Isolamento das células CD8+ T residentes em rim do rato para análise de citometria de fluxo

Resumo

Após a infecção viral, o rim abriga um número relativamente grande de células CD8⁺ T e oferece uma oportunidade de estudar células T_RM não mucosas. Aqui, descrevemos um protocolo para isolar linfócitos renais de camundongos para análise de citometria de fluxo.

Resumo

A célula T dememória residente em tecido é um campo de pesquisa de imunologia em rápida expansão. Isolar células T de vários tecidos não linfoides é um dos passos fundamentais para investigar T_RMs. Há pequenas variações nos protocolos de isolamento de linfócitos para diferentes órgãos. O rim é um órgão não linfoide essencial com numerosa infiltração de células imunes especialmente após a exposição ao patógeno ou ativação autoimune. Nos últimos anos, vários laboratórios, incluindo o nosso, começaram a caracterizar células CD8⁺ T residentes nos rins em vários ambientes fisiológicos e patológicos tanto em camundongos quanto em humanos. Devido à abundância de linfócitos T, o rim representa um órgão modelo atraente para estudar T_RMsem tecidos não mucosas ou não-barreiras. Aqui, descreveremos um protocolo comumente usado em laboratórios focados em T_RMpara isolar células CD8⁺ T de rins de camundongos após infecção viral sistêmica. Brevemente, utilizando um modelo de infecção por coriomeningite linfocítica aguda (LCMV) em camundongos C57BL/6, demonstramos rotulagem intravascular de células CD8⁺ T, digestão enzimática e centrífuga de gradiente de densidade para isolar e enriquecer linfócitos de rins de camundongos para preparar amostras para a análise de citometria de fluxo subsequente.

Introdução

As células T de memória residente de tecido (T_RM) representam uma das populações de células T mais abundantes em camundongos humanos adultos e infectados. As células_{T RM} fornecem a primeira linha de defesa imunológica e estão criticamente envolvidas em diversos processos fisiológicos e patológicos^1,2,3,4,5. Comparando com as células T circulantes, as células T_RM carregam marcadores de superfície distintos com programas de transcrição únicos^6,7,8. Expandir nosso conhecimento sobre biologia T_RM é a chave para entender as respostas das células T, que é essencial para o desenvolvimento futuro de vacinas e imunoterapias baseadas em células T.

Além de marcadores moleculares comumente compartilhados de T_RMem todos os tecidos não linfoides, evidências acumuladas sugerem que características específicas do tecido são um componente central da biologia T_RM ⁹. O rim abriga muitas células imunes, incluindo células T_RM após a infecção e oferece uma grande oportunidade para estudar biologia celular T_RM em um tecido não mucosal. A infecção por LCMV (vírus da coiomeningite linfocítica) por via intraperitoneal é um modelo de infecção sistêmica bem estabelecido para estudar respostas de células T específicas de antígenos em camundongos. A infecção geralmente é resolvida em 7-10 dias em camundongos do tipo selvagem e deixa um grande número de células T de memória específica de LCMV em uma variedade de tecidos, incluindo o rim¹⁰. Camundongos transgênicos P14 TCR (receptor de células T) carregam células CD8⁺ T reconhecem um dos epítopos imunes dominantes do LCMV apresentados pela molécula MHC-I (complexo de histocompatibilidade maior classe I) H2-D^b em camundongos C57BL/6. Combinando transferência adotiva de células P14 T congênicamente marcadas e infecção por LCMV em camundongos, células T de efeito CD8⁺ e memória são rastreadas, incluindo diferenciação T_RM e homeostase.

Em alguns tecidos de barreira, como linfócitos intraepiteliais intestinais (IEL) compartimentos e glândulas salivares, o procedimento de isolamento de linfócitos estabelecido produz alta porcentagem de células T_RM com contaminação mínima das células T transmitidas pelo sangue no modelo¹¹LCMV do camundongo . No entanto, em tecidos não-barreiras, como o rim, a densa rede vascular contém um grande número de células CD8⁺ T circulantes. Foi bem documentado que mesmo a perfusão bem sucedida não pode remover eficientemente todas as células CD8⁺ T circulantes. Para superar esse obstáculo técnico, a coloração de anticorpos intravasculares foi estabelecida como uma das técnicas mais utilizadas nos laboratórios T_RM ¹². Em suma, 3-5 minutos antes da eutanásia, 3 μg /mouse anticorpo anti-CD8 (para rotular células CD8⁺ T) é entregue por via intravenosa. A parede intacta dos vasos sanguíneos previne a rápida difusão do anticorpo neste curto período de tempo (ou seja, 3-5 minutos) e apenas células intravasculares são rotuladas. Seguindo o protocolo padrão de isolamento do linfócito, as células intravasculares versus extravasculares podem ser facilmente distinguidas usando citometria de fluxo.

