproximadamente 0,5 x 0,5 x 0,5 cm a 2 x 2 x 2 cm), obtidos através de biópsias endomyocárdias^6,mectomias septal^7,implantações VAD⁸, ou de corações explanados⁹. Os procedimentos mais comuns para isolamento cardiomiocócito começam com picar o tecido usando uma tesoura ou um bisturi. Os contatos célula-células são então interrompidos pela imersão em tampões livres de cálcio ou de baixo cálcio. Isso é seguido por múltiplas etapas de digestão com extratos de enzimas brutas ou enzimas purificadas como proteases (por exemplo, trippsina), colagenase, hialuronidase ou elastase, resultando em desintegração da matriz extracelular e liberação de cardiomiócitos. Em um passo final e crítico, uma concentração fisiológica de cálcio deve ser cuidadosamente restaurada, ou danos celulares podem ocorrer devido ao cálcio-paradoxo^10,,11,12. Essa abordagem de isolamento é conveniente, mas geralmente ineficiente. Por exemplo, um estudo descobriu que quase 1 g de tecido miocárdio era necessário para obter um número suficiente de cardiomiócitos adequados para experimentos subsequentes¹³. Uma possível razão para baixos rendimentos é o método relativamente severo de picar o tecido. Isso pode danificar particularmente os cardiomiócitos localizados nas bordas do pedaço, embora esses miócitos sejam mais propensos a serem liberados por digestão enzimática.

Outro aspecto que pode influenciar a eficiência do isolamento e a qualidade das células obtidas a partir de espécimes humanos é a duração da isquemia tecidual. A maioria dos protocolos menciona o curto tempo de transporte para o laboratório como pré-requisito para bons resultados. Isso restringe o estudo de cardiomiócitos ventriculares humanos a laboratórios com instalações de cirurgia cardíaca próximas. Juntas, essas restrições dificultam a verificação de achados importantes de modelos animais em cardiomiócitos humanos. Protocolos de isolamento aprimorados que permitem altos rendimentos de cardiomiócitos de pequenas quantidades de tecido, de preferência sem danos graves após tempos de transporte prolongados, são, portanto, desejáveis.

Descrito aqui é um protocolo de isolamento baseado na digestão enzimática de finas fatias de tecido miocárdio geradas com um vibratome^14,15. Demonstramos que o isolamento de fatias de tecido é muito mais eficiente do que o de pedaços de tecido picados com tesouras. O método descrito não só permite altos rendimentos de cardiomiócitos humanos viáveis de pequenas quantidades de tecido miocárdio, mas também é aplicável a espécimes armazenados ou transportados em solução cardioplégica fria por até 36 h.

Protocolo

Todos os experimentos com ratos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso animal Mittelfranken, Baviera, Alemanha. A coleta e o uso de amostras de tecido cardíaco humano foram aprovados pelos Conselhos de Revisão Institucional da Universidade de Erlangen-Nürnberg e do Bochum ruhr-university. Os estudos foram realizados de acordo com as diretrizes da Declaração de Helsinque. Os pacientes deram seu consentimento por escrito informado antes da coleta de tecidos.

Ratos Wistar fêmeas (150-200 g) foram obtidos comercialmente, anestesiados pela injeção de 100 mg/kg de tiopental-sódio intraperitoneal, e eutanizados por luxação cervical seguido de toracotomia e excisão do coração. Amostras de tecido cardíaco humano foram coletadas do núcleo apical esquerdo-ventricular durante a implantação de dispositivos de assistência mecânica, da mectomia septal, da tetralogia da cirurgia corretiva fallot, ou da parede livre de ventricular esquerda de corações explantados. O protocolo a seguir descreve o isolamento do tecido ventricular humano. O isolamento dos cardiomiócitos de ratos foi realizado em conformidade, mas com enzimas diferentes (ver Tabela de Materiais). Um fluxo de trabalho esquemático do protocolo é ilustrado na Figura 1.

