Siteye Özgü DNA Bölünmesi için Paralel Yüksek İş Kinetik Test

Özet

TEK molekül düzeyinde DNA'nın bölgeye özgü dekoltesini ölçmek için son derece paralel bir yöntem tanımlanmıştır. Bu protokol, kısıtlama enonuclease NdeI kullanarak tekniği göstermektedir. Yöntem kolayca siteye özgü DNA bölünmesi ile sonuçlanan herhangi bir süreci incelemek için değiştirilebilir.

Özet

Siteye özgü DNA bölünmesi (SSDC) birçok hücresel süreçte önemli bir adımdır ve gen düzenleme için çok önemlidir. Bu çalışma, aynı anda birçok tek DNA moleküllerinde SSDC ölçme yeteneğine sahip bir kinetik töz açıklar. Her biri hedef sıranın tek bir kopyasını içeren boncuk-bağlı substrat DNA'ları mikroakışkan akış kanalında hazırlanır. Harici mıknatıs paramanyetik boncuklar için zayıf bir kuvvet uygular. 1.000'e kadar ayrı DNA'nın bütünlüğü, geniş alan, düşük büyütme hedefi kullanılarak karanlık alan görüntüleme siperinde mikroboncukların görselleştirilmesiyle izlenebilir. Bir kısıtlama endonükleaz enjekte, NdeI, dekolte reaksiyonu başlatır. Video mikroskobu, ilişkili boncuk hedefin odak düzleminin yukarı ve dışına hareket ettiği çerçeveyi gözlemleyerek her DNA bölünmesinin tam anını kaydetmek için kullanılır. Kare kare boncuk sayma reaksiyonu ölçer ve üstel uyum tepki hızını belirler. Bu yöntem, tek bir deneyde tek moleküllü SSDC reaksiyonları hakkında nicel ve istatistiksel olarak anlamlı verilerin toplanmasına olanak sağlar.

Giriş

Siteye özgü DNA bölünmesi (SSDC) birçok genomik işlemin önemli bir adımıdır. Örneğin, bakteriyel kısıtlama-modifikasyon (RM)¹ ve CRISPR² sistemleri belirli dizilerde yabancı DNA'yı tanıyarak ve yarıklayarak hücreleri faj ve plazmidlerin saldırısına karşı korur. Tip II RM'de, restriksiyon endokleazları (REs) protein-nükleik asit etkileşimleri ile kısa 4-8 baz çifti (bp) dizilerini^{tanırlar 3.} Cas9 gibi CRISPR ilişkili ensonükleazlar, ensonükleazlara bağlı crRNA'lar ile hedef alanın hibridizasyonu yoluyla sitelere bağlanır⁴. Siteye özgü çift iplikçikli molaların (DSB'ler) oluşturulması da birçok DNA rekombinasyon olayının ilk adımıdır^5. Örneğin, V(D)J rekombinasyon tarafından oluşturulan antijen bağlama bölgelerinin çeşitliliği belirli hedef sitelerin tanınmasını ve bölünmesini gerektirir^6. Bazı transpozonlar belirli DNA dizileri hedef bilinmektedir, yanı sıra⁷. Beklendiği gibi, cas9 gibi bu süreçlerde yer alan birçok siteye özgü nükleazlar, gen düzenleme teknolojileri⁸önemli bir bileşenidir. Buna ek olarak, yeni siteye özgü endokleazlar (örneğin, çinko parmak nükleazları⁹ ve TALENS¹⁰⁾da genomları döşeyecek şekilde tasarlanmıştır.

