Anwendung eines dreidimensionalen uniaxialen mechanischen Stimulations-Bioreaktorsystems zur Induzieren tenogener Differenzierung von tendonabgeleiteten Stammzellen

Zusammenfassung

Ein dreidimensionales uniaxiales mechanisches Stimulations-Bioreaktorsystem ist ein idealer Bioreaktor für tenogen-spezifische Differenzierung von Sehnenstammzellen und Neotendonbildung.

Zusammenfassung

Die Tendinopathie ist eine häufige chronische Sehnenerkrankung im Zusammenhang mit Entzündungen und Degeneration in einem orthopädischen Bereich. Mit hoher Morbidität, begrenzter Selbstreparaturkapazität und vor allem ohne definitive Behandlungen beeinflusst die Tendinopathie die Lebensqualität der Patienten immer noch negativ. Tendon-abgeleitete Stammzellen (TDSCs), als primäre Vorläuferzellen von Sehnenzellen, spielen eine wesentliche Rolle sowohl bei der Entwicklung der Teninopathie als auch bei der funktionellen und strukturellen Wiederherstellung nach der Tendinopathie. Daher wäre eine Methode nützlich, die in vitro die In-vivo-Differenzierung von TDSCs in Sehnenzellen imitieren kann. Hier beschreibt das vorliegende Protokoll eine Methode, die auf einem dreidimensionalen (3D) uniaxialen Dehnsystem basiert, um die TDSCs zu stimulieren, sich in sehnenartige Gewebe zu differenzieren. Es gibt sieben Stadien des vorliegenden Protokolls: Isolierung von Mäuse-TDSCs, Kultur und Ausdehnung von Mäuse-TDSCs, Vorbereitung von Stimulationskulturmedium für die Zellblattbildung, Zellblattbildung durch Kultivierung im Stimulationsmedium, Vorbereitung des 3D-Sehnenstammzellkonstrukts, Montage des uniaxial-dehnenden mechanischen Stimulationskomplexes und Auswertung des mechanisch stimulierten in vitro tendonähnlichen Gewebes. Die Wirksamkeit wurde durch histologische Gezeigt. Das gesamte Verfahren dauert weniger als 3 Wochen. Zur Förderung der extrazellulären Matrixabscheidung wurde 4,4 mg/ml Ascorbinsäure im Stimulationskulturmedium verwendet. Eine getrennte Kammer mit Linearmotor sorgt für eine genaue mechanische Beladung und ist tragbar und leicht einzustellen, was für den Bioreaktor gilt. Das Laderegime im vorliegenden Protokoll betrug 6% Dehnung, 0,25 Hz, 8 h, gefolgt von 16 h Ruhe für 6 Tage. Dieses Protokoll könnte die Zelldifferenzierung in der Sehne imitieren, was für die Untersuchung des pathologischen Prozesses der Teninopathie hilfreich ist. Darüber hinaus wird das sehnenähnliche Gewebe potenziell verwendet, um die Sehnenheilung bei Sehnenverletzungen als technisches autologes Transplantat zu fördern. Zusammenfassend ist das vorliegende Protokoll einfach, wirtschaftlich, reproduzierbar und gültig.

Einleitung

Tendinopathie ist eine der häufigsten Sportverletzungen. Es manifestiert sich vor allem durch Schmerzen, lokale Schwellung, verminderte Muskelverspannungen im betroffenen Bereich, und Dysfunktion. Die Inzidenz von Teninopathie ist hoch. Das Vorhandensein von Achillessehnenopathie ist am häufigsten bei Mittel- und Langstreckenläufern (bis zu 29%), während das Vorhandensein von Patellar-Tendinopathie ist auch bei Athleten von Volleyball (45%), Basketball (32%), Leichtathletik (23%), Handball (15%) und Fußball (13%)^1,2,3,4,5. Aufgrund der begrenzten Selbstheilungsfähigkeit der Sehne und des Mangels an wirksamen Behandlungen beeinflusst die Tendinopathie jedoch immer noch das Leben der Patienten negativ^6,7. Darüber hinaus bleibt die Pathogenese der Tendinopathie unklar. Es gab viele Untersuchungen über seine Pathogenese, vor allem einschließlich "Entzündungstheorie", "Degeneration Theorie", "Überbeanspruchung Theorie", und so weiter⁸. Derzeit glaubten viele Forscher, dass die Tendinopathie auf die fehlgeschlagene Selbstreparatur der Mikroverletzungen zurückzuführen ist, die durch übermäßige mechanische Belastung verursacht werden, die Sehnenerfahrungen^9,10.

