Параллельная высокая пропускная способность одной молекулы кинетический анализ для сайта-специфического расщепления ДНК

Резюме

Описан весьма параллельный метод измерения специфического участка расщепления ДНК на уровне одной молекулы. Этот протокол демонстрирует технику с использованием ограничения endonuclease NdeI. Метод может быть легко изменен для изучения любого процесса, что приводит к сайту конкретных расщепления ДНК.

Аннотация

Расщепление ДНК (SSDC) является ключевым шагом во многих клеточных процессах, и это имеет решающее значение для редактирования генов. Эта работа описывает кинетический анализ, способный измерять SSDC во многих отдельных молекулах ДНК одновременно. Привязные бисером субстратные ДНК, каждый из которых содержит одну копию целевой последовательности, готовятся в канале микрофлюидного потока. Внешний магнит применяет слабую силу к парамагнитным бусинкам. Целостность до 1000 отдельных ДНК можно контролировать с помощью визуализации микробусов под темным полем изображения с помощью широкого поля, с низким увеличением цели. Инъекция эндонуклеазы ограничения, NdeI, инициирует реакцию расщепления. Видео микроскопия используется для записи точного момента каждого расщепления ДНК, наблюдая кадр, в котором связанный шарик движется вверх и из фокусной плоскости цели. Подсчет бисера кадр за кадром количественно определяет реакцию, и экспоненциальная подгонка определяет скорость реакции. Этот метод позволяет сбор количественных и статистически значимых данных о реакции одной молекулы SSDC в одном эксперименте.

Введение

Расщепление ДНК(SSDC) является ключевым шагом во многих геномных транзакциях. Например, системы бактериального ограничения модификации (RM)¹ и CRISPR^{2 защищают} клетки от атак фагов и плазмидов, распознавая и расщепляя иную ДНК в определенных последовательностях. В типе II RM, ограничения эндонуклеи (REs) распознают короткие 4-8 базовых пар (bp) последовательности через белково-нуклеиновой кислоты^{взаимодействий 3}. СВЯЗАННЫе с CRISPR эндонуклеи, такие как Cas9, связываются с сайтами через гибридизацию целевого сайта с crRNAs, связанными с эндонуклеями⁴. Создание сайта конкретных двойных мель перерывов (DSBs) также являются первым шагом во многих событиях рекомбинации^{ДНК 5}. Например, разнообразие антигенных связывающих областей, созданных рекомбинацией V(D)J, требует распознавания и расщепления конкретных целевых^{объектов 6.} Некоторые транспозоны, как известно, нацелены на конкретные последовательности ДНК, а^{также 7}. Неудивительно, что многие ядра, связанные с конкретными участками, участвующие в этих процессах, такие как Cas9, являются ключевым компонентом технологий редактирования генов^8. Кроме того, для редактирования геномов были также разработаны новые эндонуклеазы для конкретных^{сайтов (т.е. ядра цинковых} пальцев 9 и TALENS^10).

Многие методы были использованы для измерения кинетики сайта конкретных расщепления нуклеиновых кислот. К ним относятся гель анализ, флуоресценция^11,12, и секвенирования на основе^{методов 13}. Значительный прогресс был достигнут с привязыванием микробусов, что позволяет DSBs в отдельных молекул ДНК, которые будут обнаружены движением шарика после разделения нити. В этих методах, различные типы сил используются для обеспечения разделения нити и движения шарика после расщепления. В одном случае, оптические ловушки были использованы для измерения расщепления ДНК EcoRV¹⁴. В этих экспериментах целевой поиск является целью исследования, при этом условия оптимизированы таким образом, чтобы привязкой к конкретному сайту был шаг ограничения скорости. Одним из недостатков оптических ловушек является то, что только одна ДНК может наблюдаться одновременно. Кроме того, периодические большие силы потянув должны быть применены для проверки на разделение нити.