Birçok yöntem nükleik asitlerin siteye özgü dekolte kinetik ölçmek için kullanılmıştır. Bu jel analizi dahil, floresan^11,12, ve sıralama tabanlı yöntemler¹³. Mikroboncukların tethering ile büyük bir ilerleme sağlandı, hangi DNA'nın tek moleküllerinde DSB'ler iplikçik ayrımı ndan sonra bir boncuk hareketi ile tespit edilmesine olanak sağlar. Bu yöntemlerde, boncuk sonrası dekoltenin iplikçik ayrıştırılması ve hareketini sağlamak için farklı kuvvet türleri kullanılır. Bir durumda, optik tuzaklar EcoRV¹⁴tarafından DNA bölünmesi ölçmek için kullanılmıştır. Bu deneylerde, hedef arama araştırmanın amacıdır ve siteye özgü bağlamanın oranı sınırlayan adım olması için koşullar optimize edilebistir. Optik tuzakların bir dezavantajı da aynı anda sadece tek bir DNA'nın gözlemlenebildiğidir. Buna ek olarak, iplikçik ayrımı için test etmek için periyodik büyük çekme kuvveti uygulanmalıdır.

Başka bir teknik sürekli bir şekilde boncuk çekmek için akış ve zayıf manyetik kuvvetlerin bir arada kullanır¹⁵. Bu şekilde NdeI ile difüzyon sınırlı dekolte ölçülür. Kullanılan yöntem aynı anda birkaç yüz DA'nın eşzamanlı olarak ölçülmesine olanak sağlayarak, tek bir deneyde istatistiksel anlamlıya ulaşılmasını sağlar. Manyetik cımbız üzerine deneyler de kullanılmıştır. Bu tür bir çalışmada, bir retroviral integrase ekleme oligonükleotid bir DSB dahil edilerek çalışıldı¹⁶. Başarılı entegrasyon, DSB'nin bağlı DNA'ya dahil edilmesi ve ekli boncuk kaybıile sonuçlandı. ATP'ye bağlı tip III restriksiyon endokleaz EcoPI benzer bir çalışmada, tek bir deneyde onlarca DNA gözlenmiştir¹⁷. Manyetik cımbız, reaksiyon sırasında gerilimin yanı sıra DNA döngünün de kontrol edilebildiği ve izlenebileceği avantajını elinde tutar.

Burada sunulan SSDC kinetik ölçmek için son derece paralel tek molekülyöntemi, hangi BÜYÜK ÖLÇEKLI TEthering büyük ölçekli tethering son gelişmeler yararlanır. Bu yöntem, DNA replikasyonu^18,DNA¹⁹kontur uzunluğu ve REs¹⁵ile dekolte ölçmek için kullanılan önceki yöntemlerin bir iyileşme ve uzantısıdır. Bu teknikte, tanıma dizisinin tek bir kopyasını içeren lineer DNA'lar bir uçta biotin, diğer ucunda digoksijenin ile hazırlanır. Biotin streptavidin bağlar, kovalent bir paramanyetik mikrop bağlı. DNA-boncuk kompleksleri anti-digoksigenin FAB parçaları ile işlevselleştirilmiş bir mikroakışkan kanal içine enjekte edilir. DNA daha sonra digoksigenin adsorbe FAB parçalarına bağlanması yoluyla yüzey eki noktalarına bağlanır. Kalıcı bir mıknatısla uygulanan zayıf manyetik kuvvetler, boncuk ların özellikle yüzeye yapışmamasını önlüyor. Numuneler dekolte reaksiyonu etkinleştirmek için akış kanalına hızla (<30 s) enjekte edilebilir. Veri toplama sırasında akış kapatılır. Her DNA'nın ayrılmasıyla, dekoltenin tam zamanı, reklamın hedefin odak planının yukarı ve dışına doğru hareket ettiği çerçevenin kaydedilmesi yle belirlenebilir ve böylece video kaydından kaybolur. Kalan boncukların kare kare sayısı reaksiyon ilerlemesini ölçmek için kullanılabilir.