Tendon-abgeleitete Stammzellen (TDSCs), als primäre Vorläuferzellen von Sehnenzellen, spielen eine wesentliche Rolle sowohl bei der Entwicklung der Tendinopathie als auch bei der funktionellen und strukturellen Restauration nach der Tendinopathie^11,12,13. Es wurde berichtet, dass mechanische Stressstimulation die Proliferation und Differenzierung von Osteozyten, Osteoblasten, glatten Muskelzellen, Fibroblasten, mesenchymalen Stammzellen und anderen kraftempfindlichen Zellen^{14,15,16,17,18}verursachen könnte. Daher können TDSCs als eine der mechanosensitiven und multipotenten Zellen ähnlich stimuliert werden, um durch mechanische Belastung^19,20zu differenzieren.

Unterschiedliche mechanische Belastungsparameter (Ladefestigkeit, Ladefrequenz, Ladeart und Ladezeit) können jedoch TDSCs dazu veranlassen, sich in verschiedene Zellen zu differenzieren²¹. Daher ist ein wirksames und gültiges mechanisches Belastungsregime für die Tenogenese von großer Bedeutung. Darüber hinaus gibt es verschiedene Arten von Bioreaktoren als Stimulationssysteme, die derzeit für die mechanische Beladung von TDSCs verwendet werden. Die Prinzipien jeder Art von Bioreaktor sind unterschiedlich, so dass auch die mechanischen Belastungsparameter, die verschiedenen Bioreaktoren entsprechen, unterschiedlich sind. Daher ist ein einfaches, wirtschaftliches und reproduzierbares Stimulationsprotokoll gefragt, einschließlich der Art des Bioreaktors, des entsprechenden Stimulationsmediums und des mechanischen Belastungsregimes.

Der vorliegende Artikel beschreibt eine Methode, die auf einem dreidimensionalen (3D) uniaxialen Dehnsystem basiert, um die TDSCs zu stimulieren, sich in sehnenartiges Gewebe zu differenzieren. Es gibt sieben Stadien des Protokolls: Isolierung von Mäuse-TDSCs, Kultur und Ausdehnung von Mäuse-TDSCs, Vorbereitung des Stimulationskulturmediums für die Zellblattbildung, Zellblattbildung durch Kultivierung im Stimulationsmedium, Vorbereitung des 3D-Sehnenstammzellkonstrukts, Montage des uniaxial-dehnenden mechanischen Stimulationskomplexes und Auswertung des mechanisch stimulierten in tendonähnlichen Gewebes. Das gesamte Verfahren dauert weniger als 3 Wochen, um das 3D-Zellkonstrukt zu erhalten, das weit kleiner ist als einige bestehende Methoden^22,23. Das vorliegende Protokoll ist nachweislich in der Lage, TDSCs dazu zu bringen, sich in Sehnengewebe zu differenzieren, und es ist zuverlässiger als das derzeit häufig verwendete zweidimensionale (2D) Dehnsystem²¹. Die Wirksamkeit wurde durch histologische Gezeigt. Kurz gesagt, das vorliegende Protokoll ist einfach, wirtschaftlich, reproduzierbar und gültig.

Protokoll

Die beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften der University of Western Australia Animal Ethics Committee genehmigt und durchgeführt.

1. Isolierung von Mäusen TDSCs

1. Euthanisieren Sie die 6-8 Wochen alten C57BL/6 Mäuse durch Zervixverrenkung.
2. Patellasehne²⁴ und Achillessehnen²⁵ernten.
3. Verdauungssehnen von einem mit 6 ml Typ I Kollagenase (3 mg/ml) für 3 h.
   HINWEIS: Da die Größe der Sehne in der Maus klein ist, sollten alle Sehnen, die von einer Maus geerntet werden, in diesem Schritt verwendet werden.
4. Sammeln Sie die Zellen und die Kultur in vollständig minimal Essential Medium (Alpha-MEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Streptomycin und Penicillin-Mischung für 7 Tage.
5. Identifizieren Sie TDSCs mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung durch Durchflusszytometrie (Expression von Zelloberflächenmarkern einschließlich CD44, CD90 und Sca-1; Fehlen der Expression von CD34 und CD45).
6. Durchgangs- und Gefrierzellen (Durchgang 4 Zellen werden für weitere Schritte verwendet).

2. Kultur und Ausbau von Mäuse-TDSCs

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer sterilen Biosicherheitshaube durch.

