Analisi cinetica ad alta velocità ad alto rendimento parallela per cleavage del DNA specifico del sito

Riepilogo

Viene descritto un metodo altamente parallelo per misurare la scissione specifica del sito del DNA a livello di singola molecola. Questo protocollo illustra la tecnica utilizzando la restrizione endonuclease NdeI. Il metodo può essere facilmente modificato per studiare qualsiasi processo che si traduce in scissione del DNA specifica del sito.

Abstract

La scissione del DNA specifica del sito (SSDC) è un passo chiave in molti processi cellulari ed è fondamentale per l'editing genico. Questo lavoro descrive un saggio cinetico in grado di misurare SSDC in molte singole molecole di DNA contemporaneamente. I DNA del substrato con legato al tallone, ciascuno contenente una singola copia della sequenza di destinazione, vengono preparati in un canale di flusso microfluidico. Un magnete esterno applica una forza debole alle perline paramagnetiche. L'integrità di un massimo di 1.000 singoli DN può essere monitorata visualizzando le microsfere sotto l'imaging darkfield utilizzando un obiettivo di ingrandimento ampio e basso campo. L'iniezione di una restrizione endonucleasi, NdeI, avvia la reazione scissione. La microscopia video viene utilizzata per registrare il momento esatto di ogni scissione del DNA osservando il fotogramma in cui il tallone associato si muove verso l'alto e verso l'alto dal piano focale dell'obiettivo. Il conteggio del tallone fotogramma per fotogramma quantifica la reazione e una adattamento esponenziale determina il tasso di reazione. Questo metodo consente la raccolta di dati quantitativi e statisticamente significativi sulle reazioni SSDC a singola molecola in un singolo esperimento.

Introduzione

La scissione del DNA specifica del sito (SSDC) è un passo chiave in molte transazioni genomiche. Ad esempio, i sistemi di restrizione batterica (RM)¹ e CRISPR² proteggono le cellule dagli attacchi di fagi e plasmi, riconoscendo e fendendo il DNA estraneo in sequenze specifiche. Nel tipo II RM, le endonucleasi di restrizione (RSI) riconoscono brevi sequenze di coppie di base (bp) 4-8 tramite interazioni proteina-nucleico^{dell'acido 3}. Le endonucleasi associate a CRISPR, come Cas9, si legano ai siti tramite ibridazione del sito di destinazione con crRNA associati alle endonucleasi⁴. La creazione di DSB (Double Stranded Breaks) specifiche del sito sono anche il primo passo in molti eventi di ricombinazione del DNA⁵. Ad esempio, la diversità delle regioni di associazione dell'antigene create dalla ricombinazione V(D)J richiede il riconoscimento e la scissione di siti di destinazione specifici⁶. Alcuni trasposoni sono noti per indirizzare sequenze di DNA specifiche, così^{come 7}. Non sorprende che molte nucleasi specifiche del sito coinvolte in questi processi, come Cas9, siano una componente chiave delle tecnologie di editing genico⁸. Inoltre, sono state progettate nuove endonucleasi specifiche del sito (ad esempio, nucleasi di dita di zinco⁹ e TALENS¹⁰) per modificare i genomi.

Molti metodi sono stati impiegati per misurare la cinetica della scissione site-specific degli acidi nucleici. Questi includono l'analisi del gel, la fluorescenza^11,12e i metodi basati sul sequenziamento¹³. Un importante progresso è stato raggiunto con il tethering delle microsfere, che consente ai DSB in singole molecole di DNA di essere rilevati dal movimento di una perla dopo la separazione del filamento. In questi metodi, diversi tipi di forze sono impiegati per garantire la separazione del filo e il movimento del tallone post-scissione. In un caso, sono state utilizzate trappole ottiche per misurare la scissione del DNA da parte di EcoRV¹⁴. In questi esperimenti, la ricerca target è l'obiettivo dell'indagine, con condizioni ottimizzate in modo che l'associazione specifica del sito sia il passaggio di limitazione della frequenza. Uno svantaggio delle trappole ottiche è che si può osservare un solo DNA alla volta. Inoltre, è necessario applicare una forza di trazione di grandi dimensioni periodica per testare la separazione del filo.

