Aplicando um sistema bioreator de estimulação mecânica uniaxial tridimensional para induzir a diferenciação tenogênica de células-tronco derivadas do tendão

Resumo

Um sistema bioreator de estimulação mecânica uniaxial tridimensional é um bioreator ideal para diferenciação tenogênica específica de células-tronco derivadas do tendão e formação de neo-tendões.

Resumo

Tendinopatia é uma doença crônica comum relacionada à inflamação e degeneração em uma área ortopédica. Com alta morbidade, capacidade limitada de auto-reparação e, o mais importante, sem tratamentos definitivos, a tendinopatia ainda influencia negativamente a qualidade de vida dos pacientes. As células-tronco derivadas do tendão (TDSCs), como células precursoras primárias das células tendinosas, desempenham um papel essencial tanto no desenvolvimento da tendinopatia, quanto na restauração funcional e estrutural após a tendinopatia. Assim, um método que pode imitar in vitro a diferenciação in vivo de TDSCs em células tendinosas seria útil. Aqui, o presente protocolo descreve um método baseado em um sistema de alongamento uniaxial tridimensional (3D) para estimular os TDSCs a se diferenciarem em tecidos semelhantes a tendões. São sete estágios do presente protocolo: isolamento de TDSCs camundongos, cultura e expansão de TDSCs de camundongos, preparação de meio de cultura de estimulação para formação de folhas de células, formação de folhas de células por cultivo em meio de estimulação, preparação de construção de células-tronco tendinosas 3D, montagem do complexo de estimulação mecânica de alongamento uniaxial e avaliação do tecido mecânico estimulado in vitro como tendão. A eficácia foi demonstrada pela histologia. Todo o procedimento leva menos de 3 semanas. Para promover a deposição da matriz extracelular, utilizou-se ácido ascórbico de 4,4 mg/mL no meio da cultura de estimulação. Uma câmara separada com motor linear fornece carregamento mecânico preciso e é portátil e facilmente ajustada, que é aplicada para o bioreator. O regime de carregamento no presente protocolo foi de 6% de tensão, 0,25 Hz, 8h, seguido de repouso de 16h durante 6 dias. Esse protocolo poderia imitar a diferenciação celular no tendão, o que é útil para a investigação do processo patológico da tendinopatia. Além disso, o tecido semelhante ao tendão é potencialmente usado para promover a cicatrização do tendão na lesão tendinosa como um enxerto autólogo projetado. Resumindo, o presente protocolo é simples, econômico, reproduzível e válido.

Introdução

Tendinopatia é uma das lesões esportivas comuns. Manifesta-se principalmente por dor, inchaço local, diminuição da tensão muscular na área afetada e disfunção. A incidência de tendinopatia é alta. A presença de tendinopatia de Aquiles é mais comum para corredores de média e longa distância (até 29%), enquanto a presença de tendinopatia patelar também é alta em atletas de vôlei (45%), basquete (32%), atletismo (23%), handebol (15%) e futebol (13%)^1,2,,3,,4,5. No entanto, devido à limitada capacidade de auto-cura do tendão e à falta de tratamentos eficazes, a tendinopatia ainda influencia negativamente a vida dos pacientes^6,7. Além disso, a patogênese da tendinopatia permanece incerta. Tem havido muitas investigações sobre sua patogênese, principalmente incluindo "teoria da inflamação", "teoria da degeneração", "teoria do uso excessivo", e assim por diante⁸. Atualmente, muitos pesquisadores acreditavam que a tendinopatia era devido à falha no auto-reparo das micro-lesões causadas pelo carregamento mecânico excessivo das experiências tendinosas^9,,10.

As células-tronco derivadas do tendão (TDSCs), como células precursoras primárias das células tendinosas, desempenham um papel essencial tanto no desenvolvimento da tendinopatia quanto na restauração funcional e estrutural após tendinopatia^11,,12,,13. Foi relatado que a estimulação do estresse mecânico poderia causar a proliferação e diferenciação de osteocitos, osteoblastos, células musculares lisas, fibroblastos, células-tronco mesenquimais e outras células sensíveis à força^{14,,15,,16,,17,18}. Portanto, os TDSCs, como uma das células mecanosensíveis e multipotentes, podem ser estimulados a diferenciar-se por carregamento mecânico^19,,20.

No entanto, diferentes parâmetros de carga mecânica (força de carga, frequência de carga, tipo de carga e período de carregamento) podem induzir TDSCs a se diferenciar em diferentes células²¹. Assim, um regime de carregamento mecânico eficaz e válido é muito significativo para a tenogênese. Além disso, existem diferentes tipos de bioreatores como sistemas de estimulação atualmente utilizados para fornecer carregamento mecânico para TDSCs. Os princípios de cada tipo de bioreator são diferentes, de modo que os parâmetros de carregamento mecânico correspondentes a diferentes bioreatores também são diferentes. Portanto, é procurado um protocolo de estimulação simples, econômico e reprodutível, incluindo o tipo de bioreator, o meio de estimulação correspondente e o regime de carga mecânica.