1. Nehmen Sie die aufgewärmten Zellen (Mäuse TDSCs, 1 Million Zellen, Durchgang 4, bis 37 °C).
2. Fügen Sie langsam zusätzliche 4-5 ml komplettes Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) hinzu.
3. Das Gemisch mit einer Pipette in ein 15 ml Zentrifugenrohr geben.
4. Aufladen mit einem Gesamtwert von bis zu 8 ml mit einer Pipette.
   1. Medium in einem 37 °C Ofen-Inkubator vorwärmen.
5. Das Rohr in Zentrifuge geben und ausgleichen.
6. Zentrifugen- und Pelletzellen bei 347 x g für 5 min.
7. Nach der Zentrifuge herausnehmen und das Pellet unten überprüfen.
8. Dekantieren Sie das Gefriermedium, und setzen Sie Zellen sanft in 1-2 ml des vollständigen Mediums (vermeiden Sie zu viele Blasen).
9. Übertragen Sie resuspendierte Zellen mit einer Pipette in einen T-75-Kolben.
10. Verwenden Sie eine Pipette, um dem Kolben ein vollständiges Alpha-MEM Medium hinzuzufügen, um ein Gesamtvolumen von 10 ml mit einer Endkonzentration von 13.000 Zellen/cm²zu erreichen.
11. Legen Sie den Kolben in den Inkubator und Kultur bei 37 °C mit 5%_CO2.
12. Ändern Sie das Medium alle 3 Tage.
13. Beobachten und überwachen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, wenn sie das Medium verändern, bis die Zellen zu 100% Zusammenfluss kultiviert werden (ca. 40.000 Zellen/cm²).

3. Vorbereitung des Stimulationskulturmediums für die Zellblattbildung

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer sterilen Biosicherheitshaube durch.

1. 15 ml komplettes Alpha-MEM-Medium in ein 15 ml steriles Rohr gießen.
2. Fügen Sie 6 l Ascorbinsäure (11 mg/ml) in 15 ml Medium für eine Endkonzentration von 4,4 g/ml hinzu.
   HINWEIS: Zusätzlich kann das Hinzufügen von 25 ng/ml Bindegewebswachstumsfaktor im Stimulationskulturmedium den gesamten Wachstums- und Differenzierungsprozess beschleunigen.
3. Mischen Sie sanft, indem Sie auf und ab.

4. Zellblattbildung durch Kultivierung im Stimulationsmedium

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer sterilen Biosicherheitshaube durch.

1. Entsorgen Sie das normale vollständige Alpha-MEM-Medium sorgfältig, und vermeiden Sie es, die am Boden des Kolbens befestigten Zellen zu berühren.
2. Fügen Sie 10 ml Stimulationsmedium langsam hinzu und vermeiden Sie Störungen der vollständig konfluenten Zellen.
3. Kultur die Zellen in Stimulationsmedium für 9 Tage (ändern Sie das Medium alle 3 Tage), um ausreichend das Zellblatt bei 37 °C mit 5%_CO2zu erzeugen.
   HINWEIS: Die extrazelluläre Matrix wird dick und wird von der Unterseite des Kolbens aus trüb, wenn sie durch Ascorbinsäure stimuliert wird, was bedeutet, dass das Zellblatt ausreichend erzeugt wird.

5. Vorbereitung des 3D-Sehnenstammzellkonstrukts

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer sterilen Biosicherheitshaube durch.

1. Nehmen Sie den Kolben aus dem Brutkasten.
2. Entsorgen Sie das Stimulationsmedium vollständig.
3. Waschen Sie das monolayer Zellblatt mit Phosphatpuffer-Saline (PBS), indem Sie den Kolben wirbeln.
4. Entsorgen Sie die PBS vollständig.
5. Verwenden Sie eine Pipette, um 1 ml 0,25% Trypsin in die Ecke des Kolbens hinzuzufügen.
6. Tippen Sie auf die Ecke des Kolbens, um das monolayer Zellblatt zu de-attachisieren, bis sich die Ecke des Zellblatts von der Unterseite des Kolbens befindet.
7. Fügen Sie sofort 9 ml komplettes Alpha-MEM-Medium hinzu, um die Trypsinisierung zu stoppen.
8. Den Kolben weiter wirbeln, um das monolayer Zellblatt vollständig abzuziehen.
9. Gießen Sie das gesamte de-attached Zellblatt in eine Petrischale mit Medium.
10. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um eine Ecke des Zellblatts aufzunehmen und 15 Mal im Uhrzeigersinn zu drehen.
11. Nehmen Sie ein anderes Ende des Zellblattes auf und drehen Sie 10 Mal gegen den Uhrzeigersinn, um fest ein sehnenartiges In-vitro-Konstrukt zu erzeugen (Abbildung 1A).

