תפוקה גבוהה מקבילה מולקולה קינטית Assay עבור מחשוף DNA ספציפי לאתר

Summary

שיטה מקבילה מאוד למדידת המחשוף הספציפי לאתר של ה-DNA ברמת מולקולה אחת מתוארת. פרוטוקול זה מדגים את הטכניקה באמצעות ההגבלה אנדונוקלאז Nde. ניתן לשנות את השיטה בקלות כדי ללמוד כל תהליך שתוצאות מחשוף DNA ספציפי לאתר.

Abstract

מחשוף DNA ספציפי לאתר (SSDC) הוא צעד מפתח בתהליכים סלולריים רבים, והוא חיוני לעריכת גנים. עבודה זו מתארת תסה קינטית המסוגלת למדוד SSDC במולקולות DNA יחיד רבות בו זמנית. DNAs של הצוללת עם חרוזים, שכל אחד מהם מכיל עותק יחיד של רצף היעד, מוכנים בערוץ זרימה מיקרו-נוזל. מגנט חיצוני מפעיל כוח חלש על החרוזים הפרמגנטיים. ניתן לפקח על שלמותם של עד 1,000 DNAs בודדים על-ידי הדמיית המיקרו-חרוזים תחת הדמיית Darkfield באמצעות מטרה רחבת-שדה, הגדלה נמוכה. הזרקת אנדונוקליז הגבלה, נדול, יוזמת את תגובת המחשוף. מיקרוסקופ וידאו משמש כדי להקליט את הרגע המדויק של כל מחשוף DNA על ידי התבוננות במסגרת שבה החרוז המשויך נע למעלה והחוצה של מישור המוקד של המטרה. ספירת חרוזים פריים אחר תמונה מכמתת את התגובה, והתאים מעריכי קובע את קצב התגובה. שיטה זו מאפשרת איסוף של נתונים כמותיים ומשמעותיים סטטיסטית על מולקולה אחת תגובות SSDC בניסוי יחיד.

Introduction

מחשוף DNA ספציפי לאתר (SSDC) הוא צעד מפתח בעסקאות גנומיות רבות. לדוגמה, שינוי הגבלה חיידקית (RM)¹ ומערכות CRISPR^{2 להגן} על תאים מפני התקפה על ידי phages ופלסמידים על ידי זיהוי ומחשוף של DNA זר ברפים ספציפיים. בסוג II RM, אנדונוקלאס הגבלת (REs) לזהות רצפים קצרים 4-8 בסיס זוג בסיס (bp) באמצעות אינטראקציות חומצה גרעין^{חלבון 3}. אנדונוקלאסים המשויכים CRISPR, כגון Cas9, לאגד לאתרים באמצעות הכלאה של אתר היעד עם crRNAs מאוגדים endonucleases⁴. יצירת הפסקות תקועות כפולות ספציפיות לאתר (DSBs) הן גם הצעד הראשון באירועי שילוב DNA רבים⁵. לדוגמה, המגוון של אזורי איגוד אנטיגן שנוצרו על-ידי V(D)J שילוב דורש זיהוי ומחשוף של אתרי יעד ספציפיים⁶. כמה transposons ידועים למקד רצפי DNA ספציפיים, כמו^{גם 7}. באופן לא מפתיע, גרעין ספציפי לאתר רבים המעורבים בתהליכים אלה, כגון Cas9, הם מרכיב מרכזי בטכנולוגיות עריכת^{גנים 8}. בנוסף, אנדונוקליאות חדשניות ספציפיות לאתר (כלומר, גרעין אצבע^{אבץ 9} ו-TALENS¹⁰⁾הונדסו גם הן לעריכת גנומים.

