Applicazione di un sistema di bioreattore tridimensionale di stimolazione meccanica uniassiale per indurre la differenziazione tenogena delle cellule staminali derivate da Tendon

Riepilogo

Un sistema di bioreattore di stimolazione meccanica uniassiale tridimensionale è un bioreattore ideale per la differenziazione tenogenica-specifica delle cellule staminali derivate dal tendine e della formazione neo-tendina.

Abstract

La tendinopatia è una comune malattia cronica del tendine a cui si tratta di infiammazione e degenerazione in un'area ortopedica. Con un'elevata morbilità, una limitata capacità di auto-riparazione e, soprattutto, senza trattamenti definitivi, la tendinopatia influenza ancora negativamente la qualità della vita dei pazienti. Le cellule staminali derivate dal tendone (TDSC), come cellule precursori primarie delle cellule tendisuotiche, svolgono un ruolo essenziale sia nello sviluppo della tendinopatia, sia nel ripristino funzionale e strutturale dopo la tendinopatia. Pertanto, sarebbe utile un metodo che può in vitro imitare la differenziazione in vivo dei TDSC nelle cellule tendinee. Qui, il presente protocollo descrive un metodo basato su un sistema di stretching uniaxial tridimensionale (3D) per stimolare i TDSC a differenziarsi in tessuti simili a quelli tendoni. Ci sono sette stadi del protocollo attuale: isolamento dei topi TDSC, coltura ed espansione dei topi TDSC, preparazione del mezzo di coltura della stimolazione per la formazione di lamiere cellulari, formazione di lamiere cellulari mediante stimolazione in media, preparazione del costrutto di cellule staminali del tendine 3D, assemblaggio del complesso di stimolazione meccanica che si estende uniaxial e valutazione del tessuto tendineo stimolato meccanicamente stimolato in vitro. L'efficacia è stata dimostrata dall'istologia. L'intera procedura richiede meno di 3 settimane. Per promuovere la deposizione di matrici extracellulari, è stato utilizzato 4,4 mg/mL di acido ascorbico nel mezzo di coltura della stimolazione. Una camera separata con un motore lineare fornisce un carico meccanico accurato ed è portatile e facilmente regolabile, che viene applicato per il bioreattore. Il regime di carico nel protocollo attuale era di 4%, 0,25 Hz, 8 h, seguito da 16 h resto per 6 giorni. Questo protocollo potrebbe imitare la differenziazione cellulare nel tendine, che è utile per lo studio del processo patologico di tendinopatia. Inoltre, il tessuto tendineo è potenzialmente utilizzato per promuovere la guarigione del tendine in lesioni tendinee come un innesto autologo ingegnerizzato. Per riassumere, l'attuale protocollo è semplice, economico, riproducibile e valido.

Introduzione

La tendinopatia è una delle lesioni sportive comuni. Si manifesta principalmente da dolore, gonfiore locale, diminuzione della tensione muscolare nella zona interessata, e disfunzione. L'incidenza della tendinopatia è elevata. La presenza di achille tendinopatia è più comune per i corridori di media e lunga distanza (fino al 29%), mentre la presenza di tendinopatia rotutare è anche alta negli atleti di pallavolo (45%), basket (32%), atletica leggera (23%), pallamano (15%) e calcio (13%)^{1 ,2,,,3,4.} Tuttavia, a causa della limitata capacità di autoguarigione del tendine e della mancanza di trattamenti efficaci, la tendinopatia influenza ancora negativamente la vita dei pazienti^6,7. Inoltre, la patogenesi della tendinopatia rimane poco chiara. Ci sono state molte indagini sulla sua patogenesi, principalmente tra cui "teoria dell'infiammazione", "teoria della degenerazione", "teoria dell'uso eccessivo", e così via⁸. Attualmente, molti ricercatori credevano che la tendinopatia fosse dovuta al fallimento dell'autoriparazione ai microlesioni causati da un carico meccanico eccessivo delle esperienze tendineee^9,10.

