בידוד של עכבר כליות תושב CD8+ תאי T לניתוח ציטומטריה זרימה

Summary

בעקבות זיהום ויראלי, הכליות מטפחות מספר גדול יחסית של תאי CD8⁺ T ומציעות הזדמנות לחקור תאי T_{RM שאינם ריר.} כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבודד לימפוציטים כליות העכבר לניתוח ציטומטריה זרימה.

Abstract

תא T זיכרון תושב רקמות (T_RM)הוא תחום המתרחב במהירות של מחקר אימונולוגיה. בידוד תאי T מרקמות שונות שאינן לימפואידיות הוא אחד השלבים העיקריים לחקור T_RMs. ישנן וריאציות קלות בפרוטוקולי בידוד לימפוציטים עבור איברים שונים. הכליה היא איבר חיוני שאינו לימפואידים עם חדירת תאים חיסוניים רבים במיוחד לאחר חשיפה לפתוגן או הפעלה אוטואימונית. בשנים האחרונות, מעבדות מרובות כולל שלנו החלו לאפיין תאי CD8⁺ T תושבי כליות במסגרות פיזיולוגיות ופתולוגיות שונות הן בעכבר והן בבני אדם. בשל שפע של לימפוציטים T, הכליה מייצגת איבר מודל אטרקטיבי ללמוד T_RMs ברקמות שאינן ריר או לא מחסום. כאן, נתאר פרוטוקול נפוץ במעבדות ממוקדות T_RMכדי לבודד תאי CD8⁺ T מכליות עכבר בעקבות זיהום ויראלי מערכתי. בקצרה, באמצעות מודל זיהום וירוס דלקת לימפוציטית חריפה (LCMV) בעכברים C57BL/6, אנו מדגימים CD8^{תוך וסקולרי +} תיוג תא T, עיכול אנזימטי, צנטריפוגה שיפוע צפיפות לבודד ולהעשיר לימפוציטים מכליות העכבר כדי להפוך דגימות מוכנות לניתוח ציטומטריה זרימה הבאים.

Introduction

זיכרון תושב רקמות (T_RM) תאי T מייצגים את אחת מאוכלוסיות תאי T הנפוצות ביותר בעכברים אנושיים ונדבקים בוגרים. תאי_{T RM} מספקים את הקו הראשון של ההגנה החיסונית ומעורבים באופן קריטי בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים^{שונים 1,2,3,4,5}. בהשוואה לתאי T במחזור, תאי T RM נושאים_סמני משטח ברורים עם תוכניות שעתוק^{ייחודיות 6,7,8}. הרחבת הידע שלנו בביולוגיה של T_RM היא המפתח להבנת תגובות תאי T החיוניים לפיתוח עתידי של חיסונים ואימונותרפיות מבוססי תאי T.

בנוסף סמנים מולקולריים משותפים נפוצים של T_RMs על פני כל הרקמות שאינן לימפואידיות, הצטברות ראיות עולה כי תכונות ספציפיות_{לרקמות הם מרכיב} מרכזי של ביולוגיה T RM⁹. הכליות מחסה תאים חיסוניים רבים_{כולל תאי T RM} לאחר ההדבקה ומציע הזדמנות_{מצוינת ללמוד ביולוגיה של} תאי T RM ברקמה שאינה ריר. LCMV חריפה (וירוס choriomeningitis לימפוציטית) זיהום באמצעות מסלול תוך-פרטית הוא מודל זיהום מערכתי מבוסס היטב ללמוד תגובות תאי T ספציפיים אנטיגן בעכברים. הזיהום נפתר בדרך כלל ב 7-10 ימים בעכברים מסוג בר ולהשאיר מספר רב של תאי T זיכרון ספציפי LCMV במגוון של רקמות, כולל^{הכליה 10}. P14 TCR (קולטן תא T) עכברים מהודקים לשאת CD8⁺ תאי T לזהות את אחד האפיטופים הדומיננטיים במערכת החיסון של LCMV שהוצגו על ידי MHC-I (סוג I מורכב היסטו-תאימות) מולקולה H2-D^{b בעכברים} C57BL/6. שילוב של העברה מאמצת תא P14 T מסומן באופן מולד וזיהום LCMV בעכברים, CD8⁺ אפקט ותאי T זיכרון נמצאים במעקב, כולל_התביור T RM והומלוסטזיס.