Другой метод использует сочетание потока и слабых магнитных сил, чтобы тянуть на шарик в непрерывной манере¹⁵. Таким образом, диффузия ограниченного расщепления NdeI измеряется. Используемый метод позволяет одновременно измерять сразу несколько сотен ДНК, что позволяет достичь статистической значимости в ходе одного эксперимента. Эксперименты на основе магнитных пинцетов также были использованы. В одном из таких исследований, ретровирусной интегразы был изучен в том числе DSB в вставке олигонуклеотид¹⁶. Успешная интеграция привела к включению DSB в привязанную ДНК и потере прикрепленного шарика. В аналогичном исследовании АТФ-зависимого типа III ограничения эндонуклеазы EcoPI, десятки ДНК наблюдались в одном эксперименте¹⁷. Магнитные пинцеты имеют то преимущество, что напряжение, а также цикл ДНК, можно контролировать и контролировать во время реакции.

Здесь представлен весьма параллельный метод одной молекулы для измерения кинетики SSDC, который использует недавние улучшения в крупномасштабных привязываниях ДНК. Этот метод является улучшение и расширение предыдущих методов, используемых для^{измерения репликации ДНК 18}, длина^{контура ДНК 19}, и расщепление REs¹⁵. В этом методе линейные ДНК, содержащие одну копию последовательности распознавания, готовятся с биотином на одном конце и дигоксигенином на другом. Биотин связывает стрептавидин, который ковалентно крепится к парамагнитной микробусу. ДНК-бисерные комплексы вводятся в микрофлюидный канал, который был функционализирован с анти-digoxigenin FAB фрагментов. Затем ДНК привязывается к точкам крепления поверхности через привязку дигоксигенина к адсорбированным фрагментам FAB. Слабые магнитные силы, применяемые с помощью постоянного магнита, не держат шарик от прилипания некондиентного к поверхности. Образцы могут быть введены быстро (Lt;30 s) в канал потока, чтобы активировать реакцию расщепления. Поток отключается во время сбора данных. Поскольку каждая ДНК расщепляется, точное время расщепления может быть определено путем записи кадра, в котором шарик движется вверх и из координационного плана цели, тем самым исчезая из видеозаписи. Для количественной оценки прогресса реакции можно использовать рамку за кадром, подсчитывая оставшиеся бусы.

Ниже приведен полный протокол, а также пример данных, собранных с помощью NdeI. В качестве примера того, как метод может быть применен, расщепление ставки для целого ряда концентраций белка измеряются в двух различных концентрациях магния, существенного кофактора металла. Хотя это применение протокола использует NdeI, метод может быть адаптирован для использования с любым сайтом конкретных нуклеазы путем изменения конструкции субстрата ДНК.

протокол

1. Создание ячейки потока

1. Мытье крышки
   1. Место coverslips в окрашивание банки и sonicate с этанолом (EtOH), а затем с 1 M KOH (по 30 мин каждый). Чтобы избежать осадков KOH в EtOH, тщательно промойте ddH₂O между мойки.
   2. Повторите как EtOH и KOH стиральные шаги 1x для общего числа четырех моет (два EtOH и два KOH). Храните очищенные крышки в ddH₂O в окрашивающих банках.
2. Вырезать погрузки и выхода труб (8 см в длину) с помощью чистой бритвой и вставить в отверстия в чистом стеклянном слайде. Используйте PE-20 для входов и PE-60 для розетки. Epoxy в течение 5 минут, чтобы обеспечить трубки и обрезать любые избыточные трубки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные слайды измеряют 2'' x 3'' x 1 мм. Отверстия просверлены парами на 15 мм друг от друга. Каждая пара формирует любой конец одного канала. Трубка с меньшим идентификатором используется для входе, так как это уменьшает мертвый объем вверх по течению и, таким образом, время смешивания требуется (Рисунок 1).
3. Выстроиться и применить precut двустороннюю ленту с каналом шаблон вырезать над отверстиями на стеклянной горке. Гладкая с пластиковыми типсами для достижения хорошего уплотнения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Двусторонняя лента, используемая в этом эксперименте, имеет толщину 120 мкм, а каналы шириной 2 мм и длиной 15 мм. Каналы вырезаются с помощью ножапринтера (Таблица материалов). Можно поместить до четырех каналов на одном обложке. Смотрите рисунок 1 для изображения ячейки потока.
4. После отслаивания от поддержки, нанесите чистый крышку (высушенную сжатым воздухом) на ленту и снова разглайте пластиковыми типсами для хорошего уплотнения.
5. Epoxy края от крышки, чтобы запечатать поток ячейки и дайте ему вылечить.