Un'altra tecnica utilizza una combinazione di flusso e deboli forze magnetiche per tirare sul tallone in modo continuo¹⁵. In questo modo, viene misurata la scissione limitata di NdeI. Il metodo impiegato consente la misurazione simultanea di diverse centinaia di DNA contemporaneamente, consentendo di raggiungere la significatività statistica in un singolo esperimento. Sono stati utilizzati anche esperimenti basati su pinzette magnetiche. In uno di questi studi, un integratore retrovirale è stato studiato includendo un DSB nell'oligonucleotide^{di inserimento 16}. Il successo dell'integrazione ha portato all'incorporazione di DSB nel DNA legato e alla perdita del tallone allegato. In uno studio simile sulla restrizione endonuclea EcoPI, dipendente dall'ATP, sono state osservate decine di DNA in un singolo esperimento¹⁷. Le pinzette magnetiche detengono il vantaggio che la tensione, così come il looping del DNA, possono essere controllate e monitorate durante la reazione.

Qui è presentato un metodo a singola molecola altamente parallelo per misurare la cinetica SSDC, che sfrutta i recenti miglioramenti nel tethering su larga scala dei DNA. Questo metodo è un miglioramento e l'estensione dei metodi precedenti utilizzati per misurare la replicazione del DNA¹⁸, lunghezza del contorno del DNA¹⁹e scissione da Es¹⁵. In questa tecnica, i DNA lineari contenenti una singola copia della sequenza di riconoscimento vengono preparati con la biotina ad un'estremità e la digoxigenina all'altra. La biotina lega streptavidin, che è covalentemente ad una microsfera paramagnetica. I complessi di perline di DNA vengono iniettati in un canale microfluidico che è stato funzionalizzato con frammenti DI FAB anti-digoxigenina. Il DNA si lega quindi ai punti di attacco della superficie attraverso il legame della digoxigenina ai frammenti FAB adsorbti. Le deboli forze magnetiche applicate con un magnete permanente impedise al tallone di attaccarsi in modo non specifico alla superficie. I campioni possono essere iniettati rapidamente (<30 s) nel canale di flusso per attivare la reazione di scissione. Il flusso viene disattivato durante la raccolta dei dati. Come ogni DNA è fessurato, il tempo esatto di scissione può essere determinato registrando il fotogramma in cui il tallone si muove su e fuori dal piano focale dell'obiettivo, scomparendo così dalla registrazione video. Un conteggio fotogramma per fotogramma delle perline rimanenti può essere utilizzato per quantificare il progresso della reazione.

Di seguito è riportato il protocollo completo e i dati di esempio raccolti utilizzando NdeI. Come esempio di come la tecnica può essere applicata, i tassi di scissione per una gamma di concentrazioni proteiche sono misurati a due diverse concentrazioni di magnesio, un cofattore di metallo essenziale. Anche se questa applicazione del protocollo utilizza NdeI, il metodo può essere adattato per l'uso con qualsiasi nucleasi specifica del sito variando il design del substrato di DNA.

Protocollo

1. Fare la cella di flusso

1. Lavaggio delle coperture
   1. Mettere i coverlips in vasetti di colorazione e sonicare con etanolo (EtOH), quindi con 1 M KOH (per 30 min ciascuno). Per evitare precipitazioni KOH in EtOH, risciacquare accuratamente con ddH₂O tra lavaggi.
   2. Ripetere entrambi i passaggi di lavaggio EtOH e KOH 1x per un numero totale di quattro lavaggi (due EtOH e due KOH). Conservare i coperture pulite in ddH₂O in vasetti di colorazione.
2. Tagliare i tubi di carico e di uscita (8 cm di lunghezza) utilizzando un rasoio pulito e inserire nei fori in un vetrerà di vetro pulito. Utilizzare PE-20 per l'ingresso e PE-60 per l'uscita. Epossiy per 5 minuti per fissare tubi e tagliare qualsiasi tubo in eccesso.
   NOTA: Vetrini di vetro misura 2'' x 3'' x 1 mm. I fori sono forati a coppie di 15 mm di distanza. Ogni coppia forma entrambe le estremità di un singolo canale. Il tubo con l'ID più piccolo viene utilizzato per l'ingresso, in quanto ciò riduce il volume morto a monte e quindi il tempo di miscelazione richiesto (Figura 1).
3. Allineate e applicate il nastro pretagliato a due lati con il motivo del canale tagliato sopra i fori sul vetro di vetro. Affiante con le forcepi di plastica per ottenere una buona tenuta.
   NOTA: Il nastro a due lati utilizzato in questo esperimento è spesso 120 m e i canali sono 2 mm di larghezza e 15 mm di lunghezza. I canali vengono tagliati utilizzando una stampante a coltello (Tabella dei materiali). È possibile montare fino a quattro canali su un singolo coverlip. Vedere Figura 1 per un'immagine della cella di flusso.
4. Dopo aver staccato il supporto, applicare un coperchio pulito (essiccato con aria compressa) sul nastro e lisciare di nuovo con le foci di plastica per un buon sigillo.
5. Epossiy il bordo fuori il coverslip per sigillare la cellula di flusso e lasciarlo curare.

