ビブラートムカット心筋切れ切り切れからヒト心室心筋細胞を分離

要約

提示は、ビブラートメカット心筋切れスライスからヒトおよび動物心室心筋細胞を単離するためのプロトコルである。カルシウム耐性細胞の高収率(最大200細胞/mg)は、少量の組織(<50mg)から得ることができます。このプロトコルは、最大36時間の冷たい虚血にさらされた心筋に適用可能です。

要約

動物およびヒトの心臓から心室心筋細胞を分離することは、心臓研究の基本的な方法である。動物の心筋細胞は、一般的に消化酵素と冠状動脈灌流によって単離される。しかし、ヒト心筋細胞の単離は、ヒト心筋標本が冠状灌流を許容しないのが通常であり、代替分離プロトコルは生存細胞の収率が悪いため、困難である。さらに、ヒト心筋標本はまれであり、オンサイト心臓手術を受けた機関でのみ定期的に入手可能である。これは、動物からヒト心筋細胞への所見の翻訳を妨げる。ここで説明する信頼性の高いプロトコルは、心室筋細胞をヒトおよび動物心筋膜から効率的に分離することを可能にする。細胞の損傷を最小限に抑えながら表面対体積比を高めるために、300μm厚の心筋組織スライスは、ビブラートメを用いた心筋標本から生成される。その後、組織スライスをプロテアーゼとコラゲアーゼで消化します。ラット心筋は、フロー細胞測定細胞計数によって、プロトコルを確立し、生存可能なカルシウム耐性筋細胞の収量を定量化するために使用された。一般的に使用される組織チャンク法との比較は、棒状心筋細胞の有意に高い収率を示した(41.5±11.9対7.89±3.6%、p<0.05)。このプロトコルは、ラット心筋と同様に収率が著しく高い失敗したヒト心筋(45.0 ±15.0対6.87±5.23細胞/mg、p<0.05)に翻訳された。特に、提示されたプロトコルでは、生存可能なヒト心筋細胞(9〜200細胞/mg)の合理的な数を最小限の組織(<50mg)から分離することが可能である。したがって、この方法は、人間と動物の両方の心臓からの健康で失敗した心筋に適用可能である。さらに、冷たい心肢麻痺溶液中で最大36時間保存されたヒト組織標本から興奮性および収縮性筋細胞を分離することができ、オンサイト心臓手術を受けずに機関の実験室に特に有用な方法を作り出す。

概要

心筋細胞生理学に関する重要な洞察への道を開いた精膜技術は、無傷の心臓から生きている心室心筋細胞の分離^である1.分離された心筋細胞は、正常な細胞構造と機能、または生体内実験の結果を研究するために使用することができます。例えば、心疾患の動物モデルにおける細胞電生理学または興奮収縮結合の変化を評価する。さらに、分離された心筋細胞は、細胞培養、薬理学的介入、遺伝子導入、組織工学、および他の多くの用途に使用することができる。したがって、心筋細胞の分離のための効率的な方法は、基礎的および翻訳的な心臓研究にとって基本的な価値がある。

げっ歯類などの小さな哺乳類や、豚やイヌなどの大型哺乳類の心筋細胞は、一般的に、粗なコラゲアーゼおよび/またはプロテアーゼを含む溶液で心臓の冠状灌流によって単離される。これは心筋細胞単離のための「ゴールドスタンダード」法として説明されており、その結果、生存細胞の70%までの収率^が2となる。このアプローチは人間の心臓でも使用されており、その結果、許容可能な心筋細胞の収量^{は,3、4、5,5}である。しかし冠状動脈灌流は、無傷の心臓や冠状動脈枝を含む大きな心筋のくさびが利用できる場合にのみ実現可能であるため、ほとんどのヒト心臓検体は、その小さなサイズと適切な血管構造の欠如のために、このアプローチには適していません。したがって、ヒト心筋細胞の単離は困難です。

