Ensayo cinético de molécula única de alto rendimiento paralelo para la escoja de ADN específica del sitio

Resumen

Se describe un método altamente paralelo para medir el escote específico del sitio del ADN a nivel de molécula única. Este protocolo muestra la técnica mediante la restricción endonucleasa NdeI. El método se puede modificar fácilmente para estudiar cualquier proceso que resulte en una escisión de ADN específica del sitio.

Resumen

La escisión de ADN específica del sitio (SSDC) es un paso clave en muchos procesos celulares, y es crucial para la edición de genes. Este trabajo describe un ensayo cinético capaz de medir SSDC en muchas moléculas de ADN individuales simultáneamente. Los DNA de sustrato amarreado, cada uno de los que contienen una sola copia de la secuencia de destino, se preparan en un canal de flujo microfluídico. Un imán externo aplica una fuerza débil a las perlas paramagnéticas. La integridad de hasta 1.000 DNAs individuales se puede monitorear visualizando las micropersas bajo imágenes de campo oscuro utilizando un objetivo de campo amplio y bajo aumento. La inyección de una restricción endonucleasa, NdeI, inicia la reacción de escote. La microscopía de vídeo se utiliza para registrar el momento exacto de cada escisión de ADN observando el marco en el que el cordón asociado se mueve hacia arriba y fuera del plano focal del objetivo. El recuento de cuentas fotograma a fotograma cuantifica la reacción y un ajuste exponencial determina la velocidad de reacción. Este método permite la recopilación de datos cuantitativos y estadísticamente significativos sobre reacciones SSDC de molécula única en un solo experimento.

Introducción

La escisión de ADN específica del sitio (SSDC) es un paso clave en muchas transacciones genómicas. Por ejemplo, los sistemas de modificación de restricciones bacterianas (RM)¹ y CRISPR² protegen las células del ataque por fagos y plásmidos reconociendo y cortando ADN extraño en secuencias específicas. En el tipo II RM, las endonucleaciones de restricción (RE) reconocen secuencias cortas de 4-8 pares de bases (bp) mediante interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos³. Las endonucleasas asociadas a CRISPR, como Cas9, se unen a sitios a través de la hibridación del sitio de destino con crRNAs enlazados a las endonucleasas^4. La creación de roturas de doble cadena (DSB) específicas del sitio también son el primer paso en muchos eventos de recombinación de ADN⁵. Por ejemplo, la diversidad de regiones de enlace de antígenos creadas por la recombinación V(D)J requiere el reconocimiento y la escisión de sitios de destino específicos^6. Se sabe que algunos transposones apuntan a secuencias de ADN específicas, así como⁷. No es de extrañar que muchas nuclelas específicas del sitio implicadas en estos procesos, como Cas9, sean un componente clave de las tecnologías de edición génica⁸. Además, también se han diseñado nuevas endonucleasas específicas del sitio (es decir, nucleasas de dedos de zinc⁹ y TALENS¹⁰⁾para editar genomas.

Se han empleado muchos métodos para medir la cinética de la escisión específica del sitio de los ácidos nucleicos. Estos incluyen análisis de gel, fluorescencia^11,12, y métodos basados en la^{secuenciación 13}. Se logró un avance importante con el anclaje de microperlas, lo que permite que los DSB en moléculas individuales de ADN sean detectados por el movimiento de un cordón después de la separación de la hebra. En estos métodos, se emplean diferentes tipos de fuerzas para asegurar la separación de las hebras y el movimiento del cordón después de la escote. En un caso, las trampas ópticas se han utilizado para medir la escisión del ADN mediante EcoRV¹⁴. En estos experimentos, la búsqueda de destino es el objetivo de la investigación, con condiciones optimizadas para que el enlace específico del sitio sea el paso de limitación de velocidad. Un inconveniente de las trampas ópticas es que sólo se puede observar un solo ADN a la vez. Además, se debe aplicar una fuerza de tracción grande periódica para probar la separación de la hebra.

Otra técnica utiliza una combinación de flujo y fuerzas magnéticas débiles para tirar del cordón de una manera continua¹⁵. De esta manera, se mide la difusión limitada de escote por NdeI. El método empleado permite la medición simultánea de varios cientos de DNA a la vez, lo que permite alcanzar la significancia estadística en un solo experimento. También se han utilizado experimentos basados en pinzas magnéticas. En uno de esos estudios, se estudió una integrasa retroviral mediante la inclusión de un OSD en el oligonucleótido de inserción¹⁶. La integración exitosa dio lugar a la incorporación del OSD en el ADN atado y la pérdida del cordón adjunto. En un estudio similar de la restricción de ATP tipo III endonucleasa EcoPI, se observaron decenas de DNA en un solo experimento¹⁷. Las pinzas magnéticas tienen la ventaja de que la tensión, así como el bucle de ADN, se pueden controlar y monitorear durante la reacción.