Le cellule staminali derivate dal tendone (TDSC), come cellule precursori primarie delle cellule tendiche, svolgono un ruolo essenziale nello sviluppo della tendinopatia e del ripristino funzionale e strutturale dopo la tendinopatia^11,12,13. È stato riferito che la stimolazione meccanica dello stress potrebbe causare la proliferazione e la differenziazione di osteociti, osteoblasti, cellule muscolari lisce, fibroblasti, cellule staminali mesenchymal e altre cellule sensibili alla forza^14,15^,1616,17,18. Pertanto, i TDSC, come una delle cellule meccanosensibili e multipotenti, possono essere stimolati a differenziarsi con il caricamento meccanico^19,20.

Tuttavia, diversi parametri di caricamento meccanico (forza di caricamento, frequenza di caricamento, tipo di caricamento e periodo di caricamento) possono indurre i TDSC a differenziarsi in diverse celle²¹. Pertanto, un regime di carico meccanico efficace e valido è molto significativo per la tenogenesi. Inoltre, esistono diversi tipi di bioreattori come sistemi di stimolazione attualmente utilizzati per fornire carico meccanico ai TDSC. I principi di ogni tipo di bioreattore sono diversi, quindi anche i parametri di caricamento meccanico corrispondenti ai diversi bioreattori sono diversi. Pertanto, è richiesto un protocollo di stimolazione semplice, economico e riproducibile, che include il tipo di bioreattore, il mezzo di stimolazione corrispondente e il regime di carico meccanico.

Il presente articolo descrive un metodo basato su un sistema di stretching uniassiale tridimensionale (3D) per stimolare i TDSC a differenziarsi in tessuto tendineo. Ci sono sette fasi del protocollo: isolamento dei topi TDSC, coltura ed espansione dei topi TDSC, preparazione del mezzo di coltura di stimolazione per la formazione di lamiere cellulari, formazione di lamiere cellulari mediante coltura nel mezzo di stimolazione, preparazione del costrutto di cellule staminali 3D, assemblaggio del complesso di stimolazione meccanica allungamento uniaxiale e valutazione del tessuto tendineo stimolato meccanicamente stimolato in vitro. L'intera procedura richiede meno di 3 settimane per ottenere il costrutto di cella 3D, che è molto meno di alcuni metodi esistenti^22,23. Il presente protocollo ha dimostrato di essere in grado di indurre i TDSC a differenziarsi in tessuto tendineo, ed è più affidabile dell'attuale sistema di stretching bidimensionale (2D) comunemente usato²¹. L'efficacia è stata dimostrata dall'istologia. In breve, il presente protocollo è semplice, economico, riproducibile e valido.

Protocollo

I metodi descritti sono stati approvati ed eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti del Comitato Etico Animale dell'Università dell'Australia Occidentale.

1. Isolamento dei topi TDSC

1. Eutanasia i topi C57BL/6 di 6-8 settimane da lussazione cervicale.
2. Tendini rotulare di raccolta²⁴ e tendini di Achille²⁵.
3. Tendini digerivi da uno con 6 mL di collagenasi di tipo I (3 mg/mL) per 3 h.
   NOTA: Poiché la dimensione del tendine nel mouse è piccola, tutti i tendini raccolti da un topo devono essere utilizzati in questo passaggio.
4. Raccogliere le cellule e la coltura in minimal Essential Medium (Alpha-MEM) contenente il 10% del siero bovino fetale (FBS) e l'1% della miscela di streptomicina e penicillina per 7 giorni.
5. Identificare i TDSC utilizzando l'ordinamento delle celle attivate dalla fluorescenza per citometria di flusso (espressione di marcatori di superficie cellulare tra cui CD44, CD90 e Sca-1; mancanza dell'espressione di CD34 e CD45).
6. Passaggio e congelamento delle celle (passaggio 4 celle saranno utilizzati per ulteriori passi).

2. Cultura ed espansione dei topi TDSC

NOTA: Condurre tutti i passaggi in un cappuccio sterile per la biosicurezza.