O presente artigo descreve um método baseado em um sistema de alongamento uniaxial tridimensional (3D) para estimular os TDSCs a se diferenciarem em tecido semelhante ao tendão. São sete estágios do protocolo: isolamento de TDSCs camundongos, cultura e expansão de TDSCs de camundongos, preparação de cultura de estimulação para formação de folhas de células, formação de folhas de células por cultivo em meio de estimulação, preparação de construção de células-tronco tendinosas 3D, montagem do complexo de estimulação mecânica de alongamento uniaxial e avaliação do tecido mecânico estimulado in vitro. Todo o procedimento leva menos de 3 semanas para obter o construto de células 3D, que é muito menor do que alguns métodos existentes^22,23. O presente protocolo tem sido provado ser capaz de induzir TDSCs a diferenciar-se em tecido tendão, e é mais confiável do que o sistema de alongamento bidimensional (2D) atualmente usado²¹. A eficácia foi demonstrada pela histologia. Em suma, o presente protocolo é simples, econômico, reproduzível e válido.

Protocolo

Os métodos descritos foram aprovados e realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos do Comitê de Ética Animal da Universidade da Austrália Ocidental.

1. Isolamento de TDSCs de camundongos

1. Eutanize os camundongos C57BL/6 de 6-8 semanas por luxação cervical.
2. Colher tendões patelares²⁴ e tendões de Aquiles²⁵.
3. Digestão de tendões de um com 6 mL de colagenase tipo I (3 mg/mL) por 3h.
   NOTA: Como o tamanho do tendão do mouse é pequeno, todos os tendões colhidos de um rato devem ser usados nesta etapa.
4. Colete as células e a cultura em meio essencial mínimo completo (Alpha-MEM) contendo 10% do soro bovino fetal (FBS) e 1% da mistura de estreptomicina e penicilina por 7 dias.
5. Identificar TDSCs usando a triagem celular ativada pela fluorescência por citometria de fluxo (expressão de marcadores de superfície celular incluindo CD44, CD90 e Sca-1; falta da expressão de CD34 e CD45).
6. Células de passagem e congelamento (as células de passagem 4 serão usadas para novas etapas).

2. Cultura e expansão de TDSCs de camundongos

NOTA: Conduza todas as etapas em um capô biossegurança estéril.

1. Leve as células aquecidas (camundongos TDSCs, 1 milhão de células, passagem 4, a 37 °C).
2. Adicione lentamente 4-5 mL extras de meio essencial mínimo completo (Alpha-MEM).
3. Transfira a mistura para um tubo de centrífuga de 15 mL com uma pipeta.
4. Cubra com médio a 8 mL total com uma pipeta.
   1. Meio pré-aquecido em uma incubadora de forno de 37 °C.
5. Coloque o tubo em centrífuga e equilibre.
6. Centrífuga e células de pelota a 347 x g por 5 min.
7. Tire depois da centrífuga e verifique a pelota na parte inferior.
8. Decante as células congelantes e resuspende suavemente em 1-2 mL de meio completo (evite fazer muitas bolhas).
9. Transfira células resuspended para um frasco T-75 por uma pipeta.
10. Use uma pipeta para adicionar o Medium Alfa-MEM completo ao frasco para atingir um volume total de 10 mL com concentração final de 13.000 células/cm².
11. Coloque o frasco na incubadora e cultura a 37 °C com 5% de CO₂.
12. Troque o meio a cada 3 dias.
13. Observe e monitore as células sob um microscópio ao alterar o meio até que as células sejam cultivadas para 100% de confluência (cerca de 40.000 células/cm²).

3. Preparação do meio de cultura de estimulação para formação de folhas de células

NOTA: Conduza todas as etapas em um capô biossegurança estéril.

1. Despeje 15 mL de meio Alfa-MEM completo em um tubo estéril de 15 mL.
2. Adicione 6 μL de ácido ascórbico (11 mg/mL) em 15 mL de meio para uma concentração final de 4,4 μg/mL.
   NOTA: Além disso, adicionar 25 ng/mL de fator de crescimento do tecido conjuntivo no meio da cultura de estimulação pode acelerar todo o processo de crescimento e diferenciação.
3. Misture suavemente invertendo para cima e para baixo.

4. Formação de folhas de células por cultivo em meio de estimulação

NOTA: Conduza todas as etapas em um capô biossegurança estéril.

1. Descarte cuidadosamente o meio alfa-MEM completo normal e evite tocar nas células presas à parte inferior do frasco.
2. Adicione 10 mL de meio de estimulação lentamente e evite causar qualquer perturbação às células totalmente confluentes.
3. Cultura as células em meio de estimulação por 9 dias (mude o meio a cada 3 dias) para gerar suficientemente a folha celular a 37 °C com 5% de CO₂.
   NOTA: A matriz extracelular ficará espessa e presente para ser nublada quando observada a partir da parte inferior do frasco após estimulada pelo ácido ascórbico, o que significa que a folha celular é suficientemente gerada.