Aquí se presenta un método de molécula única altamente paralelo para medir la cinética SSDC, que aprovecha las mejoras recientes en el anclaje a gran escala de DNAs. Este método es una mejora y extensión de los métodos anteriores utilizados para medir la replicación del ADN^18,la longitud del contorno del ADN^19,y la escisión por REs¹⁵. En esta técnica, los DNA lineales que contienen una sola copia de la secuencia de reconocimiento se preparan con biotina en un extremo y digoxigenina en el otro. La biotina se une a la estreptavidina, que se une covalentemente a un microbead paramagnético. Los complejos de las cuentas de ADN se inyectan en un canal microfluídico que ha sido funcionalizado con fragmentos de la FAB anti-digoxigenina. A continuación, el ADN se une a los puntos de unión superficial mediante la unión de digoxigenina a los fragmentos del FAB adsorbidos. Las fuerzas magnéticas débiles aplicadas con un imán permanente impiden que el cordón se pegue de forma no específica a la superficie. Las muestras se pueden inyectar rápidamente (<30 s) en el canal de flujo para activar la reacción de escote. El flujo se desactiva durante la recopilación de datos. A medida que se corta cada ADN, la hora exacta de la escisión se puede determinar mediante la grabación del marco en el que el cordón se mueve hacia arriba y fuera del plan focal del objetivo, desapareciendo así de la grabación de vídeo. Se puede utilizar un recuento fotograma por fotograma de las perlas restantes para cuantificar el progreso de la reacción.

A continuación se presenta el protocolo completo, así como los datos de ejemplo recopilados con NdeI. Como ejemplo de cómo se puede aplicar la técnica, las tasas de escote para una gama de concentraciones de proteínas se miden en dos concentraciones diferentes de magnesio, un cofactor de metal esencial. Aunque esta aplicación del protocolo utiliza NdeI, el método se puede adaptar para su uso con cualquier nucleasa específica del sitio variando el diseño del sustrato de ADN.

Protocolo

1. Hacer que la celda de flujo

1. Lavado de los cubreobjetos
   1. Coloque los cubreobjetos en frascos de tinción y sonicar con etanol (EtOH), luego con 1 M KOH (durante 30 minutos cada uno). Para evitar la precipitación de KOH en EtOH, enjuague bien con ddH₂O entre lavados.
   2. Repita el procedimiento tanto EtOH como los pasos de lavado de KOH 1x para un número total de cuatro lavados (dos EtOH y dos KOH). Almacene los cubreobjetos limpios en ddH₂O en frascos de tinción.
2. Corte los tubos de carga y salida (8 cm de largo) con una maquinilla de afeitar limpia e insértelos en agujeros en un portaobjetos de vidrio limpio. Utilice PE-20 para entrada y PE-60 para toma de corriente. Epoxi durante 5 minutos para asegurar el tubo y recortar cualquier exceso de tubería.
   NOTA: Las diapositivas de vidrio miden 2'' x 3'' x 1 mm. Los orificios se perforan en pares separados de 15 mm. Cada par forma cualquier extremo de un solo canal. El tubo con el ID más pequeño se utiliza para la entrada, ya que esto reduce el volumen muerto aguas arriba y, por lo tanto, el tiempo de mezcla requerido (Figura 1).
3. Alinee y aplique cinta precortado de doble cara con patrón de canal cortado sobre agujeros en la corredera de vidrio. Suaviza con fórceps de plástico para lograr un buen sellado.
   NOTA: La cinta de doble cara utilizada en este experimento es de 120 m de espesor, y los canales tienen 2 mm de ancho y 15 mm de largo. Los canales se cortan utilizando una impresorade cuchillos( Tabla de materiales ). Es posible caber hasta cuatro canales en un solo cubreobjetos. Vea el cuadro 1 para una imagen de la célula de flujo.
4. Después de despegar el respaldo, aplicar un cubreobjetos limpio (secado con aire comprimido) sobre la cinta y suavizar de nuevo con fórceps de plástico para un buen sello.
5. Epoxi el borde de la cubierta para sellar la célula de flujo y dejar que se cure.