1. Prendere le cellule riscaldate (topi TDSC, 1 milione di cellule, passaggio 4, a 37 gradi centigradi).
2. Aggiungere lentamente 4-5 mL di minimo minimo medio essenziale completo (Alpha-MEM).
3. Trasferire la miscela in un tubo di centrifuga di 15 mL con una pipetta.
4. Ricaricare con un totale medio-alto 8 mL con una pipetta.
   1. Mezzo preriscaldato in un'incubatrice da forno a 37 gradi centigradi.
5. Collocare il tubo in centrifuga ed equilibrio.
6. Centrifuga e pellet a 347 x g per 5 min.
7. Estrarre dopo la centrifuga e controllare il pellet nella parte inferiore.
8. Decant il mezzo di congelamento, e resospendere le cellule delicatamente in 1-2 mL di mezzo completo (evitare di fare troppe bolle).
9. Trasferire le cellule risospese su un flacone T-75 da una pipetta.
10. Utilizzare una pipetta per aggiungere alfa-MEM mezzo completo al pallone per raggiungere un volume totale di 10 mL con concentrazione finale di 13.000 cellule/cm².
11. Collocare il flacone nell'incubatrice e nella coltura a 37 gradi centigradi con il 5% di CO_2.
12. Cambiare il mezzo ogni 3 giorni.
13. Osservare e monitorare le cellule al microscopio quando si cambia il mezzo fino a quando le cellule vengono coltivate al 100% di confluenza (circa 40.000 cellule/cm²).

3. Preparazione del mezzo di coltura di stimolazione per la formazione di fogli cellulari

NOTA: Condurre tutti i passaggi in un cappuccio sterile per la biosicurezza.

1. Versare 15 mL di mezzo Alpha-MEM completo in un tubo sterile da 15 mL.
2. Aggiungere 6 ldi di acido ascorbico (11 mg/mL) in 15 mL di mezzo per una concentrazione finale di 4,4 g/mL.
   NOTA: Inoltre l'aggiunta di 25 fattore di crescita del tessuto connettivo ng/mL nel mezzo di stimolazione della coltura può accelerare l'intero processo di crescita e differenziazione.
3. Mescolare delicatamente invertendo su e giù.

4. Formazione di fogli cellulari mediante coltura nel mezzo di stimolazione

NOTA: Condurre tutti i passaggi in un cappuccio sterile per la biosicurezza.

1. Eliminare con attenzione il normale mezzo alfa-MEM completo ed evitare di toccare le cellule attaccate alla parte inferiore del pallone.
2. Aggiungere 10 mL di mezzo di stimolazione lentamente ed evitare di causare qualsiasi disturbo alle cellule completamente confluenti.
3. Cultura le cellule in mezzo di stimolazione per 9 giorni (cambiare il mezzo ogni 3 giorni) per generare sufficientemente il foglio cellulare a 37 sC con 5% CO₂.
   NOTA: La matrice extracellulare diventerà spessa e presente per essere torbida se osservata dal fondo del pallone dopo essere stimolata dall'acido ascorbico, il che significa che il foglio cellulare è sufficientemente generato.

5. Preparazione del costrutto di cellule staminali del tendine 3D

NOTA: Condurre tutti i passaggi in un cappuccio sterile per la biosicurezza.

1. Togliere la fiaschetta dall'incubatrice.
2. Scartare completamente il mezzo di stimolazione.
3. Lavare il foglio cellulare monostrato con il buffer salina fosfato (PBS) ruotando il pallone.
4. Eliminare completamente il PBS.
5. Utilizzare una pipetta per aggiungere 1 mL di 0,25% di prova nell'angolo del pallone.
6. Tocca l'angolo del pallone per defissare il foglio cellulare del monostrato finché l'angolo del foglio cellulare non si trova fuori dalla parte inferiore del pallone.
7. Aggiungere immediatamente 9 mL di mezzo Alpha-MEM completo per arrestare la ritentatizzazione.
8. Continuare a turbinare il pallone per staccare completamente il foglio cellulare monostrato.
9. Versare il foglio di cellule totale disattaccato in un piatto Petri con mezzo.
10. Utilizzare una pinzetta sterile per raccogliere un angolo del foglio cellulare e ruotare in senso orario per 15 volte.
11. Raccogliere un'altra estremità del foglio cellulare e ruotare in senso antiorario per 10 volte per generare saldamente un costrutto in vitro simile a un tendine (Figura 1A).