Aşağıda sunulan tam protokol yanı sıra NdeI kullanılarak toplanan örnek veriler. Tekniğin nasıl uygulanabildiğini örnek olarak, bir dizi protein konsantrasyonu için bölünme oranları, önemli bir metal kofaktör olan iki farklı magnezyum konsantrasyonu ile ölçülür. Protokolün bu uygulaması NdeI'yi kullansa da, yöntem DNA substrat tasarımını değiştirerek herhangi bir yere özgü nükleaz ile kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Protokol

1. Akış hücresi yapma

1. Kapakların yıkanması
   1. Boyama kavanozları ve etanol (EtOH) ile sonicate yerleştirin, sonra 1 M KOH (her biri için 30 dakika için). EtOH'da KOH yağışını önlemek için yıkarlar arasında ddH₂O ile iyice durulayın.
   2. Toplam dört yıkama (iki EtOH ve iki KOH) sayısı için hem EtOH hem de KOH yıkama adımlarını 1x tekrarlayın. Temizlenmiş kapakları boyama kavanozlarında ddH₂O'da saklayın.
2. Temizleme bir jilet kullanarak yükleme ve çıkış tüplerini (8 cm uzunluğunda) kesin ve temiz bir cam kaydıraktaki deliklere yerleştirin. Giriş için PE-20 ve çıkış için PE-60 kullanın. Epoksi 5 dk için tüp güvenli ve herhangi bir fazla tüp kapalı kırpma.
   NOT: Cam slaytlar 2'' x 3'' x 1 mm ölçülerindedir. Delikler 15 mm arayla çift olarak delinmiş. Her çift, tek bir kanalın her iki ucunu oluşturur. Daha küçük kimlikli borular giriş için kullanılır, çünkü bu, yukarı doğru ölü hacmi ve böylece gerekli karıştırma süresini azaltır (Şekil 1).
3. Hattı ve kanal deseni cam slayt üzerinde delikler üzerinde kesilmiş precut çift taraflı bant uygulayın. Iyi bir mühür elde etmek için plastik forceps ile düzleştirin.
   NOT: Bu deneyde kullanılan çift taraflı bant 120 μm kalınlığında, kanallar 2 mm genişliğinde ve 15 mm uzunluğundadır. Kanallar bıçakyazıcı(Malzeme Tablosu)kullanılarak kesilir. Tek bir kapak kaymasına en fazla dört kanal sığdırmak mümkündür. Akış hücresinin görüntüsü için Şekil 1'e bakın.
4. Arka dan sıyrıldıktan sonra, bant üzerine temiz bir coverslip (basınçlı hava ile kurutulmuş) uygulayın ve iyi bir mühür için plastik forseps ile tekrar düzleştirin.
5. Epoksi akış hücremühür ve tedavi sağlar kapak kapalı kenarı.

2. Tethering için etiketli DNA hazırlanması

1. Bir PCR tüpünde, 0,02 U/μL yüksek doğrulukta DNA polimeraz, 200 μM dNTPs, 0,5 μM ileri astar, 0,5 μM ters astar ve 250 ng M13mp18 vektör DNA içeren 50 μL PCR reaksiyon karışımı hazırlayın.
   NOT: Burada, ileri astar (biotin-CCAACTTAATCGCCTTGC) ve ters astar (digoksigenin-TGACCATTAGATACATTTCGC) m13mp18 DNA'nın dairesel genomunda 6338 ile 107 arasında değişen yaklaşık 1.000 bp uzunluğundaki bir bölgeyi yükseltmek için seçilmiştir. Yükseltilmiş bölgenin ortasında tek bir NdeI sitesi vardır. Ön astar 50 digoksigenin ile etiketlenmiş, hangi coverslip üzerinde anti-digoksigenin bağlar. Ters astar 50 biotin ile etiketlenmiş, hangi streptavidin kaplı boncukbağlar.
2. PCR tüpünü termocycler'a yerleştirin ve Tablo 1'degösterildiği gibi döngüyü takip edin.
3. PCR ürününü, üreticinin protokolünü izleyerek bir PCR temizleme kiti yle arındırın.
   NOT: Malzeme Tablosu'ndabelirtilen kiti kullanarak tipik DNA verimi ~2 μg'dir.

