החלת גירוי מכני תלת מימדי ביוריאקטור מערכת לגרום לבידול Tenogenic של תאי גזע הנגזר גיד

Summary

תלת-מימדי גירוי מכני מכאני מערכת ביוריאקטור הוא ביווריקטור אידיאלי עבור הבחנה מסוימת של הבידול בתאי גזע הנגזר גיד והיווצרות גיד ניאו.

Abstract

טדינופתיה היא מחלת גיד כרונית נפוצה הנוגעת לדלקת וניוון באזור אורתופדיות. עם תחלואה גבוהה, יכולת לתיקון עצמי מוגבל, והכי חשוב, אין טיפולים מוחלט, הטדינפתיה עדיין משפיע על איכות החיים של המטופלים שלילית. גיד-בתאי גזע נגזר (TDSCs), כמו התאים הראשוניים העיקרי של תאים גיד, לשחק תפקיד חיוני הן בפיתוח של הטדינפתיה, ושחזור פונקציונלי ומבניים לאחר הטנופתיה. כך, שיטה שיכולה בתוך מבחנה לחקות את הבידול vivo של TDSCs לתוך תאים גיד יהיה שימושי. כאן, הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה המבוססת על תלת מימדי (3D) מערכת מתיחה uniaxial כדי לעורר את TDSCs להבדיל לרקמות כמו גיד. ישנם שבעה שלבים של הפרוטוקול הנוכחי: בידוד של עכברים TDSCs, תרבות והתרחבות של עכברים TDSCs, הכנת התרבות גירוי בינונית עבור היווצרות הגיליון התא, גיליון התא היווצרות על-ידי culturing במדיום גירוי, הכנת תא גזע 3D בניית תאים, הרכבה של מתיחה uniaxial מותח מורכב גירוי מכני, הערכה של האפקטיביות הוכח על ידי היסטולוגיה. ההליך כולו לוקח פחות מ 3 שבועות. כדי לקדם את התצהיר של מטריקס מטריתאי, 4.4 mg/mL חומצה אסקורבית שימש במדיום תרבות גירוי. חדר מופרד עם מנוע לינארי מספק טעינה מכנית מדויקת והוא נייד ומותאם בקלות, אשר מוחל על הביוריאקטור. משטר ההעמסה בפרוטוקול הנוכחי היה 6% זן, 0.25 Hz, 8 h, ואחריו 16 h מנוחה עבור 6 ימים. פרוטוקול זה יכול לחקות בידול התא בגיד, אשר מועיל לחקירה של התהליך הפתולוגי של הטדינופתיה. יתר על כן, הרקמה כמו גיד משמש פוטנציאל לקדם ריפוי גיד בפגיעת גיד כשתל אוטוולוגי הנדסה. כדי לסכם, הפרוטוקול הנוכחי הוא פשוט, כלכלי, מתוכולל ותקף.

Introduction

טדינפתיה היא אחת מפציעות הספורט השכיחות. הוא מתבטא בעיקר על ידי כאב, נפיחות מקומית, הופחת מתח שרירים באזור המושפע, ותפקוד לקוי. השכיחות של הטדינופתיה הוא גבוה. הנוכחות של אכילס טאננופתיה היא הנפוצה ביותר עבור רצים באמצע ובמרחק ארוך (עד 29%), בעוד הנוכחות של הפצ'יני טאננופתיה הוא גם גבוה בספורטאים של כדורעף (45%), כדורסל (32%), מסלול ושדה^4,5(23%)^{, כדוריד}(15%),^{וכדורגל}(^13%),2,,³, עם זאת, בשל יכולת הריפוי העצמי המוגבלת של הגיד, והיעדר טיפולים יעילים, הטדינפתיה עדיין משפיע על החיים של המטופלים באופן שלילי^6,7. יתר על כן, הפתוגנזה של טדינופתיה נשאר ברור. היו חקירות רבות על הפתוגנזה שלה, בעיקר כולל "תורת הדלקות", "תורת הניוון", "תאוריית שימוש יתר", וכן הלאה⁸. כיום, חוקרים רבים האמינו כי tendinopathy היתה בשל התיקון העצמי כישלון לפציעות מיקרו מוגברת שנגרמו על ידי מכני מוגזם טוען את חווה^9,10.