ヒト心筋標本は主に可変サイズの組織塊(約0.5 x 0.5 x 0.5 cm〜2 x 2 x 2 x 2 cm)から成り、心外筋生検^6、中隔筋切除術^7、VAD移植^8、または外植体⁹から得られる。心筋細胞の分離のための最も一般的な手順は、はさみまたはメスを使用して組織をミンチから始める。細胞間接触は、カルシウムフリーまたは低カルシウムバッファーに浸漬することによって破壊される。その後、粗酵素抽出物またはプロテアーゼ(トリプシン)、コラゲラーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼなどの酵素を含む複数の消化ステップが続き、細胞外マトリックスの崩壊および心筋細胞の解放が生じる。最終的な重要なステップでは、生理的カルシウム濃度を注意深く回復しなければならないか、カルシウムパラドックス^{10、11、1211,12}による細胞損傷が起こり得る。¹⁰この分離アプローチは便利ですが、通常は非効率的です。例えば、ある研究では、13の実験に適した十分な数の心筋細胞を得るために、ほぼ^1gの心筋組織が必要であることがわかった。低収量の考えられる理由は、組織をミンチする比較的過酷な方法です。これは、これらの筋細胞が酵素消化によって放出される可能性が最も高いが、チャンクエッジに位置する心筋細胞に特に損傷を与える可能性がある。

ヒト検体から得られる細胞の分離効率と質に影響を与える可能性のあるもう一つの側面は、組織虚血の持続時間である。ほとんどのプロトコルは、良い結果のための前提条件として実験室への短い輸送時間を言及しています。これは、近くの心臓手術施設を持つ実験室にヒト心室心筋細胞の研究を制限します。これらの制限は、ヒト心筋細胞の動物モデルからの重要な知見の検証を妨げる。したがって、少量の組織からの高い心筋細胞収量を可能にする改善された分離プロトコルは、輸送時間の延長後に重大な損傷を受けることなく、望ましい。

ここで説明する分離プロトコルは、ビブラート膜^14,15,15で生成された薄い心筋組織スライスの酵素消化に基づく。我々は、組織スライスからの分離は、はさみで刻まれた組織塊からのよりはるかに効率的であることを実証する。この方法は、少量の心筋組織から生じるヒト心筋細胞の高収量を可能にするだけでなく、最大36時間の冷たい心肢麻痺溶液中に保存または輸送された標本にも適用可能である。

プロトコル

ラットを用いた実験はすべて、ドイツのバイエルン州ミッテルフランケン動物ケア・使用委員会によって承認されました。ヒト心臓組織サンプルの収集と使用は、エアランゲン・ニュルンベルク大学とルール大学ボーフム校の機関審査委員会によって承認されました。研究は、ヘルシンキの宣言のガイドラインに従って行われました.患者は組織採取前に書面によるインフォームド・コンセントを与えた。

雌ウィスターラット(150〜200g)を商業的に得て、100mg/kgのチオペンタールナトリウム腹腔内に注入し、子宮頸部脱臼で安楽死させ、続いて胸部の胸部切開術と切除を行った。ヒト心臓組織サンプルは、機械的補助装置の移植中に左心室の心臓核から採取された、中隔筋切除術から、ファロー矯正手術の四徴から、または、外植された心臓の自由な左室壁から採取した。以下のプロトコルは、ヒト心室組織からの分離について説明する。ラット心筋細胞の単離は、それに応じて行われたが、異なる酵素で行われた(材料表を参照)。このプロトコルの概略的なワークフローを図 1に示します。

1. バッファー、溶液、酵素の調製

1. 表 1に示すように、バッファとソリューションを準備します。
2. ウォームアップソリューション1、2、3と37°Cに変更されたタイロードのソリューション。 使用するまで、4°Cで切削液を保管してください。
   注:1~2個の心筋スライスでは、35mm組織培養皿1種での分離には、合計約15mL、8mL、および5mLの溶液1、2、および3が必要です。複数の皿の同時の筋細胞の分離のためにそれに応じてスケールアップ。切断液は、凍結し、数ヶ月間-20°Cで保つことができます。
3. プレチル15 mL遠心チューブに1mgのプロテイナーゼXXIV( 材料表を参照)を秤量し、使用するまで氷の上に保存します。これは、1つのサンプルを処理するためのものです。それに応じて量をスケールアップします。プロテイナーゼとコラゲナーゼを混ぜないでください。
4. 8mgのコラゲラーゼCLSI( 材料表を参照)をプレチル15 mL遠心チューブに計量し、使用するまで氷の上に保存します。これは、1つのサンプルを処理するためのものです。それに応じて量をスケールアップします。プロテイナーゼとコラゲナーゼを混ぜないでください。
   注意:フェイスマスクを着用するか、ヒュームフードの下で働き、酵素粉末の吸入を避けてください。
   注:酵素活性は、異なるロットで異なる場合があります。したがって、最適濃度は異なる場合があり、新たに購入した各酵素¹⁶で決定する必要があります。