6. Montage des uniaxial-dehnenden mechanischen Stimulationskomplexes in einem einzigartigen Bioreaktor

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer sterilen Biosicherheitshaube durch.

1. Schließen Sie die Haken durch den Anschluss an und stellen Sie sich auf den gewünschten Abstand (2 cm) zwischen zwei Haken ein.
2. Wickeln Sie die 3D-TDSCs an jedem Haken 3 Mal lang auf dem montierten Haken (Abbildung 1B).
3. Sichern Sie die Haken mit Zellkonstrukt auf die Kammer des Bioreaktors, indem Sie die Schrauben an zwei Enden anziehen.
   HINWEIS: Die gesamte Kammer, einschließlich Schrauben und Haken, ist steril (Autoklav für 1,5 h bei 134 °C und UV-Strahlen für 24 Stunden vor Gebrauch belichten). Für den Metallhalter von Kammern, UV-Licht für 48 Stunden vor Gebrauch belichten.
4. Füllen Sie die Kammer mit komplettem Alpha-MEM-Medium.
5. Verbinden Sie den Aktuator über Kabel mit der Kulturkammer.
6. Schneiden Sie die Haken Connecter durch sterile Schere.
7. Schalten Sie die Stromversorgung und den entsprechenden Kanalregler ein, um die mechanische Stimulation zu starten.
8. Legen Sie den Deckel auf die Kammer.
9. Überprüfen Sie die Kontrollleuchten und stellen Sie sicher, dass der Bioreaktor ordnungsgemäß funktionieren kann.
10. Legen Sie den Bioreaktor in den Inkubator und unterziehen Sie das 3D-Zellkonstrukt 6 Tage lang einer mechanischen Dehnung (6% Dehnung, 0,25 Hz, 8 h, gefolgt von 16 h Pause).

7. Bewertung des mechanisch stimulierten In-vitro-Sehnengewebes

1. Lösen Sie die Schrauben mit einem Schraubendreher und nehmen Sie die Montage vorsichtig ab.
2. Setzen Sie das sehnenartige Gewebe in 4% Paraformaldehyd zur Fixierung für 15 min.
3. Legen Sie das fixierte sehnenartige Gewebe in eine Biopsiekassette mit Biopsieschaumpads.
4. Verfahren zur Dehydrierung der Probe und schließlich Zur Bewertung durch h&E histologische Färbung.
5. Wiederholen Sie das gesamte Protokoll und extrahieren Sie RNA aus dem sehnenähnlichen Gewebe, um die Expression tenogener Marker durch quantitative PCR (qPCR) zu bewerten. Primer für die ausgewählten Gene sind in Tabelle 1aufgeführt.
   HINWEIS: Histology-Protokoll und qPCR-Protokoll sind Standard und folgen einer früheren Studie²¹.

Ergebnisse

Vor der mechanischen Stimulation wurden TDSCs in vollständigem Medium auf 100 % Zusammenfluss angewachsen und zeigten eine unorganisierte ultrastrukturelle Morphologie (Abbildung 2A). Nach 6 Tagen uniaxialer Dehnung waren mechanische Belastung, extrazelluläre Matrix (ECM) und Zellausrichtungen gut ausgerichtet (Abbildung 2B). Die Zellen waren gut bestückt und nach mechanischer Beladung gut in ECM eingehüllt. Die Zellmorphologie wurde als länsiert dargestellt und ähnelte eher der no...

Diskussion

Die Sehne ist ein mechanosensitives faseriges Bindegewebe. Früheren Untersuchungen zufolge könnte eine übermäßige mechanische Belastung zu einer osteogenen Differenzierung von Sehnenstammzellen führen, während eine unzureichende Belastung zu einer gestörten Kollagenfaserstruktur während der Sehnendifferenzierung führen würde²¹.

Eine allgemeine Ansicht ist, dass der Schlüssel zu einem idealen Bioreaktor die Fähigkeit ist, die in vitro zelluläre Mikroumgebun...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-aldrich	PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS)	Gibcoä by Life Technologies	1908361
Histology processor	Leica	TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM)	Gibcoä by Life Technologies	2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell			Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde	Sigma-aldrich	441244
Streptomycin and penicillin mixture	Gibcoä by Life Technologies	15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System	Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia		Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin	Gibcoä by Life Technologies	1858331