1. Preparação de buffers, soluções e enzimas

1. Prepare buffers e soluções conforme listado na Tabela 1.
2. Aqueça as soluções 1, 2, 3 e a solução modificada de Tyrode a 37 °C. Armazene a solução de corte a 4 °C até usar.
   NOTA: Para 1-2 fatias de miocárdio um total de aproximadamente 15 mL, 8 mL e 5 mL de soluções 1, 2 e 3 são necessárias para o isolamento em um prato de cultura de tecido de 35 mm. Dimensione-se de acordo para isolamentos simultâneos de miócitos em vários pratos. A solução de corte pode ser congelada e mantida a -20 °C por vários meses.
3. Pesar 1 mg de proteinase XXIV (ver Tabela de Materiais) em um tubo de centrífuga de 15 mL pré-15 mL e armazenar no gelo até o uso. Isto é para processar uma amostra. Aumente a quantidade em conformidade. Não misture a proteína e a colagem.
4. Pesar 8 mg de clsi de colagenase (ver Tabela de Materiais) em um tubo de centrífuga de 15 mL pré-15 mL e armazenar no gelo até usar. Isto é para processar uma amostra. Aumente a quantidade em conformidade. Não misture a proteína e a colagem.
   ATENÇÃO: Use uma máscara facial ou trabalhe sob um capô de fumaça para evitar a inalação de pó enzimálico.
   NOTA: A atividade enzimápica pode variar em lotes diferentes. Portanto, a concentração ideal pode diferir e deve ser determinada com cada enzima recém-adquirida¹⁶.

2. Armazenamento e transporte de tecido miocárdio

1. Armazene e transporte amostras cardíacas humanas em solução de corte de 4 °C resfriada(Tabela 1).
2. Use a mesma solução para processamento de tecidos e fatiamento de vibratome.
   NOTA: As biópsias e amostras cirúrgicas do coração devem ser transferidas imediatamente para a solução de corte a 4 °C e podem ser armazenadas ou transportadas a 4 °C por um máximo de 36 h antes da aplicação deste protocolo.

3. Processamento e fatiamento do tecido

NOTA: O protocolo para corte de tecidos segue Fischer et al.¹⁵.

1. Corte do bloco de tecido
   ATENÇÃO: O tecido cardíaco humano é potencialmente infeccioso. Use sempre o desgaste protetor e siga as normas de segurança da sua instituição. Manuseie cuidadosamente as lâminas usadas e descarte em recipientes de segurança.
   1. Coloque a amostra em um prato de cultura de tecido de 100 mm recheado com solução de corte frio de 20 mL e mantenha em uma placa de 4 °C resfriada.
   2. Remova o excesso de tecido fibroso e gordura epicártica com um bisturi. No caso de uma amostra transmural, remova as camadas de trabeculas e tecidos perto do endocárdio.
      NOTA: O tecido fibroso é rígido e parece branco. A gordura é tipicamente macia e parece branca para amarela. As camadas de tecido trabecula e endocárdio podem ser identificadas a partir de sua composição de tecido solto e uma orientação de fibras não-assinadas em comparação com o miocárdio das camadas epicárardias
   3. Para o processamento ideal de vibratome, corte blocos de tecido retangular de aproximadamente 8 mm x 8 mm x 8 mm com um bisturi de uma amostra de tecido maior. Para biópsias menores, pule esta etapa e passe para a incorporação de agarose.
2. Incorporando tecido cardíaco em ponto de baixa fusão agarose
   1. Ferva 400 mg de ponto de baixa fusão em 10 mL de solução de corte em um béquer de vidro.
      ATENÇÃO: Use luvas e óculos de segurança para evitar queimaduras. Manuseie vidros quentes apenas com desgaste de proteção térmica.
   2. Encha uma seringa de 10 mL com o gel de agarose quente e dissolvido. Sele a seringa e deixe a agarose equilibrar-se em um banho de água de 37 °C por pelo menos 15 min.
   3. Use fórceps para colocar a amostra cardíaca aparada ou a biópsia em um prato limpo de cultura de tecido de 35 mm com o epicardium voltado para baixo e remover o excesso de fluido com um cotonete estéril.
   4. Despeje a agarose equilibrada (passo 3.2.2) sobre o tecido esvaziando a seringa. Proteja o tecido contra o movimento com fórceps enquanto derrama a agarose. Certifique-se de que o tecido está completamente imerso em agarose.
   5. Coloque imediatamente o prato no gelo e deixe a agarose solidificar por 10 minutos.
3. Cortando o miocárdio
   1. Monte uma nova lâmina de barbear no suporte da lâmina do vibratome e calibrar o vibratome ajustando a z-deflexão da lâmina, se possível.
      NOTA: Este protocolo usa um vibratome com um dispositivo de calibração assistido por infravermelho para alinhar a lâmina em uma posição horizontal com mínima deflexão z (deflexão medida <0,1 μm).
   2. Use um bisturi para extirpar um bloco de tecido agarose que se encaixe no porta-amostras do vibratome. Para garantir a estabilidade, certifique-se de que o tecido ainda esteja suficientemente imerso em agarose (margens de agarose ≥ 8 mm).
   3. Fixar o bloco de agarose ao suporte do espécime com uma fina camada de cola cianoacrilato e pressão suave.
   4. Coloque o porta-amostras com o tecido no banho de vibratome. Encha o banho com solução de corte e mantenha a 4-6 °C durante todo o processamento com gelo esmagado, preenchido no tanque de resfriamento externo do vibratome.
   5. Gerar fatias de 300 μm de espessura com uma velocidade de avanço de ≤0,1 mm/s, uma frequência oscilante de 80 Hz, uma amplitude lateral de 1,5 mm e um ângulo de lâmina de 15°. Ao manusear as fatias, segure a agarose em vez do próprio tecido para evitar danos teciduais. Armazene as fatias na solução de corte a 4 °C por uma máxima de 2h, se necessário.
      NOTA: Os cardiomiócitos são orientados em paralelo ao epicárdio. Por isso, é importante cortar paralelamente ao epicárdio para evitar danos excessivos ao miócito. Recomenda-se descartar as primeiras 1-3 fatias, pois apenas fatias uniformes de espessura constante devem ser usadas para o isolamento. Para biópsias de tecido pequeno, no entanto, descarte apenas a primeira fatia.
   6. Verifique o alinhamento do cardiomiócito sob um microscópio de luz padrão com uma ampliação de 40-100x.