2. 心筋組織の保管と輸送

1. 冷却された4°C切断溶液でヒト心臓サンプルを貯蔵・輸送する(表1)。
2. さらに組織処理やビブラートメのスライスに同じ溶液を使用してください。
   注:生検と外科心臓サンプルは、4°Cで切断溶液にすぐに移管され、このプロトコルの適用前に最大36時間4°Cで保存または輸送することができます。

3. 組織の加工とスライス

注:組織スライスのプロトコルは、フィッシャーら^15.

1. 組織ブロックのトリミング
   注意:ヒト心臓組織は感染する可能性がある。常に保護摩耗を使用し、あなたの機関の安全規則に従ってください。使用済みブレードを注意深く取り扱い、安全容器に捨てます。
   1. 20 mLの冷たい切断液を充填した100mmの組織培養皿に試料を入れ、冷却された4°Cプレートに保管します。
   2. 過剰な線維組織と外心脂肪をメスで除去します。経壁標本の場合は、内心の近くの柱状および組織層を除去する。
      注:線維組織は硬く、白く見えます。脂肪は通常柔らかく、黄色に白く表示されます。放射性組織層と心筋組織層は、外心層の心筋と比較して、緩い組織組成および非整列繊維配向から同定することができる
   3. 最適なビブラートメ加工のために、より大きな組織標本からメスで約8 mm x 8 mm x 8 mm の長方形の組織ブロックを切断します。より小さな生検のためにこのステップをスキップし、アガロース埋め込みに移動します。
2. 低融点アガロースへの心臓組織の埋め込み
   1. ガラスビーカーで10mLの切断液で400mgの低融点アガロースを沸騰させる。
      注意:火傷を避けるために手袋と安全メガネを着用してください。熱保護摩耗だけで熱いガラス製品を扱う。
   2. 熱い、溶解したアガロースゲルで10 mLの注射器を充填する。注射器を密封し、アガロースを37°Cの水浴で少なくとも15分間平衡させます。
   3. 鉗子を使用して、トリミングされた心臓標本または生検を、心外膜を下に向けた清潔な35mm組織培養皿に入れ、滅菌綿棒で余分な液体を取り除きます。
   4. 平衡したアガロース(ステップ3.2.2)を、シリンジを空にして組織の上に注ぎます。アガロースを注ぎながら鉗子で動きに対して組織を固定します。組織がアガロースに完全に浸かっていることを確認してください。
   5. すぐに皿を氷の上に置き、アガロースを10分間固めます。
3. 心筋をスライスする
   1. ビブラートメのブレードホルダーに新しいカミソリの刃を取り付け、可能であればブレードのz偏向を調整してビブラートメをキャリブレーションします。
      注:このプロトコルは、赤外線アシストキャリブレーションデバイスを備えたビブラートメを使用して、最小のz偏向(測定された偏向<0.1 μm)で水平位置にブレードを整列させます。
   2. メスを使用して、ビブラートメの標本ホルダーに合ったアガロース組織ブロックを切除します。安定性を確保するために、組織がまだ十分にアガロース(アガロースマージン≥ 8 mm)に浸漬されていることを確認してください。
   3. シアノアクリル酸接着剤と穏やかな圧力の薄い層で標本ホルダーにアガロースブロックを固定します。
   4. 組織を持つ標本ホルダーをビブラートメ浴に入れる。切断液で浴を充填し、ビブラートメの外側冷却タンクに充填された砕いた氷で加工全体を通して4〜6°Cに保ちます。
   5. 300 μm 厚いスライスを生成し、速度は≤0.1 mm/s、振動周波数は 80 Hz、横振幅は 1.5 mm、ブレード角度は 15°です。スライスを扱うときは、組織自体の代わりにアガロースを保持し、組織の損傷を避けます。スライスは、必要に応じて最大2時間4°Cで切削液に保管してください。
      注:心筋細胞は、心外膜に平行に配向されています。したがって、過度の筋細胞損傷を避けるために、外心に平行に切断することが重要である。分離には均一な厚さのスライスのみを使用する必要がありますので、最初の1〜3スライスを破棄することをお勧めします。しかし、小さな組織生検の場合は、最初のスライスのみを廃棄します。
   6. 40-100xの倍率の標準的な軽い顕微鏡の下で心筋細胞の位置合わせを点検しなさい。

