平行高通量单分子动力学测定，用于现场特异性DNA裂解

摘要

介绍了一种在单个分子水平上测量DNA的位点特异性裂解高度平行的方法。该协议演示了使用限制内核糖 NdeI 的技术。该方法可以很容易地修改，以研究任何过程，导致现场特异性DNA裂解。

摘要

站点特异性DNA裂解（SSDC）是许多细胞过程中的关键步骤，对基因编辑至关重要。这项工作描述了一个动力学测定，能够同时测量许多单DNA分子中的SSDC。珠系基板DNA，每个包含目标序列的单个副本，在微流体流通道中准备。外部磁铁对顺磁珠施以弱力。使用宽场低放大镜目对暗场成像下的微珠进行可视化，可监控多达 1，000 个单个 DNA 的完整性。注射限制内核糖，NdeI，启动裂解反应。视频显微镜用于通过观察相关珠子在目标焦平面上移的帧来记录每个 DNA 裂解的确切时刻。帧按帧的珠数可量化反应，指数拟合确定反应速率。此方法允许在单个实验中收集单个分子 SSDC 反应的定量和具有统计显著性的数据。

引言

现场特异性DNA裂解（SSDC）是许多基因组交易中的关键步骤。例如，细菌限制修饰 （RM）¹ 和 CRISPR² 系统通过识别和切割特定序列中的异质核子，保护细胞免受噬菌体和质粒的攻击。在II型RM中，限制性内核糖核酸（ES）通过蛋白-核酸相互作用识别短4~8基对（bp）序列^。CRISPR 相关的内端体（如 Cas9）通过将 crRNA 绑定到内端体⁴的目标站点杂交绑定到站点。建立站点特定的双搁浅断裂（DSB）也是许多DNA重组事件5的第一^步。例如，V（D）J 重组创建的抗原结合区域的多样性要求识别和裂解特定目标位^{点 6}。一些转子已知以特定的DNA序列为目标，以及^7。毫不奇怪，这些过程中涉及的许多特定站点的核酸酶，如Cas9，是基因编辑技术^{8的关键组成部分}。此外，还设计了新的现场特异性内分酶（即锌指核酶⁹ 和塔伦^NS10）来编辑基因组。

许多方法已被用于测量核酸的位点特异性裂解的动力学。其中包括凝胶分析、荧光^11、12,12和基于测序的方法^13。微珠的系绳取得了重大进展，它允许DNA单分子中的DSB在链分离后通过珠子的运动来检测。在这些方法中，使用不同类型的力来确保珠子的链分离和后裂隙的运动。在一个案例中，EcoRV 14已经用光学陷阱来测量DNA^的裂解。在这些实验中，目标搜索是调查的目标，优化了条件，使特定于站点的绑定是速率限制步骤。光学陷阱的一个缺点是一次只能观察到一个DNA。此外，必须应用周期性大拉力来测试绞线分离。

另一种技术使用流动和弱磁力的组合，以连续的方式拉上^珠子15。这样，通过 NdeI 测量扩散有限裂解。采用的方法允许同时测量几百个DNA，从而在单个实验中达到统计显著性。还使用了基于磁性钳子的实验。在一项此类研究中，通过在插入寡核苷酸¹⁶中加入DSB进行了研究逆转录病毒性整质。成功的集成导致DSB在系绳DNA中加入，并丢失所附珠子。在一项类似的研究ATP依赖III型限制内核糖酶EcoPI，在一个单一的实验17中观察到了^{数十个DNA。}磁钳具有在反应过程中可以控制和监测张力以及DNA循环的优势。

这里介绍的是一种用于测量SSDC动力学的极平行单分子方法，它利用了最近DRNA大规模系绳的改进。这种方法是以往用于测量DNA复制^18、DNA19的轮廓长度和由REs¹⁵进行裂解的方法的改进^和扩展。在这项技术中，包含识别序列单一副本的线性DNA在一端用生物素和二恶合宁在另一端进行准备。生物素结合链球菌素，它与顺磁微珠共价附着。DNA珠复合物被注入一个微流体通道，该通道已经用抗二恶英FAB片段功能化。然后，DNA 将二恶由多宁与吸附的 FAB 片段结合，将附着到表面附着点。使用永磁体施加的弱磁力防止珠子非专门粘在表面。样品可快速注入流通道（<30 s），以激活裂解反应。在数据收集过程中，流已关闭。当每个DNA被切割时，可以通过记录珠子向上和移出目标焦点图的框架来确定裂解的确切时间，从而从视频记录中消失。剩余珠子的帧计数可用于量化反应进度。