3. DNA ve boncukte tethering

1. 10 mL tampon A (1 M Tris-HCl [pH = 7.5], 50 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 1 mg/mL β-Kazein, 1 mg/mL Pluronik F-127) hazırlayın. En az 1 saat vakum desiccator degas.
2. Akış hücresini işlevselleştirmek için PBS'deki 25 μL anti-digoksigenin FAB parçalarını (20 μg/mL) akış kanalına enjekte edin. PE-60 boruiçine sığacak jel yükleme ipuçları nı kullanın. 30 dakika oda sıcaklığında (RT) kuluçka.
3. Kuluçkadan sonra, bir şırınga kullanarak kanaldan 0,5 mL tampon A çekerek kanalı temize çıkar. Kanala hava sokmamaya dikkat edin.
4. İşlevselleştirmeden sonra, akış hücresini ters bir mikroskoba monte edin. Çıkış tüpünü şırınga pompasına bağlayın ve giriş tüpünü tampon A içeren mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
5. Sistemi yıkamak ve pompayı astarlamak için en az 0,5 mL tampon A'yı manuel olarak çekin. Pompanın sistemi dengelemek için en az 5 dk 10 μL/dk'da çalışmasını sağlar.
6. Boncukları(Malzeme Tablosu)hazırlamak için, 10 mg/mL stok boncukların 10 mg/mL'lik stok boncuklarının 1.6 μL'lik stok şişesini 50 μL tampon A'ya, sonra girdap haline getirmek.
7. Manyetik ayırıcı kullanarak, arabellek dışarı pipet ve tampon A 50 μL, sonra girdap içinde resuspend.
8. Üç yıkıntı toplam için adım 3.7 2x tekrarlayın. Son yıkama için, 160 μg/mL'lik son konsantrasyonu elde etmek için 100 μL tampon A ve girdapta yeniden askıya alın.
9. DNA ve boncukları karmaşıkleştirmek için, ilk olarak tampon A'da 0,5 pM etiketli DNA substratı 480 μL hazırlayın. Daha sonra, pipet 20 μL 160 μg/mL boncuk süspansiyon, pipetleme önce boncuk girdap emin olun. 3 dakika boyunca bir rotator üzerine yerleştirin.
10. 3 dakika sonra, ~15 dk için 10 μL/dk akış hızında veya yeterli boncuk tethering gözlenene kadar kanala hemen yükleyin.
    NOT: Boncuklar yüzeyde birbirleriyle etkileşime girmeyecek kadar yoğun bir şekilde paketlenmemelidir (bkz. tartışma bölümü).
11. Tüm serbest boncukların kanalını yıkamak için giriş tüpünü yeni bir tampon A tüpüne çevirin ve en az 10 dakika boyunca 50 μL/dk'da veya gevşek boncuk lar gözlenene kadar akın.

4. Veri toplama ve analiz

1. Veri toplamaya hazırlanmak için giriş tüpünü en az 100 μL NdeI (0.25-4.00 U/mL) içeren mikrosentrifüj tüpüne yerleştirin.
   NOT: İki anüler nadir toprak mıknatıslar, birlikte epoksi, veri toplama sırasında bir cantilevered optik sonrası kullanılarak akış kanalının aktif yüzeyi üzerinde 8 mm tutulur. Eksen dışı ışık seyrinde kaz boyun lambası kullanılır.
2. Ticari bir mikroskop, video kamera ve veri toplama yazılımı(Malzeme Tablosu) kullanın. Yazılımda "Pozlama" sekmesine tıklayın ve "Pozlama Süresi" seçeneğini 10 ms'e ayarlayın. "Timelapse" sekmesine tıklayın ve "Resim Sayısı" 600' e, "Süre" den 20 dakikaya ve "Interval" i 2'ye ayarlayın. Veri toplamaya başlamak için "Çalıştır"ı tıklatın.
3. Bir şırınga pompasında, akış hızını 150 μL/dk'ya, enjeksiyonRunhacmini 80 μL'ye ayarlayın. Enjeksiyondan sonra, pompayı kapatın ve veri toplama sırasında akışı önlemek için vanayı kapatın.
4. Veriler toplandıktan sonra, açık görüntü analiz yazılımı(Malzeme Tablosu). "Dosya" sekmesialtında , "Import" | "Görüntü Dizisi". Açılan menüdeki resim dosyalarını bulun ve "Aç"ı tıklatın.
5. "Image" pull-down menüsüaltında "Adjust Theshold" seçeneğini seçerek eşiği ayarlayın. Görüntüdeki boncuklara karşılık gelen parlak noktaları belirlemek için eşik değerini ayarlamak için kaydırıcı çubuğunu kullanın.
6. "Analyze" pull-down menüsünde "Parçacıkları Analiz Et" seçeneğini tıklayarak her karedeki parlak noktaları sayın. Tüm görüntüleri işlemek için "Tamam"'ı tıklatın, ardından "Evet" seçeneğini belirleyin. Sonuç dosyasını kaydedin.
   NOT: Bu, kaydedilen her video karesinde boncuk sayısını içeren bir veri dosyasını kaydeder.
7. Veri analiz yazılımı(Malzeme Tablosu)açın ve "Dosya" çekme menüsünde " TextFile "den Alma" butonuna tıklayarak sonuç dosyasını içeri aktarın. Boncuk sayısı verilerini zamana göre çizin.
8. "Analyze" pull-down menüsünde "Curve Fit" butonuna tıklayarak boncuk ve zamana göre boncuk sayısını sığdırın. "Natural Expent" denklemini seçin ve "Try Fit" seçeneğini tıklayın | "Tamam".
   NOT: Sadece numune enjeksiyonundan sonra kaydedilen veriler montaj bölgesine dahil edilmelidir. Montaj fonksiyonunun üstteki uygun parametresi dekolte hızı olacaktır.