שיטות רבות נוהל כדי למדוד את הקינטיים של מחשוף ספציפי לאתר של חומצות גרעין. אלה כוללים ניתוח ג'ל,^{פלואורסצנס 11,12}, ושיטות מבוססות רצף¹³. התקדמות משמעותית הושגה עם רצועה של microbeads, המאפשר DSBs במולקולות יחיד של ה-DNA להתגלות על ידי התנועה של חרוז לאחר הפרדת גדיל. בשיטות אלה, סוגים שונים של כוחות מועסקים כדי להבטיח את הפרדת הגדיל ואת התנועה של החרוז לאחר המחשוף. במקרה אחד, מלכודות אופטיות שימשו כדי למדוד מחשוף של ה-DNA על ידי EcoRV¹⁴. בניסויים אלה, חיפוש היעד הוא מטרת החקירה, עם תנאים ממוטבים כך שאיגוד ספציפי לאתר הוא השלב המגביל את הקצב. חסרון אחד של מלכודות אופטיות הוא שרק DNA אחד ניתן לצפות בכל פעם. בנוסף, יש להחיל כוח משיכה גדול תקופתי כדי לבדוק את הפרדת הגדיל.

טכניקה נוספת משתמשת בשילוב של זרימה וכוחות מגנטיים חלשים כדי למשוך את החרוז באופן רציף¹⁵. בדרך זו, מחשוף מוגבל דיפוזיה על ידי NdeI נמדד. השיטה המועסקת מאפשרת מדידה בו זמנית של כמה מאות DNAs בבת אחת, המאפשר משמעות סטטיסטית להיות מושגת בניסוי אחד. ניסויים המבוססים על פינצטה מגנטית שימשו גם כן. במחקר אחד כזה, integrase רטרוויראלי נחקר על ידי הכללת DSB בהחדרת אוליגונוקלאוטיד¹⁶. שילוב מוצלח הביא להתאגדות של DSB ב-DNA קשור ואובדן של החרוז המצורף. במחקר דומה של EcoPI הגבלת אנדונוקליאז סוג III תלוי ATP, עשרות DNAs נצפו בניסוי יחיד¹⁷. פינצטה מגנטית להחזיק את היתרון כי מתח, כמו גם לולאות DNA, ניתן לשלוט ולפקח במהלך התגובה.

מוצג כאן היא שיטת מולקולה אחת מקבילה מאוד למדידת קינטיקה SSDC, אשר מנצל את השיפורים האחרונים ברצועה בקנה מידה גדול של DNAs. שיטה זו היא שיפור והרחבה של שיטות קודמות המשמשות למדד שכפול DNA¹⁸, אורך קווי מתאר של DNA¹⁹, ומחשוף על ידי REs¹⁵. בטכניקה זו, DNAs ליניארי המכיל עותק יחיד של רצף הזיהוי מוכנים עם ביוטין בקצה אחד digoxigenin בצד השני. הביוטין קושר סטרפטאבידין, המחובר באופן קוולנטי למיקרו-חרוז פארמגנטי. תסביכות חרוזי ה-DNA מוזרקים לערוץ מיקרו-נוזלים שתפקד עם שברי FAB אנטי-דיגוקסיג'ין. ה-DNA לאחר מכן קשור אל פני השטח נקודות מצורף באמצעות איגוד של digoxigenin לשבבי FAB adsorbed. כוחות מגנטיים חלשים המיושם עם מגנט קבוע לשמור על החרוז מדבק באופן לא ספציפי על פני השטח. ניתן להזריק דגימות במהירות (<30 s) לתוך ערוץ הזרימה כדי להפעיל את תגובת המחשוף. הזרימה מבוטלת במהלך איסוף נתונים. כאשר כל דנ"א מחשוף, ניתן לקבוע את זמן המחשוף המדויק על ידי הקלטת המסגרת שבה החרוז נע למעלה והחוצה מהתוכנית המוקדית של המטרה, ובכך להיעלם מרמת הקלטה. ניתן להשתמש בספירה של מסגרת אחר מסגרת של חרוזים שנותרו כדי לכמת את התקדמות התגובה.

מוצג להלן הפרוטוקול המלא, כמו גם נתונים לדוגמה שנאספו באמצעות NdeI. כדוגמה לאופן שבו ניתן ליישם את הטכניקה, שיעורי מחשוף עבור מגוון ריכוזי חלבון נמדדים בשני ריכוזים שונים של מגנזיום, cofactor מתכת חיוני. למרות יישום זה של הפרוטוקול משתמש NdeI, השיטה יכולה להיות מותאמת לשימוש עם כל גרעין ספציפי לאתר על ידי שינוי עיצוב ה-DNA של הצוללת.

Protocol

1. הפיכת תא הזרימה

1. שטיפת כיסויים
   1. מקום מכסה צנצנות כתמים sonicate עם אתנול (EtOH), אז עם 1 M KOH (עבור 30 דקות כל אחד). כדי למנוע KOH משקעים ETOH, לשטוף ביסודיות עם ddH₂O בין שטיפה.
   2. חזור על EtOH ועל שלבי השטיפה KOH 1x עבור מספר כולל של ארבע שטיפה (שני EtOH ושני KOH). לאחסן כיסויים נקיים בdH₂O בצנצנות כתמים.
2. חותכים את צינורות הטעינה והיציאה (באורך 8 ס"מ) באמצעות סכין גילוח נקי והכנסו לחורים בשקופית זכוכית נקייה. השתמש PE-20 עבור פנימה ו PE-60 לשקע. אפוקסי למשך 5 דקות כדי לאבטח את הצינורות ולקצץ את כל הצינורות העודפים.
   הערה: שקופיות זכוכית מודדות 2'' x 3'' x 1 מ"מ. חורים נקדחו בזוגות 15 מ"מ זה מזה. כל זוג יוצר כל קצה של ערוץ יחיד. הצינורות עם המזהה הקטן יותר משמשים להיכנס, כמו זה מפחית את נפח מת במעלה הזרם ולכן את זמן ערבוב הנדרש(איור 1).
3. מסדרים בשורה ומחילים סרט דבק דו-צדדי חתוכים מראש עם תבנית ערוץ לגזור מעל חורים על מגלשת הזכוכית. החלק עם מלקות פלסטיק כדי להשיג חותם טוב.
   הערה: הקלטת הדו-צדדית המשמשת בניסוי זה היא בעובי של 120 μm, והערוצים ברוחב של 2 מ"מ ובאורך 15 מ"מ. ערוצים נחתכים באמצעות מדפסת סכין(טבלת חומרים). ניתן להתאים עד ארבעה ערוצים על כיסוי אחד. ראה איור 1 לקבלת תמונה של תא הזרימה.
4. לאחר קילוף הגיבוי, למרוח כיסוי נקי (מיובש באוויר דחוס) על הסרט ולהחליק שוב עם מלקות פלסטיק עבור חותם טוב.
5. כדי לאטום את תא הזרימה .ולתת לו לרפא

2. הכנת דנ"א מסומן לרצועה

1. בצינור PCR, להכין 50 μL של תמהיל תגובת PCR המכיל 0.02 U /μL פולימראז DNA נאמנות גבוהה, 200 μM dNTPs, 0.5 μM פריימר קדימה, 0.5 μM פריימר הפוך, ו 250 ng של M13mp18 וקטור DNA.
   הערה: כאן, פריימר קדימה (ביוטין-CCAACTTATACGCGCCTTGC) פריימר הפוך (digoxigenin-TGACCATTAGATACATTTCGC) נבחרו להגביר אזור כ 1,000 bp ארוך, המשתרע מעמדות 6338 כדי 107 בגנום המעגלי של ה-DNA M13mp18. יש אתר אחד באמצע האזור ההתרופס. פריימר קדמי הוא 5ʹ עם digoxigenin, אשר קושר את אנטי-digoxigenin על כיסוי. פריימר הפוך הוא 5ʹ מתויג עם ביוטין, אשר קושר את החרוזים מצופה סטרפטוודין.
2. הכנס את צינור ה- PCR לתרמוצ'יקלר ובצע את המחזור כפי שהוצג בטבלה 1.
3. נקה את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת ניקוי PCR בהתאם לפרוטוקול היצרן.
   הערה: באמצעות הערכה שצוינה בטבלת החומרים , תפוקתה-DNA האופיינית היא ~ 2 μg.

3. תחרש דנ"א וחרוזים

1. להכין 10 מ"ל של מאגר A (1 M Tris-HCl [pH = 7.5], 50 מ"מ NaCl, 2 מ"מ MgCl₂, 1 מ"ג / מ"ל β-Casein, 1 מ"ג / מ"ל F-127 פלורוני). דגה בשואב אבק לפחות שעה אחת.
2. כדי לתפקד תא זרימה, להזריק 25 μL של שברי FAB אנטי-digoxigenin (20 μg / מ"ל) ב PBS לתוך ערוץ הזרימה. השתמש בטיפים לטעינת ג'ל כדי להתאים לצינורות PE-60. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) במשך 30 דקות.
3. לאחר הדגירה, לשטוף את הערוץ על ידי משיכת 0.5 מ"ל של מאגר A דרך הערוץ באמצעות מזרק. תקחותי לא להכניס אוויר לערוץ.
4. לאחר פונקציונליזציה, הר את תא הזרימה על מיקרוסקופ הפוך. לחבר את צינור שקע למשאבת מזרק ולשים את צינור מפרצון לתוך צינור microcentrifuge המכיל חוצץ A.
5. משוך באופן ידני לפחות 0.5 מ"ל של מאגר A כדי לשטוף את המערכת ולהרים את המשאבה. תנו למשאבה לפעול ב-10 μL/min למשך 5 דקות לפחות כדי לצייד את המערכת.
6. כדי להכין את החרוזים(טבלת חומרים),מערבולת בקבוק המניות של חרוזים ופיפטה 1.6 μL של 10 מ"ג / מ"ל חרוזי מניות לתוך 50 μL של מאגר A, אז מערבולת.
7. באמצעות מפריד מגנטי, פיפטה החוצה המאגר וssspend ב 50 μL של מאגר A, ולאחר מכן מערבולת.
8. חזור על שלב 3.7 2x עבור סך של שלוש שטיפה. לשטיפה האחרונה, resuspend ב 100 μL של מאגר A ומערבולת כדי להשיג ריכוז סופי של 160 μg / מ"ל.
9. כדי לתמצת את ה-DNA והחרוזים, תחילה להכין 480 μL של 0.5 pM מסומן כמצע DNA במאגר A. לאחר מכן, פיפטה ב 20 μL של 160 μg / מ"ל השעיית חרוז, הקפד למערבולת החרוזים לפני pipetting. מניחים על מסובב למשך 3 דקות.
10. לאחר 3 דקות, מיד לטעון לתוך ערוץ בקצב זרימה של 10 μL / דקה עבור ~ 15 דקות או עד מספיק חרוז קשור נצפתה.
    הערה: חרוזים לא צריך להיות כל כך צפוף ארוז שהם אינטראקציה אחד עם השני על פני השטח (ראה סעיף דיון).
11. כדי לשטוף את הערוץ של כל החרוזים חינם, לעבור את צינור החירום לצינור טרי של חוצץ A ולזרום ב 50 μL / דקה לפחות 10 דקות או עד אין חרוזים רופפים נצפו.

4. איסוף וניתוח נתונים

1. כדי להתכונן לאיסוף נתונים, הכן צינור הכנסה לתוך צינור microcentrifuge המכיל לפחות 100 μL של NdeI (0.25-4.00 U/mL) במאגר א' הנמך את המגנט הקבוע מעל ערוץ הזרימה, ומקם את מקור האור מחוץ לציר עבור הדמיה darkfield.
   הערה: שני מגנטים נדירים טבעתי כדור הארץ, אפוקסיחד, מוחזקים 8 מ"מ מעל פני השטח הפעיל של ערוץ הזרימה באמצעות הודעה אופטית cantilevered במהלך איסוף נתונים. מנורת צוואר אווז משמשת לקורס האור מחוץ לציר.
2. השתמש במיקרוסקופ מסחרי, מצלמת וידאו ותוכונת איסוף נתונים(טבלת חומרים). בתוכנה, לחץ על הכרטיסיה "חשיפה" והגדר "זמן חשיפה" ל- 10 ms. לחץ על "Timelapse" tab והגדר "ספירתתמונות " ל- 600, "משך" עד 20 דקות ו "מרווחזמן " ל- 2 שניות. לחץ על "הפעל" כדי להתחיל באיסוף נתונים.
3. על משאבת מזרק, להגדיר את קצב הזרימה ל 150 μL / דקה ונפח הזרקה 80 μL. לחץ"לרוץ " ב 1 דקות לתוך איסוף נתונים. לאחר ההזרקה, כבה את המשאבה וסגור את השסתום כדי למנוע זרימה במהלך איסוף הנתונים.
4. לאחר איסוף הנתונים, פתח את תוכנת ניתוח התמונה (Table of Materials). תחת הכרטיסיה "קובץ", בחר "ייבוא" | "רצף תמונה". אתר את קבצי התמונה בתפריט המוקפץ ולחץ על "פתח".
5. הגדר את הסף על-ידי בחירה באפשרות "התאם את האחיזה"תחת התפריט הנפתח " תמונה ". השתמש בשורת המחוון כדי להגדיר את ערך הסף כדי לזהות נקודות בהירות המתאימות לחרוזים בתמונה.
6. ספור את הנקודות הבהירות בכל מסגרת על-ידילחיצה על" נתח חלקיקים"בתפריט הנפתח " נתח". לחץOKעל " אישור ", ולאחר מכןבחר" כן " כדי לעבד את כל התמונות. שמור את קובץ התוצאות.
   הערה: אפשרות זו תשמור קובץ נתונים המכיל את מספר החרוזים בכל מסגרת וידאו מוקלטת.
7. פתח את תוכנת ניתוח נתונים (טבלת חומרים) וייבוא קובץ התוצאות על-ידי לחיצה על "ייבואמקובץטקסט " בתפריט הנפתח " קובץ ". התווה את נתוני ספירת החרוזים לעומת הזמן.
8. התאם את מספר החרוזים לעומת הזמן על-ידי לחיצה על "התאמהעקומה"בתפריט הנפתח " נתח ". בחר את המשוואה "מעריך טבעי" ולחץ על "נסה להתאים" | "בסדר" .כן,בסדר.
   הערה: יש לכלול רק את הנתונים שנרשמו לאחר הזרקת הדגימה באזור ההתאמה. פרמטר ההתאמה במעריך של פונקציית ההתאמה יהיה קצב המחשוף.

תוצאות

באמצעות טכניקה זו, שיעורי SSDC של NdeI נמדדו עבור מגוון של ריכוזי חלבון (0.25-4.00 U/mL) בשני ריכוזים שונים של מגנזיום (2 mM ו 4 mM). כל אחד מהתנאים הללו שוכפל לפחות פעמיים, עם כמה מאות עד 1,000 DNAs קשורים לכל ניסוי. איור 2 מתאר את העיצוב הניסיוני. איור 3 מציג דוגמאות של פרטי איסוף...

Discussion

הפרוטוקול יכול לשמש כדי למדוד את הקינטיים של כל מערכת SSDC, בתנאי שהפרדת הגדיל נצפתה במהלך הניסוי. זיהוי המחשוף מושפע מהתבוננות בניתוק החרוז הרצועה ולכן מסמן את מידת הפרדת הגדילים. כל השלבים הקודמים מתרחשים לפני זיהוי המחשוף; לכן, רק זמן המעבר הכולל נרשם.

כיסוי תא הזרימה הוא פ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 minute Epoxy	Devcon	14250
anti-digoxigenin FAB fragments	Roche Diagnostics	11214667001
camera and software	Jenoptik	GRYPHAX SUBRA
data analysis software	Vernier Inc.	LP
double sided tape	Grace Biolabs	SA-S-1L
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline	Corning	21-031-CV
ethanol 95%	VWR	89370-082
forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC	Integrated DNA Technologies	n/a
image analysis software	National Institutes of Health	ImageJ
inverted microscope	Nikon	TE2000
knife printer	Silhouette
M13mp18 DNA	New England Biolabs	N4040S
MyOne streptavidin beads	Thermo Fisher Scientific	65601
NdeI enzyme	New England Biolabs	R0111S
PCR cleanup kit	Qiagen	28104
pluronic F-127	Anatrace	P305
polyethylene tubing PE-20	BD Intramedic	427406
polyethylene tubing PE-60	BD Intramedic	427416
Q5 Mastermix	New England Biolabs	M0492S
rare earth magnet 0.5" OD 0.25" ID	National Imports	NSN0814
rare earth magnet 0.75" OD 0.5" ID	National Imports	NSN0615
reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC	Integrated DNA Technologies	n/a
syringe pump	Kent Scientific	Genie Plus
β-Casein from bovine Milk	Sigma-Aldrich	C6905