Aqui, descreveremos um protocolo padrão comumente utilizado em laboratórios T_RM para realizar rotulagem intravascular, isolamento de linfócitos e análise de citometria de fluxo de células rim CD8⁺ T usando um mouse C57BL/6 que recebeu células CD45.1⁺ P14 T e infecção por LCMV 30 dias antes^{do dia 13}. O mesmo protocolo pode ser usado para estudar células T e efeitos e memória no rim.

Protocolo

Todos os experimentos em animais realizados após este protocolo devem ser aprovados pelo respectivo Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pela IACUC UT Health San Antonio.

1. Transferência adotiva de células P14 T para receptores C57BL/6 e infecção por LCMV

1. Use ratos P14 com 6-12 semanas de idade. Certifique-se de que o sexo do doador P14 TCR transgênico do mouse deve coincidir com o sexo de camundongos receptores C57BL/6. Caso contrário, células como células T machos que se transferem para camundongos fêmeas resultarão em rejeição imuno-mediada de células T doadoras circulantes em cerca de 12 dias¹⁴.
2. Purificar células ingênuas CD8⁺ T do baço e linfonodos de um mouse transgênico P14 TCR usando kit de purificação celular CD8⁺ T do mouse seguindo o protocolo do fabricante.
   1. Brevemente, dissecar baço e linfonodos, amasse as amostras para gerar suspensão celular única.
   2. Para enriquecer para células T ingênuas, adicione anticorpo biotina-anti-CD44 durante a primeira incubação de anticorpos passo¹³.
      NOTA: O kit comercial de seleção negativa utilizado nesta etapa contém dois componentes principais para duas etapas de incubação (ou seja, incubação de mistura de biotina-anticorpos e incubação de contas magnéticas streptavidin).
3. Use um hemótmetro para contar as células e injetar de 1.000 a 10.000 células P14 T purificadas em 200 μL de PBS em cada sexo compatível com o receptor C57BL/6 através da veia traseira.
   NOTA: O protocolo detalhado de injeção da veia da cauda é descrito na etapa 2.
4. No dia seguinte, todos os receptores C57BL/6 recebem 2 x 10⁵ pfu LCMV Armstrong diluídos em 200 μL de PBS através de uma rota intraperitoneal.

2. Rotulagem intravascular de células CD8⁺ T

NOTA: Dependendo dos interesses da pesquisa, diferentes pontos de tempo podem ser escolhidos após a infecção. Um exemplo do dia 30 pós infecção (dia 30 após a etapa 1.4) é demonstrado, o que é muitas vezes considerado como um ponto de tempo de memória inicial para resposta celular CD8 T.

1. Diluir anticorpos anti-CD8α para 15 μg/mL em PBS. Certifique-se de que cada mouse receba 200 μL de PBS contendo anticorpo de 3 μg.
   NOTA: O anticorpo biotin anti-CD8 é usado aqui para que seja mais flexível para projetar o painel de coloração FACS final. O anticorpo com tinta fluorescente pode ser usado diretamente. No entanto, é importante usar diferentes clones de anticorpos monoclonais para rotulagem intravenosa versus coloração FACS.
2. Aqueça adequadamente a veia traseira dos camundongos com uma lâmpada de calor aérea por 5-10 minutos para dilatar as veias.
   NOTA: Deve-se tomar cuidado extra para evitar o superaquecimento dos animais. Reduza o calor ou remova a lâmpada de calor se os ratos pararem para se mover.
3. Desenhe 200 μL de mistura predil de anticorpos anti-CD8α em uma seringa de insulina de 100 U (28G) e remova quaisquer bolhas de ar movendo o pistão para cima e para baixo. Dobre a agulha para criar um ângulo de 150° entre a agulha e a seringa, bisbida para cima, de modo que a agulha será paralela à veia.
4. Contenha o mouse com um cabisso de roedores de tamanho adequado e pulverize a cauda com 70% de etanol para deixar a veia claramente visível.
   NOTA: A duração da contenção deve ser mantida ao mínimo.
5. Segure a cauda na extremidade distal com o polegar e os dedos médios da mão não dominante. Coloque o dedo indicador debaixo do local onde a agulha será inserida.
6. Segure a seringa com a mão dominante e insira a agulha na veia em paralelo em direção à direção do coração.
   NOTA: Ao colocar corretamente, a agulha deve mover-se suavemente para dentro da veia.
7. Injete lentamente 200 μL de anticorpo anti-CD8α através da veia da cauda.
   NOTA: Se houver uma resistência ou uma área branca for vista acima da agulha na cauda, a agulha não está dentro da veia. Inicie a injeção inicial perto da ponta da cauda. Quando necessário, mova-se para a parte inferior da cauda para injeções subsequentes.
8. Retire a agulha e aplique suavemente a compressão até que o sangramento pare.
9. Devolva o rato para a gaiola, e eutanásia o rato depois de 3-5 min.
   NOTA: Os camundongos devem ser eutanizados através da câmara isoflurane seguida de luxação cervical. Outros métodos, como a inalação de CO_2, levarão até 5 minutos e podem introduzir variação desnecessária do tempo de rotulagem de anticorpos intravenosos.
10. Dissecar o rim usando tesoura, transferir todo o rim para 1,5 mL de tubos de microcentrifuuus e deixar as amostras no gelo até um processamento mais aprofundado.
    NOTA: O rim inteiro intacto pode ser armazenado com segurança no gelo por algumas horas antes do processamento e digestão subsequentes.