5. Preparação da construção de células-tronco tendinosas 3D

NOTA: Conduza todas as etapas em um capô biossegurança estéril.

1. Tire o frasco da incubadora.
2. Descarte completamente o meio de estimulação.
3. Lave a folha de células de monocamadas com soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) girando o frasco.
4. Descarte completamente o PBS.
5. Use uma pipeta para adicionar 1 mL de 0,25% de trippsina no canto do frasco.
6. Toque no canto do frasco para desacoplar a folha de células da monocamada até que o canto da folha de células esteja fora da parte inferior do frasco.
7. Adicione imediatamente 9 mL de meio Alfa-MEM completo para parar a trippsinização.
8. Continue girando o frasco para descascar completamente a folha de células da monocamada.
9. Despeje a folha de células totalmente desarmada em uma placa de Petri com meio.
10. Use uma pinça estéril para pegar um canto da folha de celular e girar no sentido horário por 15 vezes.
11. Pegue outra extremidade da folha de células e gire em sentido anti-horário por 10 vezes para gerar firmemente uma construção in vitro semelhante ao tendão(Figura 1A).

6. Montagem do complexo de estimulação mecânica de alongamento uniaxial em bioreator projetado único

NOTA: Conduza todas as etapas em um capô biossegurança estéril.

1. Conecte os ganchos pelo conector e ajuste à distância desejada (2 cm) entre dois ganchos.
2. Enrole suavemente os TDSCs 3D construídos no gancho montado por 3 vezes em cada gancho(Figura 1B).
3. Fixar os ganchos com construção celular na câmara do bioreator apertando os parafusos em duas extremidades.
   NOTA: Toda a câmara, incluindo parafusos e ganchos, é estéril (autoclave por 1,5 h a 134 °C e raios ultravioleta (UV) expõem por 24 horas antes do uso). Para o suporte metálico das câmaras, a luz UV expõe por 48 horas antes do uso.
4. Encha a câmara com o meio Alfa-MEM completo.
5. Conecte o atuador à câmara de cultura por cabo.
6. Corte o conector dos ganchos por uma tesoura estéril.
7. Ligue a potência e o controlador de canal correspondente para iniciar a estimulação mecânica.
8. Coloque a tampa na câmara.
9. Verifique as luzes indicadoras e assegure que o bioreator possa funcionar corretamente.
10. Coloque o bioreator na incubadora e submia a construção de células 3D ao alongamento mecânico por 6 dias (alongamento de 6%, 0,25 Hz, 8h, seguido de 16h de repouso).

7. Avaliação do tecido mecânico estimulado in vitro semelhante ao tendão

1. Solte os parafusos por uma chave de fenda e retire o conjunto com cuidado.
2. Coloque o tecido tendinoso em 4% de paraformaldeído para fixação por 15 minutos.
3. Coloque o tecido fixo do tendão em um de biópsia com almofadas de espuma biópsia.
4. Processo para desidratar a amostra e, finalmente, avaliar por manchas histológicas de H&E.
5. Repita todo o protocolo e extraia RNA do tecido semelhante ao tendão para avaliar a expressão de marcadores tenogênicos por PCR quantitativo (qPCR). Os primers dos genes selecionados estão listados na Tabela 1.
   NOTA: O protocolo de histologia e o protocolo qPCR são padrão e seguem um estudo anterior²¹.

Resultados

Antes da estimulação mecânica, os TDSCs foram cultivados para 100% de confluência em meio completo e apresentaram uma morfologia ultraestrutural desorganizada(Figura 2A). Após 6 dias de carga mecânica de alongamento uniaxial, a matriz extracelular (ECM) e os alinhamentos celulares foram bem orientados(Figura 2B). As células estavam bem povoadas e bem envoltas em ECM após o carregamento mecânico. A morfologia celular foi apresentada para ser alongada e mais semelhante à célula ...

Discussão

O tendão é um tecido conjuntivo fibroso mecanosensível. De acordo com pesquisas anteriores, o excesso de carga mecânica poderia levar à diferenciação osteogênica das células-tronco tendinosas, enquanto o carregamento insuficiente levaria à estrutura de fibra de colágeno desordenada durante a diferenciação do tendão²¹.

Uma visão comum é que a chave para um bioreator ideal é a capacidade de simular o microambiente celular in vitro que as células in vivo ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-aldrich	PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS)	Gibcoä by Life Technologies	1908361
Histology processor	Leica	TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM)	Gibcoä by Life Technologies	2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell			Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde	Sigma-aldrich	441244
Streptomycin and penicillin mixture	Gibcoä by Life Technologies	15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System	Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia		Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin	Gibcoä by Life Technologies	1858331