힘줄 유래 줄기 세포의 세포 분화를 유도하기 위해 3차원 동축 기계 자극 생물 반응기 시스템을 적용

요약

3차원 단방향 기계적 자극 생물반응기 시스템은 힘줄 유래 줄기 세포 및 신힘주 형성의 테노겐 특이적 분화를 위한 이상적인 생물반응기입니다.

초록

텐디노병증은 정형 외과 지역에서 염증과 변성과 관련된 일반적인 만성 힘줄 질환입니다. 높은 이환율, 제한된 자기 수리 능력, 그리고 가장 중요한 것은, 확실한 처리가 없는, 힘병증은 아직도 환자의 삶의 질을 부정적으로 영향을 미칩니다. 힘줄 세포의 1 차전구세포로서 힘줄 유래 줄기 세포(TDSC)는 힘줄병증의 발달과 힘줄병증 후기능및 구조적 복원 모두에서 필수적인 역할을 한다. 따라서, 시험관 내에서 TDSC의 생체 내 분화를 힘줄 세포로 모방할 수 있는 방법이 유용할 것이다. 여기서, 본 프로토콜은 TDSC를 자극하는 3차원(3D) 단종 스트레칭 시스템을 기반으로 하는 방법을 설명하여 힘줄과 같은 조직으로 분화한다. 현재 프로토콜의 7단계가 있다: 마우스 TDSC의 분리, 마우스 TDSC의 배양 및 확장, 세포 시트 형성을 위한 자극 배양 배지의 준비, 자극 매체에서 배양하여 세포 시트 형성, 3D 힘줄 줄기 세포 구성의 준비, 단축 스트레칭 기계 자극 복합체의 조립, 및 생체 외 조직과 같은 기계적 자극의 평가. 그 효과는 히스토로지에 의해 입증되었다. 전체 절차는 3주 미만이 소요됩니다. 세포외 매트릭스 증착을 촉진하기 위해, 4.4 mg/mL 아스코르브산은 자극 배양 배지에 사용되었다. 선형 모터가 있는 분리된 챔버는 정확한 기계적 적재를 제공하며 이식성이 뛰어나고 쉽게 조절되어 생물 반응기에 적용됩니다. 본 프로토콜의 로딩 정권은 6% 변형, 0.25Hz, 8h, 6일 동안 16h 휴게되었다. 이 프로토콜은 힘줄에서 세포 분화를 모방 할 수 있으며, 이는 건병증의 병리학 적 과정을 조사하는 데 도움이됩니다. 더욱이, 힘줄 같이 조직은 잠재적으로 조작된 자가 이식으로 힘줄 상해에 있는 힘줄 치유를 승진시키기 위하여 이용됩니다. 요약하자면, 현재 프로토콜은 간단하고 경제적이며 재현 가능하며 유효합니다.

서문

텐디노병증은 일반적인 스포츠 부상 중 하나입니다. 그것은 주로 통증에 의해 명시, 로컬 붓기, 영향 받는 지역에 근육 긴장 감소, 그리고 기능 장애. 건공병증의 부각은 높다. 아킬레스건병증의 존재는 중장거리 주자(최대 29%)에게 가장 흔한 반면, 슬개골 건비병증의 존재는 배구(45%), 농구(32%), 육상(23%), 핸드볼(15%), 축구(13%)^{1,,2,,3,,4,,5등에서도}높다. 그러나, 힘줄의 제한된 자기 치유 능력, 효과적인 치료의 부족으로 인해, 힘병증은 여전히 환자의 삶에 부정적인 영향을^6,,7. 더욱이, 건근병증의 병인은 불분명합니다. 주로 '염증론', '변성론', '남용이론', '남용이론' 등 발병기발병에 대한 많은 조사가^있었다. 현재, 많은 연구자들은 힘줄 경험^9,,10과함께 과도한 기계적 적재로 인한 미세 부상에 대한 자가 수리에 실패한 것으로 판단했다.