下面介绍的是完整的协议以及使用 NdeI 收集的数据示例数据。作为如何应用该技术的一个例子，一系列蛋白质浓度的裂解率以镁的两种不同浓度（一种重要的金属辅助因子）进行测量。虽然该协议的这种应用使用NdeI，但该方法可以通过改变DNA基板设计，适用于任何场内特异性核酸酶。

研究方案

1. 制作流动细胞

1. 清洗盖玻片
   1. 将盖玻片放在染色罐中，用乙醇 （EtOH） 进行声波处理，然后用 1 M KOH（每个 30 分钟）。为避免在 EtOH 中出现 KOH 沉淀，在洗涤之间用 ddH₂O 彻底冲洗。
   2. 重复 EtOH 和 KOH 洗涤步骤 1x，总共洗涤四次（两次 EtOH 和两次 KOH）。将清洁的盖玻片存放在 ddH₂O 中染色罐中。
2. 使用干净的剃须刀切割装载和退出管（8 厘米长），并插入干净的玻璃滑梯中的孔中。使用PE-20作为入口，使用PE-60作为出口。环氧树脂 5 分钟，用于固定管材并修剪掉任何多余的管材。
   注:玻璃滑梯测量 2'' x 3' x 1 mm。孔钻成15毫米的对。每对形成单个通道的任一端。带较小 ID 的油管用于入口，因为这样可以减少上游死体积，从而缩短所需的混合时间（图 1）。
3. 将预切双面胶带与通道图案切割在玻璃幻灯片上的孔上进行排队和应用。用塑料钳子平滑，实现良好的密封。
   注:本实验中使用的双面胶带厚度为120 μm，通道宽2毫米，长15毫米。通道是使用刀打印机切割的（材料表）。在单个盖玻片上最多可以安装四个通道。有关 流单元格的图像 ，请参阅图 1。
4. 剥落背衬后，在胶带上涂抹干净的盖玻片（用压缩空气干燥），然后用塑料钳子再次平滑，以获得良好的密封。
5. 环氧树脂边缘关闭盖玻片密封流动细胞，让它固化。

2. 准备标记DNA进行系绳

1. 在PCR管中，制备含有0.02 U/μL高保真DNA聚合酶、200μM dNTPs、0.5 μM前向底材、0.5μM反向底材和250 ng的M13mp18载体DNA的PCR反应混合物。
   注:在这里，选择前底像（生物素-CCAACTTAATCGCCTTGC）和反向底土（二恶八八（二恶八八）放大一个约1，000bp长的区域，从M13mp18DNA的圆形基因组中的位置6338到107。放大区域中间有一个 NdeI 站点。正向底5ʹ标有二恶名宁，将抗二恶名宁绑在盖玻片上。反向底5ʹ生物素，与链球菌涂层的珠子结合。
2. 将 PCR 管插入热循环器中，然后按照循环进行，如 表 1 所示。
3. 按照制造商的协议使用 PCR 清理套件净化 PCR 产品。
   注:使用材料表中 指定的试剂盒，典型的DNA产量为±2μg。

3. DNA和珠子的束缚

1. 准备10 mL的缓冲器A（1 M Tris-HCl [pH = 7.5]，50 mM NaCl，2 mM MgCl₂， 1 mg/mL β-卡辛，1毫克/mL普鲁里尼奇F-127）。真空干燥器中的脱气至少 1 小时。
2. 要使流细胞功能化，在PBS中注入25μL的抗二恶英FAB片段（20μg/mL）。使用凝胶加载技巧，以适合PE-60管。在室温（RT）下孵育30分钟。
3. 孵育后，使用注射器将0.5 mL缓冲器 A 拉过通道，冲洗通道。注意不要将空气引入通道。
4. 功能化后，将流动细胞安装在倒置的显微镜上。将出口管连接到注射器泵，将进气管放入含有缓冲液 A 的微离心管中。
5. 手动拉取至少 0.5 mL 的缓冲器 A 以冲洗系统并给泵提供压力。让泵以 10 μL/min 运行至少 5 分钟，使系统平衡。
6. 要将珠子（材料表）制备，将10mg/mL库存珠的1.6μL的储存瓶和移液器漩涡制备成50μL的缓冲器 A，然后涡流。
7. 使用磁性分离器，移液器出缓冲液，然后重新悬浮在50μL的缓冲器 A 中，然后涡流。
8. 重复步骤 3.7 2x，总共洗三次。对于最后一次洗涤，重新在100μL的缓冲液 A和涡流中，以达到160μg/mL的最终浓度。
9. 为了将DNA和珠子进行复合，首先在缓冲液 A 中制备 480 μL 的 0.5 pM 标记 DNA 基质。然后，移液器在20μL的160μg/mL珠子悬浮，确保在移液前旋转珠子。放在旋转器上 3 分钟。
10. 3 分钟后，立即以 10 μL/min 的流量加载到通道中，时间为 ±15 分钟，或直到观察到足够的珠子系绳。
    注:珠子不应如此密集，以致于它们表面上相互交互（参见讨论部分）。
11. 要清洗所有自由珠的通道，请将进气管切换到缓冲器 A 的新鲜管，并在 50 μL / min 入至少 10 分钟，或直到未观察到松动的珠子。