4. Digestão tecidual

1. Coloque a placa de calor no agitador de laboratório e aqueça-a a 37 °C. Comece o agitador de laboratório a 65 rpm.
2. Dissolva a proteína (preparada na etapa 1.3) em 2 mL de solução 1 (etapa 1.1 e 1.2) e incubar a 37 °C até o uso. Não misture a proteína e a colagem.
3. Dissolva a colagemnase (preparada na etapa 1.4) em 2 mL de solução 1 (etapa 1.1 e 1.2) e incubar a 37 °C até o uso. Não misture a proteína e a colagem.
   ATENÇÃO: Use óculos protetores e luvas, pois enzimas dissolvidas podem causar lesões na pele e nos olhos.
4. Adicione cloreto de cálcio (CaCl₂) à solução contendo colagenase (preparada na etapa 4.3) a uma concentração final de 5 μM.
5. Use fórceps para transferir uma fatia de tecido do banho de vibratome para um prato limpo de cultura de tecido de 60 mm recheado com 5 mL de solução de corte pré-moída (passo 1.1 e 1.2) e manter no gelo.
6. Remova cuidadosamente a agarose do tecido miocárdio com lâmina ou fórceps.
   NOTA: Evite o excesso de tensão e o estresse da tesoura nas fatias do miocárdio, pois podem danificar os cardiomiócitos.
7. Para realizar a lavagem inicial, coloque um prato limpo de cultura de tecido de 35 mm na placa de calor e encha-o com 2 mL de solução pré-armada (37 °C). Transfira 1-2 fatias de miocárdio para o prato preparado com fórceps. Aspire a solução com uma pipeta de 1 mL e realize as etapas de lavagem 2x para remover os restos da solução de corte.
   NOTA: Não aspire as fatias cardíacas. As soluções e as fatias devem permanecer a uma temperatura constante de 35 °C na placa de calor agitada. Ajuste a temperatura da placa de calor, se necessário.
8. Retire a solução 1 do prato e adicione 2 mL da solução proteinase (passo 4.2). Incubar por 12 min na placa de calor a 65 rpm.
9. Lave 2x com 2 mL de solução pré-armada 1 (37 °C).
10. Retire a solução 1 do prato e adicione 2 mL de solução de colagenase (etapas 4.3 e 4.4). Incubar pelo menos 30 min na placa de calor a 65 rpm.
11. Verifique miócitos individuais gratuitos em 30, 35, 40 min, etc., colocando o prato sob um microscópio leve. Trabalhe rapidamente para evitar um resfriamento significativo da solução.
    NOTA: O tempo de digestão necessário pode variar dependendo da constituição do tecido e do grau de fibrose. Assim que o tecido fica visivelmente macio e dissocia prontamente quando puxado suavemente, o tempo ideal de digestão foi atingido. Se houver tecido suficiente disponível, várias fatias podem ser digeridas em paralelo com os tempos variados de digestão.
12. Quando o tecido for digerido e os miócitos individuais estiverem visíveis (etapa 4.11), lave 2x com 2 mL de solução pré-armada 2 (37 °C) e encha novamente com 2 mL.

5. Dissociação tecidual

1. Dissociar as fatias de tecido digerido com fórceps, puxando cuidadosamente as fibras.
2. Pipeta cuidadosamente várias vezes com uma pipeta Pasteur de uso único (diâmetro de abertura >2 mm).
   NOTA: O uso de fórceps e tubulações pode induzir estresse mecânico e causar danos cardiomiócitos. No entanto, é um passo crucial para a separação das células. Use fórceps finos para minimizar os danos celulares e dissociar cuidadosamente as fatias em pedaços menores.
3. Verifique se há cardiomiócitos em forma de vara liberados sob o microscópio de luz.