힘줄 세포의 1차 전구체 세포로서 힘줄 유래 줄기 세포(TDSC)는^,건반병증^11,,12,13이후의 건근병증 및 기능적 및 구조적 복원의 발달 모두에서 필수적인 역할을 한다. 기계적 스트레스 자극은 골세포, 골세포, 매끄러운 근육 세포, 섬유아세포, 중간엽줄기세포 및 기타 힘에 민감한 세포^{14,,15,,16,,17,,18의}증식 및 분화를 일으킬 수 있다고 보고되었다. 따라서, TDSC는, 메카노민감성 및 다능성 세포 중 하나로서, 기계적^{적재(19,,20)로}분화하도록 유사하게 자극될 수 있다.

그러나, 다른 기계적 적재 파라미터(적재 강도, 하중 주파수, 적재 유형 및 적재 기간)는 TDSC를 유도하여 다른^{셀(21)으로}분화하도록 유도할 수 있다. 따라서 효과적이고 유효한 기계적 로딩 정권은 tenogenesis에 매우 중요합니다. 또한 현재 TDSC에 기계적 로딩을 제공하는 데 사용되는 자극 시스템으로 다양한 종류의 생물 반응기가 있습니다. 생물 반응기의 각 종류의 원리는 다르므로 다른 생물 반응기에 대응하는 기계적 적재 매개 변수도 다릅니다. 따라서, 간단하고 경제적이며 재현 가능한 자극 프로토콜은 생물 반응기의 유형, 해당 자극 매체 및 기계적 적재 체제를 포함하는 수요가 있다.

본 기사는 TDSC를 자극하여 힘줄과 같은 조직으로 분화하는 3차원(3D) 항축 스트레칭 시스템을 기반으로 하는 방법을 설명합니다. 프로토콜의 7단계가 있다: 마우스 TDSC의 격리, 마우스 TDSC의 배양 및 확장, 세포 시트 형성을 위한 자극 배양 배지의 준비, 자극 매체에서 배양하여 세포 시트 형성, 3D 힘줄 줄기 세포 생성의 준비, 단축 스트레칭 기계 자극 복합체의 조립, 및 시험관 조직과 같은 기계적 자극의 평가. 전체 절차는 3D 세포 구조를 얻는 데 3 주 미만이 걸리며, 이는 일부 기존^{방법(22,,23)보다}훨씬 적습니다. 본 프로토콜은 TDSC를 힘줄 조직으로 분화하도록 유도할 수 있는 것으로 입증되었으며, 현재 일반적으로 사용되는 2차원(2D) 스트레치^{시스템(21)보다}더 신뢰할 수 있다. 그 효과는 히스토로지에 의해 입증되었다. 요컨대, 현재 프로토콜은 간단하고 경제적이며 재현 가능하며 유효합니다.

프로토콜

설명된 방법은 웨스턴 오스트레일리아 동물 윤리 위원회의 지침 및 규정에 따라 승인되고 수행되었습니다.

1. 마우스 TDSC의 격리

1. 자궁 경부 탈구에 의해 6-8 주 된 C57BL/6 마우스를 안락사.
2. 수확 슬개골 힘줄⁽²⁴ 및 아킬레스 건²⁵⁾
3. 3 시간 동안 6 mL 타입 I 콜라게나아제 (3 mg/mL)를 가진 하나에서 힘줄을 소화합니다.
   참고: 마우스의 힘줄 크기가 작기 때문에 한 마우스에서 수확한 모든 힘줄은 이 단계에서 사용해야 합니다.
4. 태아 소 혈청 (FBS)의 10 %와 7 일 동안 연쇄상 구균 및 페니실린 혼합물의 1 %를 포함하는 완전한 최소한의 필수 매체 (알파-MEM)에서 세포와 배양을 수집합니다.
5. 유동 세포측정(CD44, CD90 및 Sca-1을 포함한 세포 표면 마커의 발현; CD34 및 CD45의 발현 부족)에 의한 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여 TDSC를 식별합니다.
6. 통로 및 동결 셀(통로 4 세포는 추가 단계에 사용됩니다).

2. 마우스 TDSC의 문화 및 확장

참고: 멸균 생물 안전 후드의 모든 단계를 수행합니다.