Sonuçlar

Bu teknik kullanılarak, SSDC ndeI oranları iki farklı magnezyum konsantrasyonlarında (2 mM ve 4 mM) çeşitli protein konsantrasyonları (0.25-4.00 U/mL) olarak ölçüldü. Bu koşulların her biri deney başına birkaç yüz ila 1.000 bağlı NA'larla en az iki kez çoğaltıldı. Şekil 2 deneysel tasarımı tanımlar. Şekil 3 veri toplama ve analiz ayrıntıları örneklerini gösterir. Şekil 4, magnezyumun iki konsantrasy...

Tartışmalar

Protokol, deney sırasında iplikçik ayrımının gözlenmiş olması koşuluyla, herhangi bir SSDC sisteminin kinetiklerini ölçmek için kullanılabilir. Dekolte tespiti, bağlı boncuk kopması gözlemleyerek etkilenir ve bu nedenle iplikçik ayırma anında işaretler. Tüm önceki adımlar dekolte tespitinden önce meydana gelir; böylece, sadece toplam transit süresi kaydedilir.

Akış hücre örtüsü temiz cama antikor proteininin spesifik olmayan adsorpsiyonu ile işlevselhale geti...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 minute Epoxy	Devcon	14250
anti-digoxigenin FAB fragments	Roche Diagnostics	11214667001
camera and software	Jenoptik	GRYPHAX SUBRA
data analysis software	Vernier Inc.	LP
double sided tape	Grace Biolabs	SA-S-1L
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline	Corning	21-031-CV
ethanol 95%	VWR	89370-082
forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC	Integrated DNA Technologies	n/a
image analysis software	National Institutes of Health	ImageJ
inverted microscope	Nikon	TE2000
knife printer	Silhouette
M13mp18 DNA	New England Biolabs	N4040S
MyOne streptavidin beads	Thermo Fisher Scientific	65601
NdeI enzyme	New England Biolabs	R0111S
PCR cleanup kit	Qiagen	28104
pluronic F-127	Anatrace	P305
polyethylene tubing PE-20	BD Intramedic	427406
polyethylene tubing PE-60	BD Intramedic	427416
Q5 Mastermix	New England Biolabs	M0492S
rare earth magnet 0.5" OD 0.25" ID	National Imports	NSN0814
rare earth magnet 0.75" OD 0.5" ID	National Imports	NSN0615
reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC	Integrated DNA Technologies	n/a
syringe pump	Kent Scientific	Genie Plus
β-Casein from bovine Milk	Sigma-Aldrich	C6905