2. Preparación del ADN etiquetado para el anclaje

1. En un tubo de PCR, prepare 50 ml de mezcla de reacción de PCR que contenga 0,02 U/L de ADN polimerasa de alta fidelidad, dNMP de 200 m, imprimación directa de 0,5 m, imprimación inversa de 0,5 m y 250 ng de ADN vectorial M13mp18.
   NOTA: Aquí, se eligieron la imprimación delantera (biotina-CCAACTTAATCGCCTTGC) y la imprimación inversa (digoxigenin-TGACCATTAGATACATTTCGC) para amplificar una región de aproximadamente 1.000 bp de largo, que abarca desde las posiciones 6338 a 107 en el genoma circular del ADN M13mp18. Hay un solo sitio NdeI en el centro de la región amplificada. La imprimación delantera está 5ʹ etiquetada con digoxigenina, que une la anti-digoxigenina en el cubreobjetos. La imprimación inversa se 5ʹ etiqueta con biotina, que une las cuentas recubiertas de estreptavidina.
2. Inserte el tubo PCR en el termociclador y siga el ciclo como se muestra en la Tabla 1.
3. Purifique el producto PCR con un kit de limpieza PCR siguiendo el protocolo del fabricante.
   NOTA: Utilizando el kit especificado en la Tabla de Materiales,el rendimiento típico del ADN es de 2 g.

3. Tethering de ADN y cuentas

1. Preparar 10 mL del tampón A (1 M Tris-HCl [pH a 7,5], 50 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 1 mg/ml β-Caseína, 1 mg/ml Pluronic F-127). Degas en un desecador de vacío durante al menos 1 h.
2. Para funcionalizar la célula de flujo, inyecte 25 l de fragmentos de FAB anti-digoxigenina (20 g/ml) en PBS en el canal de flujo. Use puntas de carga de gel para encajar en el tubo PE-60. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 30 min.
3. Después de la incubación, enjuague el canal tirando de 0,5 ml del tampón A a través del canal utilizando una jeringa. Tenga cuidado de no introducir aire en el canal.
4. Después de la funcionalización, monte la celda de flujo en un microscopio invertido. Conecte el tubo de salida a una bomba de jeringa y coloque el tubo de entrada en un tubo de microcentrífuga que contenga el tampón A.
5. Tire manualmente de al menos 0,5 ml del búfer A para vaciar el sistema y preparar la bomba. Deje que la bomba funcione a 10 l/min durante al menos 5 minutos para equilibrar el sistema.
6. Para preparar las perlas (Tabla de materiales), vórtice la botella de material de perlas y pipetas de 1,6 ml de las perlas de 10 mg/ml en 50 ml de tampón A, a continuación, vórtice.
7. Usando un separador magnético, pipetee el búfer y resuspendido en 50 ml del buffer A, luego vórtice.
8. Repita el paso 3.7 2x para un total de tres lavados. Para el último lavado, resuspender en 100 l de tampón A y vórtice para lograr una concentración final de 160 g/ml.
9. Para complejos el ADN y las perlas, primero prepare 480 l de sustrato de ADN etiquetado con 0,5 pM en el tampón A. A continuación, la pipeta en 20 l de suspensión de cuentas de 160 g/ml, asegurándose de vórtice las perlas antes de pipetear. Colocar en un rotador durante 3 min.
10. Después de 3 min, cargue inmediatamente en el canal a un caudal de 10 l/min durante 15 min o hasta que se observe suficiente anclaje del cordón.
    NOTA: Las cuentas no deben estar tan densamente embaladas que interactúen entre sí en la superficie (ver sección de discusión).
11. Para lavar el canal de todas las perlas libres, cambie el tubo de entrada a un tubo fresco de tampón A y fluya a 50 l/min durante al menos 10 minutos o hasta que no se observen perlas sueltas.