1. 워밍업 세포(마우스 TDSC, 100만 개의 세포, 통로 4, 37°C)를 섭취하십시오.
2. 4-5mL의 완전한 최소 필수 매체(알파-MEM)를 천천히 추가합니다.
3. 파이펫으로 혼합물을 15mL 원심분리기 튜브로 옮기다.
4. 파이펫으로 중간~ 8mL 합계로 위로 올려보있습니다.
   1. 37°C 오븐 인큐베이터에서 미리 웜 배지.
5. 튜브를 원심분리기와 균형에 넣습니다.
6. 원심분리기 및 펠릿 세포는 347 x g에서 5분 동안.
7. 원심분리기 후에 꺼내 서 하단에 펠릿을 확인 합니다.
8. 동결 배지를 데킹하고, 완전한 배지의 1-2 mL에서 부드럽게 세포를 다시 중단한다(너무 많은 거품을 만들지 마십시오).
9. 리펜시드 셀을 파이펫으로 T-75 플라스크로 옮기습니다.
10. 파이펫을 사용하여 플라스크에 완전한 알파-MEM 배지를 추가하여 13,000개의 세포/cm^2의최종 농도로 총 10mL의 부피에 도달한다.
11. 플라스크를 인큐베이터와 배양에 넣고 37°C에서 5% CO_2로놓습니다.
12. 3일마다 매체를 변경합니다.
13. 세포가 100% 합류(약 40,000세포/cm^2)로배양될 때까지 배지를 변경할 때 현미경으로 세포를 관찰하고 모니터링한다.

3. 세포 시트 형성을위한 자극 배양 배지의 준비

참고: 멸균 생물 안전 후드의 모든 단계를 수행합니다.

1. 15mL 멸균 튜브에 완전한 알파-MEM 배지 15mL를 붓습니다.
2. 4.4 μg/mL의 최종 농도를 위해 15mL의 배지에 아스코르브산(11 mg/mL)의 6μL을 추가합니다.
   참고: 자극 배양 배지에 25 ng/mL 결합 조직 성장 인자를 추가하면 전체 성장 및 분화 과정을 가속화할 수 있습니다.
3. 위아래로 반전하여 부드럽게 섞는다.

4. 자극 배지에서 배양하여 세포 시트 형성

참고: 멸균 생물 안전 후드의 모든 단계를 수행합니다.

1. 일반 완전한 알파-MEM 배지를 신중하게 폐기하고 플라스크 바닥에 부착된 셀을 만지지 마십시오.
2. 10mL의 자극 매체를 천천히 추가하고 완전히 응수된 세포에 방해를 주지 마십시오.
3. 9일 동안 자극 배지에서 세포를 배양하여(매3일마다 배지를 변경)하여 37°C에서 셀 시트를 5%_CO2로충분히 생성한다.
   참고: 세포외 매트릭스는 아스코르브산에 의해 자극된 후 플라스크 의 바닥에서 관찰될 때 두껍게 되고 현재가 흐리게 되며, 이는 세포 시트가 충분히 생성된다는 것을 의미합니다.

5. 3D 힘줄 줄기 세포 구조의 준비

참고: 멸균 생물 안전 후드의 모든 단계를 수행합니다.

1. 인큐베이터에서 플라스크를 꺼내십시오.
2. 자극 매체를 완전히 폐기하십시오.
3. 플라스크를 소용돌이시켜 인산염 완충식염(PBS)으로 단층 셀 시트를 세척합니다.
4. PBS를 완전히 폐기하십시오.
5. 파이펫을 사용하여 플라스크 모서리에 0.25% 트립신 1mL을 추가합니다.
6. 플라스크의 모서리를 탭하여 단층 셀 시트의 모서리가 플라스크의 바닥에서 벗어날 때까지 단층 셀 시트를 부착 해제합니다.
7. 트립시니화를 중지하려면 즉시 9mL의 완전한 알파-MEM 배지를 추가합니다.
8. 플라스크를 계속 소용돌이쳐 단층 셀 시트를 완전히 벗겨냅니다.
9. 부착되지 않은 총 셀 시트를 중간 크기의 페트리 접시에 붓습니다.
10. 멸균 트위저를 사용하여 셀 시트의 한 쪽 모서리를 선택하고 시계 방향으로 15회 회전합니다.
11. 셀 시트의 또 다른 끝을 선택하고 10회 반시계 방향으로 회전하여 힘줄과 같은 체외구성(도 1A)을단단히 생성한다.