2. Preparazione del DNA etichettato per il tethering

1. In un tubo PCR, preparate 50 L del mix di reazione PCR contenente la polimerasi del DNA ad alta fedeltà 0,02 U/L, 200 dNTP M, primer in avanti da 0,5 M, primer inverso da 0,5 M e 250 ng di DNA vettoriale M13mp18.
   NOTA: Qui, il primer in avanti (biotina-CCAACTTAATCGCCTTGC) e il primer inverso (digoxigenin-TGACCATTAGATACATTTCGC) sono stati scelti per amplificare una regione lunga circa 1.000 bp, che va dalle posizioni 6338 a 107 nel genoma circolare del DNA M13mp18. C'è un unico sito NdeI nel mezzo della regione amplificata. Il primer in avanti 5ʹ etichettato con digoxigenina, che lega l'anti-digoxigenina sul coperture. Il primer inverso 5ʹ etichettato con biotina, che lega le perline rivestite di streptavidi.
2. Inserite il tubo PCR nel termociclo e seguite il ciclo come mostrato nella tabella 1.
3. Purificare il prodotto PCR con un kit di pulizia PCR seguendo il protocollo del produttore.
   NOTA: Utilizzando il kit specificato nella Tabella dei Materiali,la resa tipica del DNA è di 2 g.

3. Tethering di DNA e perline

1. Preparare 10 mL di buffer A (1 M Tris-HCl [pH - 7,5], 50 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 1 mg/mL β-Casein, 1 mg/mL Pluronic F-127). Degas in un desiccatore sottovuoto per almeno 1 h.
2. Per funzionalizzare la cella di flusso, iniettare 25 L di frammenti FAB anti-digoxigenina (20 g/mL) in PBS nel canale di flusso. Utilizzare punte di caricamento gel per adattarsi al tubo PE-60. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 30 min.
3. Dopo l'incubazione, svuotare il canale tirando 0,5 mL di buffer A attraverso il canale utilizzando una siringa. Fare attenzione a non introdurre aria nel canale.
4. Dopo la funzionalizzazione, montare la cella di flusso su un microscopio invertito. Collegare il tubo di uscita a una pompa di siringa e mettere il tubo di ingresso in un tubo di microcentrifuge contenente tampone A.
5. Tirare manualmente almeno 0,5 mL del buffer A per svuotare il sistema e far uscire la pompa. Lasciare che la pompa funzioni a 10 L/min per almeno 5 min per equilibrare il sistema.
6. Per preparare le perline(Tabella dei materiali), vortice la bottiglia di brodo di perline e pipette 1,6 L delle perline di 10 mg/mL in 50 L del buffer A, quindi vortice.
7. Utilizzando un separatore magnetico, pipette fuori il buffer e risuostare in 50 L del buffer A, quindi vortice.
8. Ripetere il passaggio 3.7 2x per un totale di tre lavaggi. Per l'ultimo lavaggio, rispendere in 100 L di buffer A e vortice per ottenere una concentrazione finale di 160 g/mL.
9. Per complessore il DNA e le perline, preparare prima 480 L di 0,5 pM etichettato dna substrato nel buffer A. Quindi, pipetta in 20 l di sospensione perline da 160 g/mL, assicurandosi di vortice le perline prima di pipettare. Posizionare su un rotatore per 3 min.
10. Dopo 3 minuti, caricare immediatamente nel canale ad una velocità di flusso di 10 L/min per 15 min o fino a quando non si osserva un sufficiente tethering del tallone.
    NOTA: Le perline non devono essere così densamente imballate da interagire tra loro sulla superficie (vedere la sezione discussione).
11. Per lavare il canale di tutte le perline libere, impostare il tubo di ingresso su un tubo fresco di tampone A e fluire a 50 L/min per almeno 10 min o fino a quando non si osservano perline sciolte.