בתאי גזע נגזר של גיד (TDSCs), כמו התאים הראשוניים העיקרי של תאים גיד, לשחק תפקיד חיוני הן בפיתוח של tendinopathy ושחזור פונקציונלי ומבניים לאחר הטאננופתיה^11,12,13. זה דווח כי גירוי מכני הלחץ יכול לגרום התפשטות והבידול של אוסטאופציטים, אוסטאופתית, תאי שריר החלקה, השרירים, בתאי גזע mesenchymal ותאים אחרים רגישים כוח^{14,15,16,17,18}. לפיכך, TDSCs, כאחד התאים המכניים והחזקים ביותר, ניתן בדומה לגירוי להבדיל¹⁹באמצעות טעינה^{מכנית 19,20}.

עם זאת, פרמטרים שונים של טעינה מכנית (כוח טעינת, תדירות טעינת, סוג טעינה ותקופת טעינה) יכול לגרום TDSCs להבדיל לתאים שונים²¹. לכן, משטר העמסה אפקטיבי ותקף מכני הוא משמעותי מאוד עבור tenogenesis. יתר על כן, ישנם סוגים שונים של ריאקטורים כמו מערכות גירוי המשמשים כיום לאספקת העמסה מכני TDSCs. העקרונות של כל סוג של ביוריאקטור חקן הם שונים, כך הפרמטרים ההעמסה מכני המתאימים ביוריאקטורים שונים הם גם שונים. לכן, פרוטוקול גירוי פשוט, כלכלי ומתכלה הוא ביקוש, כולל סוג הביוריאקטור, מדיום הגירוי המקביל ומשטר ההעמסה המכני.

המאמר הנוכחי מתאר שיטה המבוססת על תלת מימדי (3D) מערכת מתיחה uniaxial כדי לעורר את TDSCs להבדיל רקמות כמו גיד. ישנם שבעה שלבים של הפרוטוקול: בידוד של עכברים TDSCs, תרבות והתרחבות של עכברים TDSCs, הכנת התרבות גירוי בינונית עבור היווצרות הגיליון התא, גיליון התא היווצרות על-ידי culturing במדיום גירוי, הכנת תא גזע 3D בניית התא, הרכבה של מתיחה מכני מערכת גירוי מכאני, והערכה של גירוי מכני ההליך כולו לוקח פחות מ 3 שבועות כדי להשיג את המבנה תא תלת-ממד, אשר הרבה פחות מאשר כמה שיטות קיימות^22,23. הפרוטוקול הנוכחי הוכח להיות מסוגל לגרום TDSCs להבדיל רקמת גיד, וזה יותר אמין מאשר דו מימדי הנוכחי בשימוש דו-ממדי (2D) מערכת מתיחה²¹. האפקטיביות הוכח על ידי היסטולוגיה. בקיצור, הפרוטוקול הנוכחי הוא פשוט, כלכלי, מתוכולל ותקף.

Protocol

השיטות שתוארו אושרו והוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות של ועדת האתיקה לבעלי חיים באוניברסיטת מערב אוסטרליה.

1. בידוד של עכברים TDSCs

1. המתת חסד 6-8 בן שבוע-C57BL/6 עכברים על ידי פריקה צוואר הרחם.
2. .^וגידים של אכילס²⁵
3. לעכל את הגידים מאחד עם 6 מ ל מסוג אני הקולגנאז (3 מ"ג/mL) עבור 3 h.
   הערה: כמו בגודל של גיד בעכבר קטן, כל הגידים שנקטפו מעכבר אחד יש להשתמש בשלב זה.
4. לאסוף את התאים והתרבות בינונית מינימלית Essential מינימלי (Alpha-מזכור) המכיל 10% סרום העוברי (FBS) ו 1% של תערובת סטרפטומיצין ו פניצילין עבור 7 ימים.
5. זיהוי TDSCs באמצעות מיון תא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית על-ידי cy, CD90 ו-סקה -1; חוסר הביטוי של CD34 וCD45).
6. מעבר והקפאת תאים (מעבר 4 תאים ישמשו לשלבים נוספים).

2. תרבות והתרחבות של עכברים TDSCs

הערה: בצע את כל השלבים במכסה הביובטיחות סטרילי.