4. 数据收集和分析

1. 为准备数据收集，将进气管放入缓冲器 A 中至少含有 100 μL NdeI （0.25±4.00 U/mL） 的微离心管中。
   注:在数据收集过程中，使用悬臂光学柱将两个环形稀土磁铁（环氧树脂）聚集在一起，在流道的有源表面上方8毫米。鹅颈灯用于轴外灯课程。
2. 使用商业显微镜、摄像机和数据收集软件（材料表）。 在软件中，单击"曝光"选项卡，将"曝光时间"设置为10 ms。单击"延时"选项卡，将"图像计数"设置为 600，"持续时间"设置为 20 分钟，将"间隔"设置为 2 秒。单击"运行"以开始数据收集。
3. 在注射器泵上，将流量设置为 150 μL/min，将注射量设置为 80 μL。Run喷射后，关闭泵并关闭阀门，以防止数据收集过程中出现流量。
4. 收集数据后，打开图像分析软件（材料表）。在 "文件"选项卡下，选择 "导入" | [图像序列]。在弹出式菜单中找到图像文件，然后单击"打开"。
5. 在"图像"下拉菜单下选择"调整位置"来设置阈值。使用滑块条设置阈值，以识别与图像中的珠子对应的亮点。
6. 单击"分析"下拉菜单中的"分析粒子"来计算每一帧的亮点。单击 "确定"，然后选择"是"来处理所有图像。保存结果文件。
   注意:这将保存一个数据文件，其中包含每个录制的视频帧中的珠数。
7. 打开数据分析软件（材料表），通过点击"文件"下拉菜单中的"从文本文件导入"导入结果文件。绘制珠子计数数据与时间。
8. 单击"分析"下拉菜单中的"曲线拟合"，以适合珠子数量与时间。选择 [自然指数] 方程， 然后单击 [尝试适合]""好的".
   注:仅应将样品喷射后记录的数据包含在拟合区域中。拟合函数指数中的拟合参数将是裂解率。

结果

利用这项技术，测量了两种不同浓度镁（2 mM 和 4 mM）的一系列蛋白质浓度（0.25~4.00 U/mL）的 NdeI SSDC 速率。每个条件至少复制两次，每个实验有几百到 1，000 个系绳 DNA。 图 2 描述了实验设计。 图 3 显示了数据收集和分析详细信息的示例。 图4 说明了该速率如何取决于两种镁浓度的蛋白质浓度。可以观察到，在足够低的蛋白质浓?...

讨论

该协议可用于测量任何SSDC系统的动力学，前提是在实验中观察到链分离。通过观察系绳珠的分离而影响裂解的检测，因此标志着链分离的瞬间。所有上述步骤都发生在检测到裂痕之前;因此，只记录总的运输时间。

流细胞盖玻片通过抗体蛋白对清洁玻璃的非特异性吸附功能化。清洁不足的玻璃可能会影响抗体的结合。在系绳中，珠子密度应足够低，以便珠子不相互作用。附件...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 minute Epoxy	Devcon	14250
anti-digoxigenin FAB fragments	Roche Diagnostics	11214667001
camera and software	Jenoptik	GRYPHAX SUBRA
data analysis software	Vernier Inc.	LP
double sided tape	Grace Biolabs	SA-S-1L
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline	Corning	21-031-CV
ethanol 95%	VWR	89370-082
forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC	Integrated DNA Technologies	n/a
image analysis software	National Institutes of Health	ImageJ
inverted microscope	Nikon	TE2000
knife printer	Silhouette
M13mp18 DNA	New England Biolabs	N4040S
MyOne streptavidin beads	Thermo Fisher Scientific	65601
NdeI enzyme	New England Biolabs	R0111S
PCR cleanup kit	Qiagen	28104
pluronic F-127	Anatrace	P305
polyethylene tubing PE-20	BD Intramedic	427406
polyethylene tubing PE-60	BD Intramedic	427416
Q5 Mastermix	New England Biolabs	M0492S
rare earth magnet 0.5" OD 0.25" ID	National Imports	NSN0814
rare earth magnet 0.75" OD 0.5" ID	National Imports	NSN0615
reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC	Integrated DNA Technologies	n/a
syringe pump	Kent Scientific	Genie Plus
β-Casein from bovine Milk	Sigma-Aldrich	C6905