4. Raccolta e analisi dei dati

1. Per preparare la raccolta dei dati, inserire il tubo di ingresso in un tubo di microcentrifuge contenente almeno 100 L di NdeI (0,25–4,00 U/mL) nel buffer A. Abbassare il magnete permanente sul canale di flusso e posizionare la sorgente luminosa fuori asse per l'imaging darkfield.
   NOTA: Due magneti anulari di terre rare, epossidati insieme, sono tenuti 8 mm sopra la superficie attiva del canale di flusso utilizzando un post ottico a sbalzo durante la raccolta dei dati. Una lampada a collo d'oca viene utilizzata per il corso di luce fuori asse.
2. Utilizzare un microscopio commerciale, una videocamera e un software di raccolta dati(Tabella dei materiali). Nel software, fare clic sulla scheda "Esposizione" e impostare "Tempo esposizione" su 10 ms. Fare clicsulla scheda " Timelapse" e impostare "Numero immagini" su 600, "Durata" su 20 min e "Intervallo" su 2 s. Fare clic su" Esegui" per avviare la raccolta dei dati.
3. Su una pompa di siringa, impostare la velocità di flusso su 150 L/min e il volume di iniezione su 80 l. Premere "Esegui" a 1 min nella raccolta dei dati. Dopo l'iniezione, spegnere la pompa e chiudere la valvola per evitare il flusso durante la raccolta dei dati.
4. Una volta raccolti i dati, aprire il software di analisi delle immagini (Tabella dei materiali). Nella scheda "File", scegliere" Importa " "Sequenza immagine". Individuare i file di immagine nel menu a comparsa e fare clic su "Apri".
5. Impostare la soglia scegliendo "Regola la proprietà" nel menu a discesa " Immagine ".Image Utilizzare la barra di scorrimento per impostare il valore di soglia per identificare i punti luminosi corrispondenti alle perline nell'immagine.
6. Contare i punti luminosi in ogni fotogramma facendo clic su "Analizzaparticelle "nelmenu a discesa " Analizza ". Fare clic su" OK", quindi scegliere "Sì" per elaborare tutte le immagini. Salvare il file dei risultati.
   NOTA: questo salverà un file di dati che contiene il numero di perline in ogni fotogramma video registrato.
7. Aprire il software di analisi dei dati (Tabella dei materiali) e importare il file dei risultati facendo clic su " Importa da file ditesto" nel menu a discesa "File". Tracciare i dati del conteggio delle perline rispetto al tempo.
8. Adattare il numero di perline rispetto al tempo facendo clic su "Adattacurva "nelmenu a discesa " Analizza ". Sceglierel'equazione " EsponenteNaturale " e fare clic su "Prova adatta " "OK".
   NOTA: solo i dati registrati dopo l'iniezione del campione devono essere inclusi nella regione di raccordo. Il parametro fit nell'esponente della funzione di raccordo sarà la velocità di scissione.

Risultati

Utilizzando questa tecnica, i tassi SSDC di NdeI sono stati misurati per una gamma di concentrazioni proteiche (0,25–4,00 U/mL) a due diverse concentrazioni di magnesio (2 mM e 4 mM). Ognuna di queste condizioni è stata replicata almeno due volte, con poche centinaia di 1.000 DNA con tethering per esperimento. Figura 2 descrive la progettazione sperimentale. Nella figura 3 sono illustrati esempi di dettagli di raccolta e analisi dei dati.

Discussione

Il protocollo può essere utilizzato per misurare la cinetica di qualsiasi sistema SSDC, a condizione che la separazione del filo sia osservata durante l'esperimento. La rilevazione della scissione è influenzata osservando il distacco del tallone legato e quindi segna l'istante di separazione del filo. Tutti i passaggi precedenti si verificano prima del rilevamento della scissione; pertanto, viene registrato solo il tempo di transito totale.

Il cosorpecco cellulare di flusso è funzionalizzat...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 minute Epoxy	Devcon	14250
anti-digoxigenin FAB fragments	Roche Diagnostics	11214667001
camera and software	Jenoptik	GRYPHAX SUBRA
data analysis software	Vernier Inc.	LP
double sided tape	Grace Biolabs	SA-S-1L
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline	Corning	21-031-CV
ethanol 95%	VWR	89370-082
forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC	Integrated DNA Technologies	n/a
image analysis software	National Institutes of Health	ImageJ
inverted microscope	Nikon	TE2000
knife printer	Silhouette
M13mp18 DNA	New England Biolabs	N4040S
MyOne streptavidin beads	Thermo Fisher Scientific	65601
NdeI enzyme	New England Biolabs	R0111S
PCR cleanup kit	Qiagen	28104
pluronic F-127	Anatrace	P305
polyethylene tubing PE-20	BD Intramedic	427406
polyethylene tubing PE-60	BD Intramedic	427416
Q5 Mastermix	New England Biolabs	M0492S
rare earth magnet 0.5" OD 0.25" ID	National Imports	NSN0814
rare earth magnet 0.75" OD 0.5" ID	National Imports	NSN0615
reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC	Integrated DNA Technologies	n/a
syringe pump	Kent Scientific	Genie Plus
β-Casein from bovine Milk	Sigma-Aldrich	C6905