ברקמות מחסום מסוימות, כגון תא לימפוציטים intraepithelial מעיים (IEL) ובלוטות הרוק, הליך בידוד לימפוציטים הוקמה מניב אחוז גבוה של תאי T_RM עם זיהום תאי T נשא דם מינימלי בעכבר LCMV^{מודל 11}. עם זאת, ברקמות שאינן מחסום, כגון הכליה, רשת כלי דם צפופה מכילה מספר רב של תאים CD8⁺ T במחזור. זה כבר מתועד היטב כי אפילו חיסון מוצלח לא יכול להסיר ביעילות את כל תאי CD8⁺ T במחזור. כדי להתגבר על משוכה טכנית זו, כתמי נוגדנים תוך וסקולריים הוקמה כ אחת הטכניקות הנפוצות ביותר במעבדות T_RM ¹². בקצרה, 3-5 דקות לפני המתת חסד, 3 מיקרוגרם / עכבר נוגדן נגד CD8 (כדי לסמן CD8⁺ תאי T) מועבר דרך הווריד. קיר כלי דם שלם מונע דיפוזיה מהירה של הנוגדן בתוך פרק זמן קצר זה (כלומר, 3-5 דקות) ורק תאים תוך-וסקולריים מסומנים. בעקבות פרוטוקול בידוד לימפוציטים סטנדרטי, תאים תוך וסקולריים לעומת חוץ וסקולריים ניתן להבדיל בקלות באמצעות ציטומטריית זרימה.

כאן, נתאר פרוטוקול_{סטנדרטי נפוץ במעבדות} T RM לביצוע תיוג תוך וסקולרי, בידוד לימפוציטים וניתוח ציטומטריה זרימה של תאי CD8⁺ T בכליות באמצעות עכבר C57BL/6 שקיבל CD45.1⁺ תאי P14 T וזיהום LCMV 30 יום^{לפני 13}. ניתן להשתמש באותו פרוטוקול כדי ללמוד הן את תאי T משפיעים והן זיכרון T בכליה.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים המבוצעים על פי פרוטוקול זה חייבים להיות מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). כל ההליכים המתוארים כאן אושרו על ידי IACUC UT בריאות סן אנטוניו.

1. העברה מאמצת של תאי P14 T לנמעני C57BL/6 וזיהום LCMV

1. השתמש בעכברים P14 בגיל 6-12 שבועות. ודא כי המין של עכבר טרנסגני P14 TCR התורם צריך להתאים את המין של עכברים נמען C57BL/6. אחרת, תאים כגון תאי T זכרים המעבירים לעכברים נקביים יגרמו לדחייה מתווכו של תאי T תורמים במחזור בסביבות 12 ימים¹⁴.
2. לטהר תאים נאיביים CD8⁺ T מן הטחול ואת בלוטות הלימפה של עכבר מהונדס P14 TCR באמצעות עכבר CD8⁺ T ערכת טיהור תאים בעקבות פרוטוקול היצרן.
   1. בקצרה, לנתח טחול ובלוטות הלימפה, לרסק את הדגימות כדי ליצור השעיה תא יחיד.
   2. כדי להעשיר לתאי T נאיביים, הוסיפו נוגדן ביוטין-אנטי-CD44 במהלך שלב הדגירה הראשון של הנוגדנים¹³.
      הערה: ערכת בחירה מסחרית שלילית המשמשת בשלב זה מכילה שני מרכיבים עיקריים לשני שלבים של דגירה (כלומר, דגירה של תערובת ביוטין-נוגדנים ודגירה של חרוזים סטרפטוודין-מגנטי).
3. השתמש hemocytometer לספור את התאים ולהזריק 1,000 כדי 10,000 תאי P14 T מטוהרים ב 200 μL של PBS לתוך כל מין תואם C57BL/6 נמען דרך וריד הזנב.
   הערה: פרוטוקול הזרקת וריד הזנב מפורט מתואר בשלב 2.
4. ביום שלמחרת, כל מקבלי C57BL/6 מקבלים 2 x^{10 5} pfu LCMV ארמסטרונג מדולל ב 200 μL של PBS באמצעות מסלול תוך-פרטי.

2. תיוג תוך-וסקולרי של תאי CD8⁺ T

הערה: בהתאם לאינטרסים המחקריים, ניתן לבחור נקודות זמן שונות לאחר ההדבקה. דוגמה של יום 30 לאחר זיהום (יום 30 לאחר שלב 1.4) הוא הפגין, אשר נחשב לעתים קרובות כנקודת זמן זיכרון מוקדם עבור תגובת תא CD8 T.

1. לדלל נוגדן ביוטין נגד CD8α ל 15 מיקרוגרם / מ"ל ב PBS. ודא שכל עכבר מקבל 200 μL של PBS המכיל נוגדן 3 מיקרוגרם.
   הערה: נוגדן ביוטין נגד CD8 משמש כאן, כך שהוא יהיה גמיש יותר לעצב את לוח הכתמים הסופי FACS. ניתן להשתמש ישירות בנוגדן המסוי בצבע פלואורסצנטי. עם זאת, חשוב להשתמש בשכפולים שונים של נוגדנים חד שבטיים לתיוג תוך ורידי לעומת כתמי FACS.
2. מחממים כראוי את וריד הזנב של עכברים עם מנורת חום תקורה במשך 5-10 דקות כדי להפוך את הוורידים.
   הערה: יש לנקוט בזהירות נוספת כדי למנוע התחממות יתר של בעלי החיים. להפחית את החום או להסיר את מנורת החום אם העכברים הפסיקו לנוע.
3. צייר 200 μL של תערובת נוגדנים נגד CD8α prediluted לתוך מזרק אינסולין 100 U (28G) ולהסיר את כל בועות האוויר על ידי הזזת הבוכנה למעלה ולמטה. לכופף את המחט כדי ליצור זווית 150 ° בין המחט למזרק, משופע, כך המחט תהיה מקבילה לווריד.
4. לרסן את העכבר עם מרסן מכרסמים בגודל המתאים לרסס את הזנב עם 70% אתנול כדי להפוך את הווריד גלוי בבירור.
   הערה: יש לשמור על משך הריסון למינימום.
5. החזק את הזנב בקצה הדיסטלי באגודל ובאצבעות האמצעיות של היד הלא דומיננטית. מניחים את האצבע המורה מתחת לאתר שבו המחט תוכנס.
6. החזק את המזרק ביד הדומיננטית והכנס את המחט לווריד במקביל לכיוון הלב.
   הערה: בעת הצבת כראוי, המחט צריכה לנוע בצורה חלקה לתוך וריד.
7. להזריק לאט 200 μL של נוגדן נגד CD8α דרך וריד הזנב.
   הערה: אם יש התנגדות או אזור לבן נראה מעל המחט על הזנב, המחט אינה בתוך וריד. התחל את הזריקה הראשונית קרוב לקצה הזנב. בעת הצורך, להתקדם לכיוון החלק התחתון של הזנב עבור זריקות הבאות.
8. הסר את המחט בעדינות להחיל דחיסה עד הדימום מפסיק.
9. להחזיר את העכבר לכלוב, ולהרים את העכבר לאחר 3-5 דקות.
   הערה: יש להמות את העכברים באמצעות תא isoflurane ואחריו נקע בצוואר הרחם. שיטות אחרות, כגון שאיפת CO₂ ייקח עד 5 דקות ועשויות להציג וריאציה מיותרת של זמן תיוג נוגדנים תוך ורידי.
10. לנתח את הכליה באמצעות מספריים, להעביר את הכליה כולה 1.5 מ"ל של צינורות microcentrifuge ולהשאיר את הדגימות על הקרח עד עיבוד נוסף.
    הערה: כליה שלמה שלמה שלמה יכולה להיות מאוחסנת בבטחה על קרח במשך כמה שעות לפני העיבוד והעיכול הבאים.

3. עיכול אנזימטי של הכליה

1. הכינו 6 צלחות היטב המכילות 3 מ"ל של תמיסת העיכול (RPMI/2% FCS/1 מ"ג/מ"ל קולגנס B) לכל עכבר, אחסנו על קרח.
   הערה: ניתן להכין ולאחסן את פתרון קולגנס B בריכוז גבוה יותר (למשל, 20x) ב-20°C או מתחתיו. פתרון עבודה צריך להיות מוכן טרי. נא עיין בטבלה 1 לקבלת המתכונים עבור כל הפתרון/המאגר המשמשים בפרוטוקול הנוכחי.
2. הוסף 300 μL של פתרון העיכול לתוך צינורות מדגם מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל טחון דגימות הכליה עם מספריים באביב ישר.
   הערה: רקמת הכליה צריכה להיות טחון לחתיכות אפילו עם גדלים לא יותר מ 1.5 מ"מ קטרים. אין צורך בשלב עריפת ראש.
3. מעבירים את דגימות הכליות הטחון ל-6 צלחות היטב המכילות את פתרון העיכול
   הערה: 6 צלחות באר משמשות לנוחות רק כאשר יש דוגמאות מרובות לעיבוד.
4. הדגירה את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה (סביב 60 סל"ד) במשך 45 דקות.
5. לאחר העיכול, מועכים את הרקמה עם אוגן הבוכנה של מזרק 3 מ"ל ישירות בתוך המנה, ומעבירים לתוך צינורות חרוט 15 מ"ל.
   הערה: בדרך כלל סינון באמצעות מסננת תאים אינו נדרש בשלב זה, כי צנטריפוגה שיפוע צפיפות מבוצעת ליד לטהר לימפוציטים חיים.
6. לסובב את הדגימות ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F).
7. תן שימוש חוזר את גלולה ב 3 מ"ל של RPMI/10% FCS.

4. צנטריפוגה הדרגתית צפיפות להעשרת לימפוציטים מהכליות המתעכלות

1. לסובב את המדגם ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F).
2. הסר את supernatant ו resuspend גלולת התא עם 5 מ"ל של 44% פרקול / RPMI לערבב (44% פרקול + 56% RPMI ללא FBS).
3. שים את הקצה של פיפטה 3 מ"ל המכיל 3 מ"ל של 67% פרקול / PBS (67% פרקול + 33% PBS) ישירות לתחתית של כל צינור, ולאט לאט לשחרר את הפתרון, כך הפתרון הכבד (67% פרקול / PBS) מהווה שכבה ברורה בתחתית פתרון האור (44% Percoll / RPMI) הוא הרים למעלה. יחד, שכבות קוקטייל ייווצור.
   הערה: עבור אמצעי הדרגתי צפיפות שהגיע לאחרונה מהספק, להוסיף 1/10 נפח של PBS סטרילי 10x לבקבוק, לערבב היטב ולשקול את המדיום שיפוע צפיפות מאוזנת PBS כמו 100% פתרון.
4. סובב את הדגימות ב- 900 x g במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר עם האצה מופחתת והגדרת בלמים.
   הערה: עבור צנטריפוגות עם הגדרות מאיץ ובלמים (בסולם 1-9 (1 פירושו מינימום ו-9 פירושו מקסימום)), השתמש ב- 6 עבור מאיץ ו- 4 לבלמים.
5. בזהירות להסיר את הצינורות מן הצנטריפוגה מבלי להפריע את השכבות;
   הערה: שכבת לימפוציטים ברורה מזוהה בין שכבת RPMI בצבע ורוד לשכבת PBS חסרת צבע.
6. הסר את השכבה העליונה עם פיפטה העברה מבלי לגעת בשכבת הלימפוציטים.
7. מעבירים את שכבת הלימפוציטים לצינור חדש של 15 מ"ל, ממלאים את הצינור ב- PBS/5% FCS ומערבבים על ידי היפוך הצינור 4-6x לאט כדי להבטיח ערבוב מספיק.
   הערה: שלב זה חשוב לשטוף את כל שאריות פרקול.
8. לסובב את הדגימות ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F).
9. הסר את supernatant מחדש להשעות את גלולת התא עם 500 μL של מדיום RPMI מלא. התאים מוכנים להכתמת ציטומטריית זרימה.

5. כתמי ציטומטריה זרימה וניתוח

הערה: נא לפעול בהתאם לפרוטוקול הכתמת ציטומיית זרימה סטנדרטית עבור לימפוציטים T.

1. קח בערך 1 x 10^{6 תאים} עבור כל כתמי FACS.
   הערה: השתמש בצלחת באר U-bottom 96 עבור כתמי FACS. עם זאת, אם רק מספר מוגבל של דגימות מעורבים, 5 צינורות FACS mL ניתן להשתמש גם.
2. לסובב את התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F). השלך את העל-טבעי.
3. תן מחדש כל מדגם ב 50 μL של מאגר FACS המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל של חוסם FCR 2.4G2 (נוגדן חד שבטי נגד CD16/32 כדי לחסום את האינטראקציה בין נוגדן FACS הוסיף עם FcR). דגירה על קרח במשך 15 דקות.
4. ללא צנטריפוגה נוספת, להוסיף 50 μL של תערובת נוגדנים מכתים פני השטח עבור כל מדגם, כך נפח הכתמים הסופי הוא 100 μL / כל מדגם. דגירה על קרח במשך 30 דקות בחושך.
   הערה: כלול סטרפטבידין עם תווית פלואורסצנטית (2 מיקרוגרם/מ"ל או בהתאם להמלצת היצרן) בתערובת הנוגדנים כדי לסמן CD8α⁺ תאי CD8 + T^{תוך וסקולריים} ולהשתמש בנוגדן פלואורסצנטי שכותרתו אנטי CD8β כדי לסמן את כל תאי CD8 T. תערובת הנוגדנים מיוצרת על ידי הוספת כמויות רצויות של נוגדנים מעוניינים למאגר FACS.
5. לשטוף את הדגימות עם PBS פעמיים. עבור כל לשטוף, למלא את בארות של 96 צלחת גם עם PBS קר, להסתובב ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F) ולהשליך את העל טבעי.
6. תן שימוש חוזר בתאים ב 100 μL / גם של צבע חיים / מוות מדולל. דגירה על קרח במשך 30 דקות בחושך.
   הערה: אפילו עם ספין בינוני שיפוע צפיפות, שלב עיכול אנזימטי לעתים קרובות גורם למוות תאי משמעותי בתאי T תושב רקמות עקב ARTC2.2/P2RX7^{איתות 15}. כתמי צבע חיים / מוות מומלץ מאוד לפני קיבעון. ננו-בודי Anti-ARTC2 יכול להיות administrated לתוך העכברים לפני המתת חסד כדי למנוע מוות תאי הנגרמת על ידי בידוד התא.
7. שטפו את הדגימות עם מאגר FACS פעמיים. עבור כל לשטוף, למלא את הבארים של צלחת 96 גם עם חיץ FACS קר, להסתובב ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F) ולהשליך את העל טבעי.
8. תן שימוש חוזר בתאים במאגר תיקון μL/well של 100 μL. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
   הערה: חיץ תיקון נעשה טרי על ידי דילול פורמלדהיד עם PBS לריכוז סופי של 2% פורמלדהיד.
9. שטפו את הדגימות עם מאגר FACS פעמיים. עבור כל לשטוף, למלא את הבארים של 96 צלחת גם עם חיץ FACS קר, ספין ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F) ולהשליך את העל-טבעי.
10. תן שימוש חוזר בתאים במאגר FACS של 250 μL/well. לאטום את הצלחת, לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס ולהגן מפני אור עד ניתוח FACS.
    הערה: לפני ניתוח FACS, לסנן את הדגימות דרך רשת שינוי ניילון 70 μM כדי להסיר אשכולות תאים אפשריים שעלולים לסתום את מכונת FACS.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר כאן מסוכם בתרשים זרימה (איור 1A). ביום 30 לאחר זיהום LCMV, ביצענו תיוג תוך וסקולרי של תאי CD8⁺ T. 5 דקות לאחר מכן, שתי הכליות של החיה נותו, טחנו ונפלטו לעיכול קולגנס. לימפוציטים טוהרו עוד יותר מהדגימות המתעכלות באמצעות צנטריפוגה פרקול ונותחו על ידי ציטומטריית ...

Discussion

כמו חסינות ספציפית לרקמות הוא אזור מתרחב במהירות של מחקר, הצטברות ראיות עולה כי תאים חיסוניים, במיוחד אוכלוסיית לימפוציטים ניתן לזהות כמעט בכל האיברים בעכברים אנושיים או נגועים או מחוסנים. מודל זיהום עכבר LCMV הוא מודל מבוסס היטב ללמוד תגובת תאי T ספציפיים אנטיגן, מחולל ובידול תאי T זיכרון כ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisherbrand	05-408-130
15 ml Conical Tubes	Corning	431470
3 ml syringe	BD	309657
37C incubator	VWR
Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7)	Tonbo Biosciences	30-0081-U025
Calf Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30073.03
Collegenase B	Millipore Sigma	11088807001
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-9AM
Insulin Syringe	BD	329424
Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical	RS 5692
Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit	Biolegend	480043
overhead heat lamp	Amazon	B00333PZZG
PBS
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	17089101
rocker	VWR
RPMI	GE Healthcare Life Sciences	SH30096.01
Solid Brass Mouse Restrainer	Braintree Scientific, Inc	SAI-MBR
Swing Bucket Centrifuge with refrigerator	Thermofisher
Tissue Culture 6-well plate	Corning	3516