3. Digestão enzimática do rim

1. Prepare 6 placas de poço contendo 3mL da solução de digestão (RPMI/2% FCS/1 mg/ml Collagenase B) para cada mouse, armazenar no gelo.
   NOTA: A solução B de colagenase de estoque em maior concentração (por exemplo, 20x) pode ser preparada e armazenada a menos de -20°C. A solução de trabalho deve ser preparada de novo. Consulte a Tabela 1 para as receitas de todas as soluções/buffer usadas no protocolo atual.
2. Adicione 300 μL de solução de digestão nos tubos de amostra de microcentrifuuuge de 1,5 mL e pique as amostras de rim com uma tesoura de mola reta.
   NOTA: O tecido renal deve ser picado em pedaços uniformes com tamanhos não superiores a 1,5 mm de diâmetro. Não é necessária nenhuma etapa de decapsulação.
3. Transfira as amostras de rim picadas para 6 placas de poço contendo a solução de digestão
   NOTA: 6 placas de poço são usadas para conveniência somente quando há várias amostras a serem processadas.
4. Incubar as amostras a 37 °C com balanço suave (cerca de 60 rpm) por 45 min.
5. Após a digestão, amasse o tecido com a flange do êmbolo de uma seringa de 3 mL diretamente dentro do prato, e transfira para tubos cônicos de 15 mL.
   NOTA: Normalmente a filtragem através de um coador de células não é necessária nesta etapa porque a centrifugação de gradiente de densidade é realizada ao lado para purificar linfócitos vivos.
6. Gire as amostras a 500 x g por 5 min a 4 °C.
7. Resuspense a pelota em 3 mL de RPMI/10% FCS.

4. Centrifugação gradiente de densidade para enriquecer linfócitos do rim digerido

1. Gire a amostra a 500 x g por 5 min a 4 °C.
2. Remova o supernasce e resuspenda a pelota celular com 5 mL de 44% de mistura Percoll/RPMI (44% percoll + 56% RPMI sem FBS).
3. Coloque a ponta de uma pipeta de 3 mL contendo 3 mL de 67% Percoll/PBS (67% Percoll + 33% PBS) diretamente na parte inferior de cada tubo, e solte lentamente a solução para que a solução pesada (67% Percoll/PBS) forme uma camada distinta na parte inferior e a solução leve (44% Percoll/RPMI) seja levantada. Juntas, camadas de coquetéis se formarão.
   NOTA: Para o recém-chegado meio gradiente de densidade do fornecedor, adicione 1/10 volume de PBS estéril de 10x à garrafa, misture bem e considere o meio gradiente de densidade balanceado PBS como solução de 100%.
4. Gire as amostras a 900 x g por 20 minutos em temperatura ambiente com acelerador reduzido e ajuste de freio.
   NOTA: Para centrífugas com teclas de aceleração e freio (em uma escala de 1-9 (1 significa mínimo e 9 significa máximo)), use 6 para acelerador e 4 para freio.
5. Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga sem perturbar as camadas;
   NOTA: Uma camada clara de linfócito é identificada entre a camada RPMI cor rosa e a camada PBS incolor.
6. Remova a camada superior com uma pipeta de transferência sem tocar na camada de linfócito.
7. Transfira a camada de linfócito para um novo tubo de 15 mL, encha o tubo com PBS/5% FCS e misture invertendo o tubo 4-6x lentamente para garantir a mistura suficiente.
   NOTA: Este passo é importante para lavar qualquer Percoll residual.
8. Gire as amostras a 500 x g por 5 min a 4 °C.
9. Remova o supernatante e suspenda a pelota celular com 500 μL de meio RPMI completo. As células estão prontas para coloração de citometria de fluxo.

5. Coloração e análise da citometria de fluxo

NOTA: Siga o protocolo padrão de coloração da citometria de fluxo para linfócitos T.