4. Recopilación y análisis de datos

1. Para preparar la recopilación de datos, coloque el tubo de entrada en un tubo de microcentrífuga que contenga al menos 100 l de NdeI (0,25–4,00 U/ml) en el búfer A. Baje el imán permanente sobre el canal de flujo y coloque el eje de la fuente de luz fuera para la toma de imágenes de campo oscuro.
   NOTA: Dos imanes anulares de tierras raras, epoxied juntos, se mantienen 8 mm por encima de la superficie activa del canal de flujo utilizando un poste óptico en voladizo durante la recopilación de datos. Se utiliza una lámpara de cuello de ganso para el curso de luz fuera del eje.
2. Utilice un microscopio comercial, una cámara de vídeo y un software de recopilación de datos(Tabla de materiales). En el software, haga clic en la pestaña"Exposición"y establezca "Tiempo de exposición"en 10 ms. Haga clic en la pestaña "Timelapse" y establezca "Image Count" en 600, "Duration" a 20 min, y "Interval" en 2 s. Haga clic en "Ejecutar" para iniciar la recopilación de datos.
3. En una bomba de jeringa, ajuste el caudal a 150 l/min y el volumen de inyección a 80 l. Pulse"Ejecutar"a 1 min en la recopilación de datos. Después de la inyección, apague la bomba y cierre la válvula para evitar el flujo durante la recolección de datos.
4. Una vez recopilados los datos, abra el software de análisis de imágenes (Tabla de materiales). En la pestaña"Archivo",elija "Importar " "Secuencia de imagen". Localice los archivos de imagen en el menú emergente y haga clic en "Abrir".
5. Establezca el umbral seleccionando"Ajustar Theshold"en el menú desplegable "Imagen". Utilice la barra deslizante para establecer el valor de umbral para identificar puntos brillantes correspondientes a los cordones de la imagen.
6. Cuente los puntos brillantes en cada fotograma haciendo clic en"Analizar partículas"en el menú desplegable"Analizar". Haga clic en "Aceptar", luego elija "Sí" para procesar todas las imágenes. Guarde el archivo de resultados.
   NOTA: Esto guardará un archivo de datos que contiene el número de perlas en cada fotograma de vídeo grabado.
7. Abra el software de análisis de datos (Tabla de materiales) e importe el archivo de resultados haciendo clic en " Importar desde archivo detexto" en el menú desplegable "Archivo". Trazar los datos de recuento de cuentas frente a la hora.
8. Ajuste el número de cuentas frente al tiempo haciendo clic en "Ajuste de curva" en el menú desplegable"Analizar". Elija la ecuación "Exponente Natural" y haga clic en "Probar Ajuste " "OK".
   NOTA: Solo deben incluirse en la región de montaje los datos registrados después de la inyección de la muestra. El parámetro de ajuste en el exponente de la función de ajuste será la tasa de escisión.

Resultados

Usando esta técnica, las tasas SSDC de NdeI se midieron para una gama de concentraciones de proteínas (0,25–4,00 U/ml) en dos concentraciones diferentes de magnesio (2 mM y 4 mM). Cada una de estas condiciones se replicó al menos dos veces, con unos pocos cientos a 1.000 DNAs atados por experimento. La Figura 2 describe el diseño experimental. En la figura 3 se muestran ejemplos de detalles de recopilación y análisis de datos. La Fig...

Discusión

El protocolo se puede utilizar para medir la cinética de cualquier sistema SSDC, siempre que se observe la separación de hebras durante el experimento. La detección de escote se ve afectada por la observación del desprendimiento del cordón amarreado y, por lo tanto, marca el instante de separación de la hebra. Todos los pasos anteriores se producen antes de la detección del escote; por lo tanto, sólo se registra el tiempo total de tránsito.

El cubreobjetos de células de flujo se func...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 minute Epoxy	Devcon	14250
anti-digoxigenin FAB fragments	Roche Diagnostics	11214667001
camera and software	Jenoptik	GRYPHAX SUBRA
data analysis software	Vernier Inc.	LP
double sided tape	Grace Biolabs	SA-S-1L
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline	Corning	21-031-CV
ethanol 95%	VWR	89370-082
forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC	Integrated DNA Technologies	n/a
image analysis software	National Institutes of Health	ImageJ
inverted microscope	Nikon	TE2000
knife printer	Silhouette
M13mp18 DNA	New England Biolabs	N4040S
MyOne streptavidin beads	Thermo Fisher Scientific	65601
NdeI enzyme	New England Biolabs	R0111S
PCR cleanup kit	Qiagen	28104
pluronic F-127	Anatrace	P305
polyethylene tubing PE-20	BD Intramedic	427406
polyethylene tubing PE-60	BD Intramedic	427416
Q5 Mastermix	New England Biolabs	M0492S
rare earth magnet 0.5" OD 0.25" ID	National Imports	NSN0814
rare earth magnet 0.75" OD 0.5" ID	National Imports	NSN0615
reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC	Integrated DNA Technologies	n/a
syringe pump	Kent Scientific	Genie Plus
β-Casein from bovine Milk	Sigma-Aldrich	C6905