2. Подготовка помеченной ДНК для привязывания

1. В ПЦР-трубке подготовьте 50 МКЛ смеси реакции ПЦР, содержащей полимеразу ДНК высокой точности 0,02 U/L, 200 МКМ dNTPs, 0,5 МКМ вперед грунтовки, 0,5 МКМ обратной грунтовки, и 250 нг M13mp18 векторной ДНК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, вперед грунтовки (биотин-CCAACTTAATCGCCTTGC) и обратной грунтовки (digoxigenin-TGACCATTAGATACATTTCGC) были выбраны для усиления региона около 1000 bp длиной, охватывающих от позиций 6338 до 107 в круговом геноме M13mp18 ДНК. В центре усиленной области имеется единый сайт NdeI. Перемотка вперед 5ʹ помечена дигоксигенином, который связывает анти-дигоксигенин на крышке. Обратная грунтовка 5ʹ помечена биотином, который связывает бисер со стрептавидиным покрытием.
2. Вставьте трубку ПЦР в термоциклер и следуйте циклу, как показано в таблице 1.
3. Очистите продукт PCR с помощью комплекта очистки ПЦР в соответствии с протоколом производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование комплекта, указанного в таблице материалов, типичный выход ДНК составляет 2 мкг.

3. Привязка ДНК и бисера

1. Приготовьте 10 мл буфера A (1 M Tris-HCl (pH ) 7,5 , 50 мМ НаКл, 2 мМ МгКл₂, 1 мг/мл β-Casein, 1 мг/мл Плуронический F-127). Дега в вакуумном децикаторе не менее 1 ч.
2. Для функционализации ячейки потока в канал потока вводится 25 МКЛ антидигоксигенина ФРАГМЕНТОВ ФАБ (20 мкг/мл) в PBS. Используйте гель загрузки советы, чтобы вписаться в PE-60 труб. Инкубация при комнатной температуре (RT) в течение 30 мин.
3. После инкубации смойте канал, потянув 0,5 мл буфера А через канал с помощью шприца. Позаботьтесь о том, чтобы не вводить воздух в канал.
4. После функционализации намонтировать ячейку потока на перевернутом микроскопе. Подключи розетку к шприц-насосу и поместите входную трубку в микроцентрифугную трубку, содержащую буфер А.
5. Вручную потяните не менее 0,5 мл буфера А, чтобы промыть систему и загрунтовать насос. Пусть насос работает на 10 йл/ мин, по крайней мере 5 минут, чтобы уравночные системы.
6. Для подготовки бисера(Таблица материалов), вихрь запас бутылку бисера и пипетки 1,6 л из 10 мг / мл бульона бусы в 50 л буфера, то вихрь.
7. Используя магнитный сепаратор, пипетка из буфера и resuspend в 50 йл буфера, то вихрь.
8. Повторите шаг 3.7 2x в общей сложности три моет. Для последней стирки, перерасход в 100 мкл буфера и вихря для достижения окончательной концентрации 160 мкг/мл.
9. Чтобы упраз сложности ДНК и бисера, сначала подготовьте 480 МКЛ 0,5 рМ с маркировкой ДНК-субстрата в буфере А. Затем, пипетка в 20 йл 160 мкг / мл шарик подвески, убедившись, что вихрь бисера перед пипеткой. Поместите на ротатор в течение 3 мин.
10. Через 3 мин. немедленно загружайте в канал со скоростью потока 10 мл/мин в течение 15 мин или до тех пор, пока не будет соблюдено достаточное количество привязывания бисера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бисер не должен быть настолько плотно упакован, что они взаимодействуют друг с другом на поверхности (см. раздел обсуждения).
11. Чтобы вымыть канал всех свободных бусин, переключите входную трубку на свежую трубку буфера А и втмитесь со стороны 50 йл/мин в течение по крайней мере 10 минут или до тех пор, пока не будут замечены свободные бусы.