1. Pegue cerca de 1 x 10⁶ células para cada coloração FACS.
   NOTA: Use uma placa de poço U-bottom 96 para coloração FACS. No entanto, se apenas um número limitado de amostras estiver envolvido, também podem ser usados tubos FACS de 5 mL.
2. Gire as células a 500 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernaspeso.
3. Resuspenque cada amostra em 50 μL de tampão FACS contendo 10 μg/mL de bloqueador 2.4G2 FcR (um anticorpo monoclonal anti-CD16/32 para bloquear a interação entre anticorpo FACS adicionado com FcR). Incubar no gelo por 15 minutos.
4. Sem mais centrifugação, adicione 50 μL de mistura de anticorpos de coloração superficial para cada amostra, de modo que o volume final de coloração seja de 100 μL/cada amostra. Incubar no gelo por 30 minutos no escuro.
   NOTA: Inclua streptavidina fluorescentemente rotulado (2 μg/mL ou siga a recomendação do fabricante) na mistura de anticorpos para rotular células CD8α⁺ intravasculares CD8⁺ T e use anticorpo anti-CD8β rotulado fluorescente para rotular todas as células CD8 T. A mistura de anticorpos é feita adicionando quantidades desejadas de anticorpos interessados no buffer FACS.
5. Lave as amostras com PBS duas vezes. Para cada lavagem, encha os poços de 96 pratos de poço com PBS frio, gire a 500 x g por 5 min a 4 °C e descarte o supernante.
6. Resuspend as células em 100 μL/bem de corante vivo/morte diluído. Incubar no gelo por 30 minutos no escuro.
   NOTA: Mesmo com o giro médio gradiente de densidade, a etapa de digestão enzimática muitas vezes induz morte celular significativa em células T residentes em tecido devido à sinalização ARTC2.2/P2RX7¹⁵. A coloração de corante ao vivo/morte é altamente recomendada antes da fixação. O nanocorpo anti-ARTC2 pode ser administrado nos camundongos antes da eutanásia para evitar a morte celular induzida pelo isolamento celular.
7. Lave as amostras com tampão FACS duas vezes. Para cada lavagem, encha os poços de placa de 96 poços com tampão FACS frio, gire a 500 x g por 5 min a 4 °C e descarte o supernascimento.
8. Resuspenda as células em 100 μL/bem fixação de buffer. Incubar a 37 °C por 10 min.
   NOTA: O buffer de fixação é feito recentemente diluindo o formaldeído com PBS a uma concentração final de 2% de formaldeído.
9. Lave as amostras com tampão FACS duas vezes. Para cada lavagem, encha os poços de 96 placas de poço com tampão FACS frio, gire a 500 x g por 5 min a 4 °C e descarte o supernascimento.
10. Resuspenda as células em 250 μL/bem tampão FACS. Sele a placa, armazene a 4 °C e proteja da luz até a análise FACS.
    NOTA: Antes da análise facs, filtre as amostras através de uma malha de nylon de 70 μM para remover possíveis aglomerados celulares que possam entupir a máquina FACS.

Resultados

O protocolo descrito aqui é resumido em um fluxograma(Figura 1A). No dia 30 pós infecção por LCMV, realizamos rotulagem intravascular de células CD8⁺ T. 5 minutos depois, ambos os rins do animal foram dissecados, picados e submetidos à digestão da colagemnase. Os linfócitos foram purificados ainda mais das amostras digeridas via centrífuga percoll e analisados por citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 1B, mesmo após o enriquecimento d...

Discussão

Como a imunidade específica do tecido é uma área de pesquisa em rápida expansão, evidências acumuladas sugerem que as células imunes, especialmente a população de linfócitos, podem ser identificadas em quase todos os órgãos em camundongos adultos humanos ou infectados ou imunizados. O modelo de infecção por camundongos LCMV é um modelo bem estabelecido para estudar a resposta celular T específica do antígeno, a diferenciação de células T e a diferenciação de células T, incluindo a biologia T_RM...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisherbrand	05-408-130
15 ml Conical Tubes	Corning	431470
3 ml syringe	BD	309657
37C incubator	VWR
Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7)	Tonbo Biosciences	30-0081-U025
Calf Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30073.03
Collegenase B	Millipore Sigma	11088807001
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-9AM
Insulin Syringe	BD	329424
Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical	RS 5692
Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit	Biolegend	480043
overhead heat lamp	Amazon	B00333PZZG
PBS
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	17089101
rocker	VWR
RPMI	GE Healthcare Life Sciences	SH30096.01
Solid Brass Mouse Restrainer	Braintree Scientific, Inc	SAI-MBR
Swing Bucket Centrifuge with refrigerator	Thermofisher
Tissue Culture 6-well plate	Corning	3516