6. 독특한 설계 생물 반응기의 단축 스트레칭 기계 자극 복합체의 조립

참고: 멸균 생물 안전 후드의 모든 단계를 수행합니다.

1. 커넥터로 후크를 연결하고 두 후크 사이에 원하는 거리(2cm)로 조정합니다.
2. 3D TDSC가 조립된 후크에서 3회 동안 각후크(그림 1B)에부드럽게 바람을 피습니다.
3. 두 끝에 나사를 조이어 생물 반응기의 챔버에 세포 구조로 후크를 고정합니다.
   참고: 나사와 후크를 포함한 전체 챔버는 멸균(134°C에서 1.5시간 동안 자동 클락을 사용하고 자외선(UV)은 사용하기 24시간 전에 노출됩니다. 챔버의 금속 홀더의 경우, UV 빛은 사용하기 전에 48 시간 동안 노출됩니다.
4. 완벽한 알파-MEM 배지로 챔버를 채웁니다.
5. 액추에이터를 케이블로 배양챔버에 연결합니다.
6. 멸균 가위로 후크 커넥터를 잘라냅니다.
7. 기계적 자극을 시작하려면 전원 및 해당 채널 컨트롤러를 켭막히게 합니다.
8. 뚜껑을 챔버에 놓습니다.
9. 표시등을 확인하고 생물 반응기가 제대로 작동할 수 있는지 확인합니다.
10. 생체 반응기를 인큐베이터에 넣고 3D 세포 구조를 기계적 스트레칭으로 6일 동안(6% 스트레칭, 0.25Hz, 8시간, 16h 휴식)한다.

7. 체외 힘줄과 같은 조직에서 자극된 기계적 평가

1. 드라이버로 나사를 풀고 조심스럽게 조립을 벗습니다.
2. 15 분 동안 고정을 위해 힘줄과 같은 조직을 4 % 파라 포름 알데히드에 넣습니다.
3. 고정 된 힘줄 같은 조직을 생검 폼 패드가있는 생검 카세트에 넣습니다.
4. 샘플을 탈수하고 마지막으로 H&E 조직학적 염색에 의해 평가되는 공정.
5. 정량적 PCR(qPCR)에 의한 테노겐성 마커의 발현을 평가하기 위한 힘줄과 같은 조직에서 전체 프로토콜을 반복하고 RNA를 추출한다. 선택된 유전자에 대한 프라이머는 표 1에나열됩니다.
   참고: 히스토로지 프로토콜 및 qPCR 프로토콜은 표준이며 이전^{연구(21)에}따른다.

결과

기계적 자극 전에 TDSC는 완전한 매체에서 100% 합류로 성장하여 무질서한 초구조적형태(도 2A)를표시하였다. 6일 간의 단종 스트레칭 기계적 하중 후, 세포외 매트릭스(ECM) 및 세포 정렬은 잘 지향되었다(도2B). 세포는 기계적 적재 후 ECM에 잘 채워지고 잘 포위되었습니다. 세포 형태는 길어지게 되어, 스트레칭없이 에 비해 정상 힘줄 세포와 더 유사하였다(도2C). ...

토론

힘줄은 메카노감과성 섬유성 결합 조직입니다. 이전 연구에 따르면, 과도한 기계적 적재는 힘줄 줄기 세포의 골성 분화로 이어질 수 있지만, 부전이 부족하면 힘줄^{분화(21)가}무질서한 콜라겐 섬유 구조로 이어질 수 있다.

일반적인 견해는 이상적인 생물 반응기의 열쇠는 생체 내 세포가 겪는 체외 세포 미세 환경을 시뮬레이션하는 능력입니다. 따라서, 시험?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-aldrich	PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS)	Gibcoä by Life Technologies	1908361
Histology processor	Leica	TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM)	Gibcoä by Life Technologies	2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell			Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde	Sigma-aldrich	441244
Streptomycin and penicillin mixture	Gibcoä by Life Technologies	15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System	Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia		Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin	Gibcoä by Life Technologies	1858331