4. Сбор и анализ данных

1. Чтобы подготовиться к сбору данных, поместите входную трубку в микроцентрифугную трубку, содержащую не менее 100 МКЛ NdeI (0,25-4,00 U/mL) в буфере A. Нижняя постоянная магнит над каналом потока, и располагаем источник света от оси для изображения темного поля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Два кольцеобразных редкоземельных магнита, эпоксидные вместе, находятся на 8 мм над активной поверхностью канала потока с помощью кантилеверированного оптического столба во время сбора данных. Гусиная лампа шеи используется для внеосевого светового курса.
2. Используйте коммерческий микроскоп, видеокамеру и программное обеспечение для сбора данных(Таблица материалов). В программном обеспечении щелкнитевкладку«Экспозиция» и установите«Время экспозиции»до 10 мс. Нажмитена вкладку Timelapseи установите "Image Count" до 600, "Длительность" до 20 мин, и "Интервал" до 2 с. Нажмитекнопку"Беги", чтобы начать сбор данных.
3. На шприц-насосе установите скорость потока до 150 мкл/мин и объем впрыска до 80 йл. Нажмите "Run" на 1 мин в сборе данных. После инъекции выключите насос и закройте клапан, чтобы предотвратить поток во время сбора данных.
4. После сбора данных открытое программное обеспечение для анализа изображений(Таблица материалов). Подвкладкой "Файл",выберите" Импорт " "Последовательность изображений". Найдите файлы изображений во всплывающем меню и нажмите кнопку "Открыть".
5. Установите порог, выбрав "Adjust Theshold" под "Изображение "выдвижной меню. Используйте бар ползунка, чтобы установить пороговое значение для определения ярких пятен, соответствующих бисеру на изображении.
6. Подсчитайте яркие пятна в каждом кадре, нажавкнопку «Анализчастиц» в«Анализе»выдвижного меню. Нажмите "OK", а затем выберите" Да", чтобы обработать все изображения. Сохраните файл результатов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит сохранить файл данных, который содержит количество бусинок в каждом записанном видеорамку.
7. Программное обеспечение для анализаоткрытых данных (Таблицаматериалов) и импортировать файл результатов, нажав на " Импорт изтекстовогофайла " в "Файл" выдвижной меню. Участок данных подсчета шарика против времени.
8. Fit количество бисера против времени, нажав "Кривая Fit" в "Анализ "выдвижной меню. Выберитеуравнение «Естественный экспонент»и нажмите кнопку «Try Fit » "Хорошо".
   ПРИМЕЧАНИЕ: В подходящий регион должны быть включены только данные, записанные после введения выборки. Подходящим параметром в экспоненте фитинговой функции будет скорость расщепления.

Результаты

Используя этот метод, SSDC ставки NdeI были измерены для диапазона концентраций белка (0,25-4,00 U/mL) в двух различных концентрациях магния (2 мМ и 4 мм). Каждое из этих условий было воспроизведено по крайней мере дважды, с несколькими сотнями до 1000 привязанных ДНК за эксперимент. Рисуно?...

Обсуждение

Протокол может быть использован для измерения кинетики любой системы SSDC, при условии, что разделение нити наблюдается в ходе эксперимента. Обнаружение расщепления зависит от наблюдения за отслоение привязали шарика и, следовательно, знаменует собой момент разделения нити. Все предыду...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 minute Epoxy	Devcon	14250
anti-digoxigenin FAB fragments	Roche Diagnostics	11214667001
camera and software	Jenoptik	GRYPHAX SUBRA
data analysis software	Vernier Inc.	LP
double sided tape	Grace Biolabs	SA-S-1L
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline	Corning	21-031-CV
ethanol 95%	VWR	89370-082
forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC	Integrated DNA Technologies	n/a
image analysis software	National Institutes of Health	ImageJ
inverted microscope	Nikon	TE2000
knife printer	Silhouette
M13mp18 DNA	New England Biolabs	N4040S
MyOne streptavidin beads	Thermo Fisher Scientific	65601
NdeI enzyme	New England Biolabs	R0111S
PCR cleanup kit	Qiagen	28104
pluronic F-127	Anatrace	P305
polyethylene tubing PE-20	BD Intramedic	427406
polyethylene tubing PE-60	BD Intramedic	427416
Q5 Mastermix	New England Biolabs	M0492S
rare earth magnet 0.5" OD 0.25" ID	National Imports	NSN0814
rare earth magnet 0.75" OD 0.5" ID	National Imports	NSN0615
reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC	Integrated DNA Technologies	n/a
syringe pump	Kent Scientific	Genie Plus
β-Casein from bovine Milk	Sigma-Aldrich	C6905