4. 組織消化

1. ラボシェーカーにヒートプレートを置き、37°Cに温めます。 ラボシェーカーを65 rpmで起動します。
2. プロテイナーゼ(ステップ1.3で調製)を溶液1(ステップ1.1および1.2)の2mLに溶解し、使用するまで37°Cでインキュベートする。プロテイナーゼとコラゲナーゼを混ぜないでください。
3. 2 mLの溶液1(ステップ1.1および1.2)にコラゲターゼ(ステップ1.4で調製)を溶解し、使用するまで37°Cでインキュベートする。プロテイナーゼとコラゲナーゼを混ぜないでください。
   注意:溶存酵素は皮膚や目の怪我を引き起こす可能性があるため、保護眼鏡と手袋を着用してください。
4. クロリドカルシウム_(CaCl2)をコラゲナーゼ含有溶液(ステップ4.3で調製)に加え、5μMの最終濃度にします。
5. 鉗子を使用して、ビブラートメ浴から5 mLのプレチル切断溶液(ステップ1.1および1.2)で満たされたきれいな60mmの組織培養皿に組織スライスを移し、氷の上に置きます。
6. 慎重にブレードまたは鉗子で心筋組織からアガロースを除去します。
   注意:心筋細胞に損傷を与える可能性があるため、心筋切れに余分な張力やせん断応力を避けてください。
7. 最初の洗浄を行うために、ヒートプレートに清潔な35mmティッシュ培養皿を置き、2mLのプリウォーム(37°C)溶液1で満たします。1~2本の心筋スライスを鉗子で準備した皿に移します。溶液を1 mLピペットで吸引し、洗浄工程2xを実行して切削液の残骸を除去する。
   注:心臓スライスを吸引しないでください。溶液とスライスは、攪拌熱板上の35°Cの一定温度に留まる必要があります。必要に応じて、ヒートプレートの温度を調整します。
8. 溶液1を皿から取り出し、2mLのプロテイナーゼ溶液を加える(ステップ4.2)。ヒートプレート上で65rpmで12分間インキュベートする。
9. 2mLのプレウォーム溶液1(37°C)で2倍洗浄します。
10. 皿から溶液1を取り出し、コラゲナーゼ溶液2mLを加える(ステップ4.3および4.4)。ヒートプレート上で少なくとも30分間、65rpmでインキュベートする。
11. 軽顕微鏡で皿を置くことによって30、35、40分等の自由な個々の筋細胞を点検しなさい。ソリューションの大幅な冷却を避けるために迅速に作業します。
    注:必要な消化時間は、組織の体質や線維化の程度によって異なる場合があります。組織が目に見えて柔らかくなり、穏やかに引っ張られたときに容易に解約するとすぐに、最適な消化時間に達した。十分な組織が利用可能な場合は、いくつかのスライスを様々な消化時間と並行して消化することができます。
12. 組織が消化され、個々の筋細胞が見える(ステップ4.11)場合は、2mLのプリウォーム溶液2(37°C)で2倍洗浄し、2mLで再び充填します。

5. 組織解離

1. 慎重に繊維を引き離すことによって鉗子で消化された組織スライスを解離します。
2. 1回使用パスツールピペット(開口径>2mm)でピペットを数回慎重に使用してください。
   注:鉗子およびピペットの使用は、機械的ストレスを誘発し、心筋細胞損傷を引き起こす可能性があります。しかし、細胞の分離には重要なステップです。細かい鉗子を使用して細胞の損傷を最小限に抑え、スライスを慎重に小さく切り分けます。
3. 軽顕微鏡下で解放された棒状心筋細胞がないか確認します。