1. קח את התאים התחממו (עכברים TDSCs, 1,000,000 תאים, מעבר 4, עד 37 ° c).
2. הוסף באיטיות 4-5 מ ל של מדיום מינימלי חיוני לחלוטין (Alpha-זיכרון).
3. העבירו את התערובת לצינור. צנטריפוגה של 15 מ ל עם פיפטה
4. למעלה עם בינוני עד 8 מ"ל סה כ עם פיפטה.
   1. מדיום לחימום בחממה 37 ° c.
5. הציבו את הצינור בצנטריפוגה ובאיזון.
6. צנטריפוגה ותאים גלולה ב 347 x g עבור 5 דקות.
7. צאו אחרי הצנטריפוגה. ובידקו את הגלולה בתחתית
8. Decant בינונית הקפאה, ולהשעות מחדש את התאים בעדינות ב 1-2 mL של בינוני מוחלט (להימנע מלעשות בועות רבות מדי).
9. העבר תאים שהושעו מחדש לבקבוקון T-75 באמצעות פיפטה.
10. השתמש בפיפטה כדי להוסיף לבקבוק אלפא-מדיום מלא לבקבוקון כדי להגיע לנפח כולל של 10 מ ל עם ריכוז סופי של 13,000 תאים/cm².
11. מניחים את הבקבוקון לתוך החממה והתרבות ב 37 ° c עם 5% CO₂.
12. . להחליף את המדיום כל 3 ימים
13. להתבונן ולנטר את התאים תחת מיקרוסקופ בעת שינוי המדיום עד התאים הם מתורבתים כדי 100% המפגש (כ 40,000 תאים/cm²).

3. הכנת מדיום לעיבוד תאים

הערה: בצע את כל השלבים במכסה הביובטיחות סטרילי.

1. שופכים 15 מ ל של בינונית אלפא-מלאה להשלים לתוך צינור סטרילי 15 מ"ל.
2. הוסף 6 μL של חומצה אסקורבית (11 מ"ג/mL) לתוך 15 mL של בינונית עבור ריכוז סופי של 4.4 μg/mL.
   הערה: בנוסף, הוספת 25 ng/mL מקדם גידול רקמת חיבור במדיום תרבות גירוי יכול להאיץ את כל תהליך הצמיחה והבידול.
3. מערבבים בעדינות על ידי היפוך למעלה ולמטה.

4. היווצרות יריעות תאים על ידי מעגלי גירוי במדיום

הערה: בצע את כל השלבים במכסה הביובטיחות סטרילי.

1. למחוק את המדיום המלא הרגיל אלפא-זיכרון בזהירות, ולהימנע מלגעת התאים המחוברים לתחתית הבקבוקון.
2. הוסף 10 מ ל של גירוי בינוני לאט להימנע גורם כל הפרעה לתאים באופן מלא.
3. תרבות התאים במדיום גירוי 9 ימים (לשנות את המדיום כל 3 ימים) כדי ליצור מספיק את הגיליון התא ב 37 ° c עם 5% CO₂.
   הערה: מטריצת מערות יהיה עבה והווה להיות מעונן כאשר הוא נצפה מהחלק התחתון של הבקבוקון לאחר גירוי על ידי חומצה אסקורבית, כלומר גיליון התא הוא נוצר מספיק.

5. הכנת מבנה תא גזע של גיד 3D

הערה: בצע את כל השלבים במכסה הביובטיחות סטרילי.

1. . תוציא את הבקבוקון מאינקובטור
2. התעלם מאמצעי הגירוי לחלוטין.
3. שטוף את גיליון התאים המונאולייר עם תמיסת מלח (PBS) על ידי התערבל הבקבוקון.
4. . השמט את הערוץ לגמרי
5. השתמש בפיפטה כדי להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין לפינה של הבקבוקון.
6. הקש על פינת הבקבוקון כדי לבטל את החיבור של גיליון התא המונאולייר עד שהפינה של גיליון התא תרד מהחלק התחתון של הבקבוקון.
7. הוסף מיד 9 מ"ל של מדיום אלפא-מלאה להשלים כדי להפסיק את הטריסינזציה.
8. המשך לסדר את הבקבוקון כדי לקלף את הסדין התאי המונאולייר לחלוטין.
9. יוצקים את הגיליון הכולל של התא המצורף לצלחת פטרי עם בינוני.
10. השתמש פינצטה סטרילי להרים פינה אחת של גיליון התא ולסובב בכיוון השעון עבור 15 פעמים.
11. תרימי קצה אחר של גיליון התא ולסובב בכיוון נגד כיוון השעון עבור 10 פעמים כדי ליצור בחוזקה גיד-כמו בניית מבחנה (איור 1A).

6. הרכבת היחידה-מתיחה מורכבת גירוי מכני ביוריאקטור ייחודי מעוצב

הערה: בצע את כל השלבים במכסה הביובטיחות סטרילי.

1. לחבר את ווים על ידי החיבור ולהתאים את המרחק הרצוי (2 ס מ) בין שני קרסים.
2. בעדינות רוח 3D TDSCs לבנות על קרס מורכב 3 פעמים על כל וו (איור 1B).
3. אבטח את הקרסים עם התא לבנות על החדר של ביוריאקטור חקן על ידי הידוק הברגים על שני הקצוות.
   הערה: החדר כולו, כולל ברגים וקרסים, הוא סטרילי (החיטוי עבור 1.5 h ב 134 ° צ' וקרני אולטרה סגול (UV) לחשוף 24 שעות לפני השימוש). עבור מחזיק המתכת של התאים, אור UV לחשוף עבור 48 שעות לפני השימוש.
4. תמלא את החדר עם. מדיום אלפא-מושלם
5. חבר את המפעיל לחדר התרבות באמצעות כבל.
6. חותכים את הקרסים מחובר על ידי מספריים סטרילי.
7. הפעל את העוצמה ואת בקר הערוץ המקביל להתחיל גירוי מכני.
8. . שים את המכסה על החדר
9. בדוק את נוריות החיווי וודא שהbioreשחקן יכול לתפקד כראוי.
10. לשים את ביוריאקטור חקן בחממה ואת נושא תא תלת-ממד מתיחה מכני עבור 6 ימים (6% מתיחה, 0.25 Hz, 8 h, ואחריו 16 h מנוחה).

7. הערכת גירוי מכני ברקמות כמו גיד מבחנה

1. שחרר את הברגים על-ידי מברג והכנס את ההרכבה בזהירות.
2. שים את הרקמה כמו גיד לתוך 4% פאראפורמלדהיד עבור קיבוע עבור 15 דקות.
3. מניחים את הרקמה כמו גיד קבוע לתוך קלטת ביופסיה עם מגיני קצף ביופסיה.
4. תהליך כדי להסודה את המדגם ולבסוף להעריך על ידי כתמים היסטולוגית H & E.
5. חזור על הפרוטוקול כולו ולחלץ RNA מן הרקמה כמו גיד להערכת הביטוי של סמנים tenogenic על ידי ה-PCR כמותי (qPCR). התחל עבור הגנים שנבחרו מפורטים בטבלה 1.
   הערה: פרוטוקול היסטולוגיה ופרוטוקול qPCR הם סטנדרטיים ובעקבות מחקר קודם²¹.

תוצאות

לפני גירוי מכני, TDSCs גדלו ל-100% המפגש במדיום המלא והציג מורפולוגיה בעלת מבנה לא מאורגנת (איור 2A). לאחר 6 ימים של מתיחה uniaxial העמסה טעינה מכנית, מטריצה החילוץ (ECM) ו התאים להתאים היו היטב (איור 2B). תאים היו מאוכלסים היטב העטוף ECM לאחר טעינת מכני. מורפולוגיה התא הוצגה להיות מוארך הי...

Discussion

. הגיד הוא רקמת חיבור סיבי מכונאי על פי המחקר הקודם, הטעינה מכני עודף עלול להוביל הבידול אוסטגניים של תאי גזע גיד, בעוד טעינה מספקת יוביל מבנה סיבים מחוסר סדר קולגן במהלך בידול הגיד²¹.

השקפה משותפת היא כי המפתח ביוריאקטור אידיאלי הוא היכולת לדמות את הסביבה מיקרו ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-aldrich	PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS)	Gibcoä by Life Technologies	1908361
Histology processor	Leica	TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM)	Gibcoä by Life Technologies	2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell			Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde	Sigma-aldrich	441244
Streptomycin and penicillin mixture	Gibcoä by Life Technologies	15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System	Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia		Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin	Gibcoä by Life Technologies	1858331