6. Assemblaggio del complesso di stimolazione meccanica che si estende in un unico bioreattore progettato

NOTA: Condurre tutti i passaggi in un cappuccio sterile per la biosicurezza.

1. Collegare i ganci dal collegatore e regolare alla distanza desiderata (2 cm) tra due ganci.
2. Avvolgere delicatamente il costrutto TDSCs 3D sul gancio assemblato per 3 volte su ogni gancio (Figura 1B).
3. Fissare i ganci con il costrutto cellulare sulla camera del bioreattore stringendo le viti su due estremità.
   NOTA: L'intera camera, comprese le viti e i ganci, è sterile (autoclave per 1,5 h a 134 gradi centigradi e i raggi ultravioletti (UV) espongono per 24 ore prima dell'uso). Per il supporto metallico delle camere, la luce UV espongono per 48 ore prima dell'uso.
4. Riempi la camera con un supporto Alpha-MEM completo.
5. Collegare l'attuatore alla camera di coltura via cavo.
6. Tagliare il collegatore ganci da forbici sterili.
7. Accendere l'alimentazione e il controller di canale corrispondente per avviare la stimolazione meccanica.
8. Metti il coperchio sulla camera.
9. Controllare le luci dell'indicatore e assicurarsi che il bioreattore possa funzionare correttamente.
10. Mettere il bioreattore nell'incubatrice e sottoporre il costrutto di cellule 3D allo stretching meccanico per 6 giorni (6% stretching, 0,25 Hz, 8 h, seguito da 16 h di riposo).

7. Valutazione del tessuto meccanico stimolato in vitro simile a un tendine

1. Allentare le viti con un cacciavite e togliere l'assemblaggio con attenzione.
2. Mettere il tessuto tendineo-come in 4% paraformaldeide per la fissazione per 15 min.
3. Collocare il tessuto tipo tendineo fisso in una cassetta di biopsia con cuscinetti di schiuma biopsia.
4. Processo per disidratare il campione e infine valutare con colorazione istologica H&E.
5. Ripetere l'intero protocollo ed estrarre l'RNA dal tessuto tendineo per valutare l'espressione dei marcatori tenogenici mediante PCR quantitativo (qPCR). I Primer per i geni selezionati sono elencati nella Tabella 1.
   NOTA: il protocollo di istologia e il protocollo qPCR sono standard e seguono uno studio precedente²¹.

Risultati

Prima della stimolazione meccanica, i TDSC erano cresciuti al 100% di confluenza in mezzo completo e mostravano una morfologia ultrastrutturale disorganizzata (Figura 2A). Dopo 6 giorni di carico meccanico di stretching uniassiale, matrice extracellulare (ECM) e allineamenti cellulari erano ben orientati (Figura 2B). Le celle erano ben popolate e ben avvolte in ECM dopo il caricamento meccanico. La morfologia cellulare è stata presentata per essere allungata ed era più simile alla norm...

Discussione

Il tendine è un tessuto connettivo fibroso meccanosensibile. Secondo precedenti ricerche, l'eccesso di carico meccanico potrebbe portare a differenziazione osteogenica delle cellule staminali del tendine, mentre un carico insufficiente porterebbe a una struttura disordinata della fibra di collagene durante la differenziazione del tendine²¹.

Una visione comune è che la chiave per un bioreattore ideale è la capacità di simulare il microambiente cellulare in vitro a cu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-aldrich	PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS)	Gibcoä by Life Technologies	1908361
Histology processor	Leica	TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM)	Gibcoä by Life Technologies	2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell			Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde	Sigma-aldrich	441244
Streptomycin and penicillin mixture	Gibcoä by Life Technologies	15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System	Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia		Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin	Gibcoä by Life Technologies	1858331