生理的カルシウム濃度の再導入

1. 熱板上で35°Cで撹拌しながら、カルシウム濃度を5μMから1.5mMにゆっくりと増加させます。10 mM および 100 mM CaCl₂ ストックソリューションを使用してください。推奨ステップ:20、40、80、100、150、200、400、800、1,200、1,500 μM.各ステップ間の5分のインキュベーション間隔で増加したカルシウムレベルに細胞を適応させます。
2. 鉗子で未消化のティッシュチャンクを注意深く取り除くか、カルシウム増加の終わりに180 μmの細孔サイズのナイロンメッシュを通して細胞懸濁液をろ過する。

7. 機械的アンカップリング剤の除去

1. 撹拌を停止し、1,000 μL ピペットで溶液の1/3(約700 μL)を上からゆっくりと取り除きます。心筋細胞の吸引を避けてください。
   注:未消化の組織が除去された場合、心筋細胞は、無細胞溶液の吸引を容易にする皿の中心に蓄積します。そうでなければ、細胞溶液を15mL遠心管に移し、細胞が35°Cで10分間沈降させ、700μLの上清を吸引し、廃棄し、細胞を再懸濁し、35mm組織培養皿に戻し、ステップ7.2に進みます。
2. 700 μLの溶液3を細胞に加え、ヒートプレート上で撹拌を再開し、10分間インキュベートする。
3. 手順 7.1 と 7.2 を繰り返します。
4. 溶液を15 mL遠心分離管に移し、心筋細胞を最低10分間、室温で最大30分間沈み、50 x g で1分間回転させます。上清を完全に取り除き、変更されたTyrodeの溶液または所望の実験バッファーで再中断します。
   注意:心筋細胞は、使用前に37°Cおよび_5%CO2で数時間、変性タイローデの溶液(表1)に保存することができます。
5. 40倍と200倍の倍率で標準的な光学顕微鏡で細胞の品質を確認します。
   注:心筋細胞の約30〜50%は、膜ブレブなしで棒状、滑らかで、明確なクロスストリオンを表示する必要があります。生存可能な細胞の5〜10%だけが自発的な収縮を示すべきである。

結果

分離効率を検証するために、ラット心筋と共にプロトコルを使用し、その結果生じる生存可能な筋細胞の数を冠血球灌流による単離および小組織チャンクからの分離(チャンク分離、 図 2).同じ心臓から組織スライスからのチャンク分離と分離を行った。しかし、冠状灌流による単離のために、心臓全体が使用された。冠状灌流は主に棒状および交差する心筋細胞を生み?...

ディスカッション

生きている心筋細胞の分離は40年以上前に確立され、心臓研究における多くの実験的アプローチの前提条件であるが、予測不可能な結果を伴う困難な技術のままである。酵素溶液を用いた冠状動脈の灌流による心筋細胞の単離は、一般的に小動物の心臓に使用され、多数の生存細胞を生み出す。しかし、これには比較的複雑なシステムと専門知識が必要です。さらに、ほとんどのヒト組織サ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
2,3-butanedionemonoxime	Carl Roth	3494.1	Purity>99%
Bovine serum albumin	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
Creatine monohydrate	Alfa Aesar	B250009
Glucose	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3
KCl	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
L-glutamic acid	Fluka Biochemica	49450
Low melting-point agarose	Carl Roth	6351.5
MgCl2 x 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Taurine	Sigma Aldrich	T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher Scientific	D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I	Worthington	LS004196	Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II	Worthington	LS004176	Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg)
Protease XIV	Sigma Aldrich	P8038	Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV	Sigma Aldrich	P5147	Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa)	BD Bioscience	649225
Centrifuge tube, 15 mL	Corning	430790
Centrifuge tube, 50 mL	Corning	430829
Compact shaker	Edmund Bühler	KS-15 B control	Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes	Carl Roth	EA65.1	For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps	FST	11271-30
Heatblock	VWR	BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm	Merck	NY8H04700
TC Dish 100, Standard	Sarstedt	83.3902
TC Dish 35, Standard	Sarstedt	83.3900
TC Dish 60, Standard	Sarstedt	83.3901
Vibratome (VT1200S)	Leica	1491200S001	Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection