Akış Sitometri Analizi için Fare Böbrek-Resident CD8+ T hücrelerinin izolasyonu

Özet

Viral enfeksiyonutaki böbrek, nispeten çok sayıda CD8⁺ T hücrebarındırır ve mukozal olmayan T_RM hücrelerini inceleme fırsatı sunar. Burada, akış sitometri analizi için fare böbrek lenfositleri izole etmek için bir protokol açıklar.

Özet

Doku da yerleşik bellek T hücresi (T_RM)immünoloji araştırmalarının hızla genişleyen bir alanıdır. Çeşitli lenfoid olmayan dokulardan T hücrelerinin izole T_RMaraştırmak için önemli adımlardan biridir. Farklı organlar için lenfosit izolasyon protokollerinde hafif farklılıklar vardır. Böbrek patojen maruziyet veya otoimmün aktivasyon özellikle sonra çok sayıda bağışıklık hücresi infiltrasyonu ile önemli bir non-lenfoid organdır. Son yıllarda, bizim de dahil olmak üzere birden fazla laboratuvar fare ve insan çeşitli fizyolojik ve patolojik ortamlarda böbrek yerleşik CD8⁺ T hücreleri karakterize başlamıştır. T lenfositlerin bolluğu nedeniyle, böbrek non-mukozal veya non-bariyer dokularda T_RMçalışmak için cazip bir model organ temsil eder. Burada, sistemik viral enfeksiyon sonrasında fare böbreklerinden CD8⁺ T hücrelerini izole etmek için T_RModaklı laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılan bir protokolü açıklayacağız. Kısaca, C57BL/6 farelerinde akut lenfositik koryomeningit (LCMV) enfeksiyon modeli kullanarak, örnekleri sonraki akış sitometri analizine hazır hale getirmek için fare böbreklerinden lenfositleri izole etmek ve zenginleştirmek için intravasküler CD8⁺ T hücre etiketleme, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyan santrifüjünü gösteriyoruz.

Giriş

Doku da yerleşik bellek (T_RM)T hücreleri yetişkin insan ve enfekte farelerde en bol T hücre popülasyonlarından birini temsil eder. T_RM hücreleri bağışıklık savunmasının ilk hattını sağlar ve çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde kritik olarak yer alır^1,2,3,4,5. Dolaşımdaki T hücreleri ile karşılaştırıldığında, T_RM hücreleri benzersiz transkripsiyon programları^6,7,8ile farklı yüzey belirteçleri taşır. T_RM biyolojisi hakkındaki bilgimizi genişletmek, T hücre bazlı aşıların ve immünoterapilerin gelecekteki gelişimi için gerekli olan T hücre yanıtlarını anlamanın anahtarıdır.

Tüm lenfoid olmayan dokularda T_RM'ninyaygın olarak paylaşılan moleküler belirteçlerine ek olarak, biriken kanıtlar dokuya özgü özelliklerin T_RM ^{biyolojisi 9'un}merkezi bir bileşeni olduğunu göstermektedir. Böbrek enfeksiyon sonrası T_RM hücreleri de dahil olmak üzere birçok bağışıklık hücreleri barındırır ve olmayan bir mukozal dokuda T_RM hücre biyolojisi çalışma için büyük bir fırsat sunuyor. İntraperitoneal yol ile akut LCMV (lenfositik koryomeningit virüsü) enfeksiyonu farelerde antijene özgü T hücre yanıtlarını incelemek için kurulmuş bir sistemik enfeksiyon modelidir. Enfeksiyon genellikle yabani tip farelerde 7-10 gün içinde çözülür ve böbrek¹⁰dahil olmak üzere çeşitli dokularda LCMV özgü bellek T hücrelerinin çok sayıda bırakın. P14 TCR (T hücre reseptörü) transgenik fareler CD8⁺ T hücreleri taşır, C57BL/6 farelerde MHC-I (sınıf I majör histokompatibilite kompleksi) molekülü H2-D^b tarafından sunulan LCMV'nin immün dominant epitoplarından birini tanır. Farelerde konjenik olarak işaretlenmiş P14 T hücre evlat edinen transferi ve LCMV enfeksiyonu ile tom8⁺ efektör ve bellek T hücreleri, T_RM farklılaşması ve homeostaz dahil olmak üzere izlenir.

Bağırsak intraepitelyal lenfositler (IEL) bölmesi ve tükürük bezleri gibi bazı bariyer dokularında, kurulan lenfosit izolasyon prosedürü fare LCMV modelinde en az kan kaynaklı T hücre kontaminasyonu ile T_RM hücrelerinin yüksek yüzdesini verir¹¹. Ancak, böbrek gibi bariyer olmayan dokularda, yoğun vasküler ağ dolaşımdaki CD8⁺ T hücrelerinin çok sayıda içerir. Başarılı perfüzyonun bile dolaşımdaki tüm CD8⁺ T hücrelerini verimli bir şekilde çıkaramadığı iyi belgelenmiştir. Bu teknik engeli aşmak için, intravasküler antikor boyama T_RM laboratuvarlarında en sık kullanılan tekniklerden biri olarak kurulmuştur¹². Kısaca, ötanaziden 3-5 dakika önce, 3 μg/mouse anti-CD8 antikor (CD8⁺ T hücrelerini etiketlemek için) intravenöz olarak teslim edilir. Sağlam kan damarı duvarı bu kısa sürede antikorların hızlı difüzyonunu önler (yani 3-5 dakika) ve sadece intravasküler hücreler etiketlenir. Standart lenfosit izolasyon protokolü takip, intravasküler karşı ekstravasküler hücreler kolayca akış sitometri kullanılarak ayırt edilebilir.

Burada, t_rm laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılan standart bir protokolü,¹³gün önce 30 gün önce CD45.1⁺ P14 T hücreleri ve LCMV enfeksiyonu aldı C57BL/6 fare kullanarak böbrek CD8⁺ T hücrelerinin lenfosit izolasyonve akış sitometri analizi gerçekleştirmek için açıklayacağız. Aynı protokol böbrekte hem efektör hem de bellek T hücrelerini incelemek için kullanılabilir.

Protokol

Bu protokole göre yapılan tüm hayvan deneyleri ilgili kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmalıdır. Burada açıklanan tüm prosedürler IACUC UT Health San Antonio tarafından onaylanmıştır.

1. P14 T hücrelerinin C57BL/6 alıcılarına ve LCMV enfeksiyonuna benimsendirici transferi

1. 6-12 haftalık kenP14 farelerini kullanın. Donör P14 TCR transgenik farenin cinsiyetinin C57BL/6 alıcı farelerinin cinsiyetine uygun olduğundan emin olun. Aksi takdirde, erkek T hücreleri gibi kadın farelere transfer hücreleri yaklaşık 12 gün içinde dolaşan donör T hücrelerinin bağışıklık aracılı reddi neden olur¹⁴.
2. Üreticiprotokolünden sonra fare CD8⁺ T hücre saflaştırma kiti nikullanarak p14 TCR transgenik farenin dalak ve lenf düğümlerinden saf CD8⁺ T hücrelerini arındırın.
   1. Kısaca, dalak ve lenf düğümleri incelemek, tek hücreli süspansiyon oluşturmak için örnekleri püre.
   2. Naif T hücreleri için zenginleştirmek için, ilk antikor kuluçka adım sırasında biotin-anti-CD44 antikor ekleyin¹³.
      NOT: Bu adımda kullanılan negatif seçim ticari kiti kuluçka iki adım için iki ana bileşeni içerir (yani, biotin-antikor karışımı kuluçka ve streptavidin-manyetik boncuk kuluçka).
3. Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın ve kuyruk damarı ile eşleşen Her cinsiyete 200 μL PBS'de 1.000 ila 10.000 saflaştırılmış P14 T hücresi enjekte edin.
   NOT: Ayrıntılı kuyruk ven enjeksiyon protokolü adım 2'de tanımlanmıştır.
4. Ertesi gün, tüm C57BL/6 alıcıları intraperitoneal bir rota ile 200 μL PBS seyreltilmiş 2 x 10⁵ pfu LCMV Armstrong alırsınız.

2. CD8⁺ T hücrelerinin intravasküler etiketleme

NOT: Araştırma ilgi alanlarına bağlı olarak enfeksiyon sonrası farklı zaman dilimleri seçilebilir. Gün 30 post enfeksiyon bir örnek (gün 30 sonra adım 1.4) genellikle CD8 T hücre yanıtı için erken bir bellek zaman noktası olarak kabul edilir gösterilmiştir.

1. PBS'de biotin anti-CD8α antikorlarını 15 μg/mL'ye seyreltin. Her farenin 3 μg antikor içeren 200 μL PBS aldığından emin olun.
   NOT: Biotin anti-CD8 antikor son FACS boyama paneli tasarımı için daha esnek olacak, böylece burada kullanılır. Floresan boya etiketli antikor doğrudan kullanılabilir. Ancak, intravenöz etiketleme ve FACS boyama için monoklonal antikorların farklı klonları kullanmak önemlidir.
2. Düzgün damarları dilate için 5-10 dakika için bir havai ısı lambası ile farelerin kuyruk damar ısı.
   NOT: Hayvanların aşırı ısınmasını önlemek için ekstra özen izlenmelidir. Fareler hareket etmek için durduysa ısıyı azaltın veya ısı lambasını çıkarın.
3. Önceden seyreltilmiş anti-CD8α antikor karışımının 200 μL'ini 100 U insülin şırıngasına (28G) çekin ve pistonu yukarı ve aşağı hareket ettirerek hava kabarcıklarını çıkarın. İğne ve şırınga arasında 150° açı oluşturmak için iğneyi bükün, böylece iğne damara paralel olacak.
4. Uygun boyutta bir kemirgen dizginleyici ile fareyi dizginlemek ve damar açıkça görünür hale getirmek için% 70 etanol ile kuyruk sprey.
   NOT: Kısıtlama süresi minimumda tutulmalıdır.
5. Baskın olmayan elin başparmak ve orta parmakları ile distal ucunda kuyruk tutun. İşaret parmağını iğnenin takAcağı yerin altına yerleştirin.
6. Şırıngayı baskın el ile tutun ve iğneyi kalbin yönüne paralel olarak damara takın.
   NOT: Doğru yerleştirirken, iğne damariçine düzgün hareket etmelidir.
7. Kuyruk damarı üzerinden 200 μL anti-CD8α antikor enjekte edin.
   NOT: Kuyruktaki iğnenin üzerinde bir direnç veya beyaz bir alan görülürse, iğne damarın içinde değildir. İlk enjeksiyonu kuyruğun ucuna yakın başlatın. Gerektiğinde, sonraki enjeksiyonlar için kuyruğun altına doğru ilerleyin.
8. İğneyi çıkarın ve kanama durana kadar hafifçe sıkıştırma uygulayın.
9. Fareyi kafese geri döndürün ve 3-5 dk sonra fareyi ötenazi edin.
   NOT: Fareler izofluran odası ve ardından servikal çıkış yoluyla ötenazi yapılmalıdır. CO₂ inhalasyonu gibi diğer yöntemler 5 dakika kadar sürer ve intravenöz antikor etiketleme süresinin gereksiz değişimine neden olabilir.
10. Makas kullanarak böbreği inceleyin, tüm böbreği 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve numuneleri daha fazla işleme konana kadar buzda bırakın.
    NOT: Bozulmamış tüm böbrek güvenli bir şekilde sonraki işleme ve sindirim önce birkaç saat buz üzerinde saklanabilir.

3. Böbrek enzimatik sindirim

1. Her fare için 3mL sindirim çözeltisi (RPMI/2% FCS/1 mg/ml Kollajenaz B) içeren 6 kuyu plakası hazırlayın, buz üzerinde saklayın.
   NOT: Stok kollajenaz B çözeltisi daha yüksek konsantrasyonda (örn. 20x) -20°C'de veya altında hazırlanabilir ve saklanabilir. Çalışma çözümü taze olarak hazırlanmalıdır. Geçerli protokolde kullanılan tüm çözüm/arabellek tarifleri için lütfen Tablo 1'e bakın.
2. 1,5 mL mikrosantrifüj numune tüplerine 300 μL sindirim çözeltisi ekleyin ve böbrek örneklerini düz bir yay makasla dolayın.
   NOT: Böbrek dokusu 1,5 mm'den büyük olmayan boyutlarda eşit parçalar halinde doğrılmalıdır. Decapsulation adım gereklidir.
3. Kıymalı böbrek örneklerini sindirim çözümlü içeren 6 kuyu plakasına aktarın
   NOT: 6 kuyu plakası sadece işlenecek birden fazla örnek olduğunda kolaylık sağlamak için kullanılır.
4. Numuneleri 37 °C'de 45 dakika boyunca hafif sallayarak (yaklaşık 60 rpm) kuluçkaya yatırın.
5. Sindirimden sonra, doğrudan çanak içinde bir 3 mL şırınga piston flanş ile doku püre, ve 15 mL konik tüpler içine transfer.
   NOT: Canlı lenfositlerin arıtılması için yanında yoğunluk gradyan santrifüjü yapıldığından, genellikle hücre süzgecinden filtrasyon gerekli değildir.
6. 4 °C'de 5 dk için 500 x g'de numuneleri aşağı doğru çevirin.
7. RPMI/10% FCS 3 mL pelet resuspend.

4. Sindirilmiş böbreklenfositler zenginleştirmek için yoğunluk gradyan santrifüj

1. Numuneyi 500 x g'de 4 °C'de 5 dk'ya çevirin.
2. Supernatant çıkarın ve 5 mL ile hücre pelet resuspend 44% Percoll / RPMI karışımı (%44 Percoll + 56% RPMI FBS olmadan).
3. 3 mL içeren 3 mL'lik pipetin ucunu %67 Percoll/PBS (%67 Percoll + %33 PBS) doğrudan her tüpün altına koyun ve ağır çözeltinin (%67 Percoll/PBS) alt tabakada ayrı bir tabaka oluşturduğu ve ışık çözeltisinin (%44 Percoll/RPMI) yükseltilmesi için solüsyonu yavaşça bırakın. Birlikte, kokteyl katmanları oluşturacaktır.
   NOT: Satıcıdan yeni gelen yoğunluk gradyan ortamı için şişeye 1/10 hacim steril 10x PBS ekleyin, iyice karıştırın ve PBS dengeli yoğunluk gradyan ortamını %100 çözüm olarak düşünün.
4. Azaltılmış gaz ve fren ayarı ile oda sıcaklığında 20 dk için 900 x g'de numuneleri döndürün.
   NOT: Hızlandırıcı ve fren ayarlı santrifüjler için (1-9 ölçekte (1 minimum ve 9 maksimum anlamına gelir)), gaz pedalı için 6 ve fren için 4 kullanın.
5. Tüpleri katmanları rahatsız etmeden santrifüjden dikkatlice çıkarın;
   NOT: Pembe renk RPMI tabakası ile renksiz PBS tabakası arasında net bir lenfosit tabakası tanımlanır.
6. Lenfosit tabakası dokunmadan bir transfer pipet ile üst tabaka çıkarın.
7. Lenfosit tabakasını yeni bir 15 mL tüpe aktarın, tüpü PBS/5% FCS ile doldurun ve yeterli karıştırmayı sağlamak için tüpü 4-6x yavaşça ters çevirerek karıştırın.
   NOT: Bu adım herhangi bir artık Percoll yıkamak için önemlidir.
8. 4 °C'de 5 dk için 500 x g'de numuneleri aşağı doğru çevirin.
9. Supernatant çıkarın ve tam RPMI orta 500 μL ile hücre pelet yeniden askıya. Hücreler akış sitometri boyama için hazırdır.

5. Akış sitometri boyama ve analizi

NOT: T lenfositler için standart akış sitometri boyama protokolünü uygulayın.

1. Her FACS boyama için yaklaşık 1 x 10⁶ hücre alın.
   NOT: FACS boyama için bir U-alt 96 kuyu plakası kullanın. Ancak, sadece sınırlı sayıda örnek söz konusu ise, 5 mL FACS tüpleri de kullanılabilir.
2. Hücreleri 500 x g'de 4 °C'de 5 dk'ya çevirin. Supernatant atın.
3. 10 μg/mL 2.4G2 FcR bloker (fcr ile eklenen FACS antikorları arasındaki etkileşimi engellemek için bir anti-CD16/32 monoklonal antikor) içeren 50 μL FACS tamponundaki her numuneyi yeniden askıya alın. 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
4. Daha fazla santrifüj olmadan, son boyama hacminin 100 μL/her numune olması için her numune için 50 μL yüzey boyama antikor karışımı ekleyin. Karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
   NOT: ANTIKor karışımına floressentçe etiketli streptavidin (2 g/mL veya üreticinin tavsiyesine uyun) ekleyin ve tüm CD8 T hücrelerini etiketlemek için floresan etiketli anti-CD8β antikor kullanın. Antikor karışımı FACS tampon içine ilgilenen antikorların istenilen miktarda ekleyerek yapılır.
5. Örnekleri iki kez PBS ile yıkayın. Her yıkama için, 96 kuyu plakasının kuyularını soğuk PBS ile doldurun, 500 x g'de 4 °C'de 5 dk'da döndürün ve süpernatantı atın.
6. Seyreltilmiş canlı/ölüm boyası 100 μL/well'deki hücreleri yeniden askıya alın. Karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
   NOT: Yoğunluk gradyan orta spin bile, enzimatik sindirim adımı genellikle ARTC2.2/P2RX7 sinyalizasyon¹⁵nedeniyle doku yerleşik T hücrelerinde önemli hücre ölümü neden olur. Canlı/ölüm boyası boyama, fiksasyondan önce şiddetle tavsiye edilir. Anti-ARTC2 nanobody hücre izolasyonuna bağlı hücre ölümünü önlemek için ötanaziden önce farelere yönetilebilir.
7. Örnekleri iki kez FACS arabelleği ile yıkayın. Her yıkama için, 96 kuyulu plakanın kuyularını soğuk FACS tamponuyla doldurun, 5 000 x g'de 4 °C'de 5 dk'da döndürün ve süpernatantı atın.
8. Hücreleri 100 μL/iyi sabitleme tamponunda yeniden askıya alın. 37 °C'de 10 dk kuluçkaya yatırın.
   NOT: Tampon sabitleme% 2 formaldehit nihai konsantrasyonp PBS ile formaldehit seyreltilmesi ile taze yapılır.
9. Örnekleri iki kez FACS arabelleği ile yıkayın. Her yıkama için, 96 kuyu plakasının kuyularını soğuk FACS tamponuyla doldurun, 5 000 x g'de 4 °C'de 5 dk'da döndürün ve süpernatantı atın.
10. 250 μL/well FACS arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın. Plakayı kapatın, 4 °C'de saklayın ve FACS analizine kadar ışıktan koruyun.
    NOT: FACS analizinden önce, FACS makinesini tıkayabilecek olası hücre kümelerini kaldırmak için numuneleri 70 μM naylon kafesten filtreleyin.

Sonuçlar

Burada açıklanan protokol bir akış grafiğinde özetlenmiştir (Şekil 1A). 30. gün sonrası LCMV enfeksiyonunda CD8⁺ T hücrelerinin intravasküler etiketlemesini yaptık. 5 dakika sonra, hayvanın her iki böbrek leri kesildi, kıyıldı ve kollajenaz sindirime tabi tutuldu. Lenfositler Percoll santrifüj yoluyla sindirilmiş örneklerden daha fazla saflaştırılmış ve akış sitometri sitometrisi ile analiz edilmiştir. Şekil 1B'degösteri...

Tartışmalar

Dokuya özgü bağışıklık araştırma hızlı genişleyen bir alan olduğu gibi, kanıt birikmesi bağışıklık hücreleri, özellikle lenfositler nüfus yetişkin insan veya enfekte veya aşılanmış farelerde hemen hemen tüm organlarda tespit edilebilir öneririz. LCMV fare enfeksiyonu modeli, antijene özgü T hücre yanıtı, efektör ve bellek T hücre farklılaşmasını incelemek için kurulmuş bir modeldir. Burada böbrekteki CD8⁺ T hücrelerini analiz etmek için bir protokol tanı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisherbrand	05-408-130
15 ml Conical Tubes	Corning	431470
3 ml syringe	BD	309657
37C incubator	VWR
Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7)	Tonbo Biosciences	30-0081-U025
Calf Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30073.03
Collegenase B	Millipore Sigma	11088807001
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-9AM
Insulin Syringe	BD	329424
Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical	RS 5692
Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit	Biolegend	480043
overhead heat lamp	Amazon	B00333PZZG
PBS
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	17089101
rocker	VWR
RPMI	GE Healthcare Life Sciences	SH30096.01
Solid Brass Mouse Restrainer	Braintree Scientific, Inc	SAI-MBR
Swing Bucket Centrifuge with refrigerator	Thermofisher
Tissue Culture 6-well plate	Corning	3516