6. Reintrodução da concentração fisiológica de cálcio

1. Aumente lentamente a concentração de cálcio de 5 μM para 1,5 mM enquanto agita a 35 °C na placa de calor. Use soluções de estoque cacl₂ de 10 mM e 100 mM. Etapas recomendadas: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1.200, 1.500 μM. Permitir que as células se adaptem aos níveis de cálcio aumentados em intervalos de incubação de 5 minutos entre cada etapa.
2. Remova os pedaços de tecido não digerido cuidadosamente com fórceps ou filtre a suspensão celular através de uma malha de nylon com tamanho de poros de 180 μm no final do aumento do cálcio.

7. Remoção de agente de desacoplamento mecânico

1. Pare a agitação e remova lentamente um terço da solução (~700 μL) do topo com uma pipeta de 1.000 μL. Evite aspiração dos cardiomiócitos.
   NOTA: Se o tecido não digerido for removido, os cardiomiócitos se acumularão no centro do prato, o que facilita a aspiração de solução livre de células. Se não, transfira a solução celular para um tubo de centrífuga de 15 mL e permita que as células sedimentem por 10 minutos a 35 °C, depois aspire 700 μL do supernascedor e descarte, resuspense as células, transfira-as de volta para um prato de cultura de tecido de 35 mm e proceda com o passo 7.2.
2. Adicione 700 μL de solução 3 às células, retome a agitação na placa de calor e incuba por 10 minutos.
3. Repita as etapas 7.1 e 7.2.
4. Transfira a solução para um tubo de centrífuga de 15 mL e permita que os cardiomiócitos se sedimentem por um mínimo de 10 minutos e um máximo de 30 minutos à temperatura ambiente ou gire a 50 x g por 1 min. Remova o supernatante completamente e resuspend na solução modificada de Tyrode ou no buffer de experimentação desejado.
   NOTA: Os cardiomiócitos podem ser armazenados na solução modificada de Tyrode(Tabela 1) por várias horas a 37 °C e 5% de CO₂ antes de usar.
5. Verifique a qualidade da célula com um microscópio de luz padrão em 40x e 200x de ampliação.
   NOTA: Cerca de 30 a 50% dos cardiomócitos devem ser em forma de haste, lisos sem blebs de membrana e exibir estrias cruzadas claras. Apenas 5 a 10% das células viáveis devem apresentar contrações espontâneas.

Resultados

Para verificar a eficiência do isolamento, o protocolo foi utilizado com miocárdio de rato e o número resultante de miócitos viáveis foi comparado com os números obtidos pelo isolamento via perfusão coronária e pelo isolamento de pequenos pedaços de tecido (isolamento de pedaços, Figura 2). O isolamento dos pedaços e o isolamento das fatias de tecido foram realizados dos mesmos corações. Para o isolamento via perfusão coronária, no entanto, todo o coração foi usado. A perfus...

Discussão

Embora o isolamento dos cardiomiócitos vivos tenha sido estabelecido há mais de 40 anos e ainda seja um pré-requisito para muitas abordagens experimentais na pesquisa cardíaca, continua a ser uma técnica difícil com resultados imprevisíveis. O isolamento cardiomiocócito através da perfusão das artérias coronárias com solução enzimópica é comumente usado para corações de animais pequenos e produz um grande número de células viáveis. No entanto, isso requer um sistema e experiência relativamente compl...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
2,3-butanedionemonoxime	Carl Roth	3494.1	Purity>99%
Bovine serum albumin	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
Creatine monohydrate	Alfa Aesar	B250009
Glucose	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3
KCl	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
L-glutamic acid	Fluka Biochemica	49450
Low melting-point agarose	Carl Roth	6351.5
MgCl2 x 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Taurine	Sigma Aldrich	T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher Scientific	D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I	Worthington	LS004196	Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II	Worthington	LS004176	Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg)
Protease XIV	Sigma Aldrich	P8038	Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV	Sigma Aldrich	P5147	Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa)	BD Bioscience	649225
Centrifuge tube, 15 mL	Corning	430790
Centrifuge tube, 50 mL	Corning	430829
Compact shaker	Edmund Bühler	KS-15 B control	Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes	Carl Roth	EA65.1	For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps	FST	11271-30
Heatblock	VWR	BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm	Merck	NY8H04700
TC Dish 100, Standard	Sarstedt	83.3902
TC Dish 35, Standard	Sarstedt	83.3900
TC Dish 60, Standard	Sarstedt	83.3901
Vibratome (VT1200S)	Leica	1491200S001	Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection