Изоляция мыши Почки-Резидент CD8 -Т-клетки для анализа цитометрии потока

Резюме

После вирусной инфекции, почки гавани относительно большое количество CD8^И Т-клеток и предлагает возможность для изучения немукозальных_{Т-РМ-клеток.} Здесь мы описываем протокол изоляции лимфоцитов почек мыши для анализа цитометрии потока.

Аннотация

Ткань-резидент памяти Т-клеток (T_RM) является быстро расширяющейся области иммунологических исследований. Изоляция Т-клеток от различных нелимфоидных тканей является одним из ключевых шагов для исследования T_RMs. Существуют небольшие различия в протоколах изоляции лимфоцитов для различных органов. Почка является важным не лимфоидным органом с многочисленным проникновением иммунных клеток, особенно после воздействия патогена или аутоиммунной активации. В последние годы, несколько лабораторий, включая наши собственные начали характеризовать почек резидентов^CD8 Т-клеток в различных физиологических и патологических условиях как у мыши и человека. Из-за обилия Т-лимфоцитов, почка представляет собой привлекательный орган модели для изучения T_RMs в немукозыловых или небарьерных тканях. Здесь мы опишем протокол, обычно используемый в лабораториях, ориентированных на T_RM,чтобы изолировать CD8^и Т-клетки от почек мыши после системной вирусной инфекции. Кратко, используя острую лимфоцитарную модель инфекции вируса хориоменита (LCMV) у мышей C57BL/6, мы демонстрируем внутрисосудистый^CD8 и T-клеточную маркировку, энзиматическое пищеварение и градифугу плотности для изоляции и обогащения лимфоцитов из почек мыши, чтобы сделать образцы готовыми к последующему анализу цитометрии потока.

Введение

Ткань резидентов памяти (T_RM) Т-клетки представляют собой один из наиболее распространенных Т-клеток населения у взрослых людей и инфицированных мышей. Т-РМ-клетки обеспечивают первую линию иммунной защиты и критически вовлечены в различные физиологические и патологические^{процессы1,}2,^3,4,5. По сравнению с циркулирующими Т-клетками,_Т-РМ клетки несут различные поверхностные маркеры с^{уникальными программами транскрипции 6,7,8.} Расширение наших знаний о_{биологии} T RM является ключом к пониманию реакции Т-клеток, которая имеет важное значение для будущей разработки Т-клеточных вакцин и иммунотерапии.

В дополнение к широко разделяемым молекулярным маркерам T_RMs во всех нелимфоидных тканях, накопление доказательств свидетельствует о том, что специфические особенности тканей являются центральным компонентом_{биологии} T RM^9. Почки гавани многих иммунных клеток,_{включая Т-РМ} клетки после инфекции и предлагает отличную возможность для изучения T_RM клеточной биологии в немукосальной ткани. Острый LCMV (лимфоцитатический вирус хориомерингита) инфекции через внутриперитонеальный маршрут является устоявшейся системной модели инфекции для изучения антиген-специфических Т-клеток ответы у мышей. Инфекция обычно решается в 7-10 дней у диких мышей типа и оставить большое количество LCMV-специфических Т-клеток памяти в различных тканях, в том числе^{почки 10}. P14 TCR (Т-клеточный рецептор) трансгенных мышей нести CD8^И Т-клетки признают один из иммунных доминирующих эпитопов LCMV представлены MHC-I (класс I основной комплекс гистосовместимости) молекулы H2-D^b в C57BL/6 мышей. Сочетание конгенически отмеченных P14 Т-клеток приемной передачи и LCMV инфекции у мышей,^CD8 и эффектор памяти Т-клеток отслеживаются, в том числе_{дифференциации} T RM и гомеостаза.

В некоторых барьерных тканях, таких как кишечные интрапителеальные лимфоциты (IEL) отсека и слюнных желез, установленные лимфоциты изоляции процедура дает высокий процент_{Т-РМ клеток} с минимальным загрязнением Т-клеток, переносимых кровью в мыши LCMV^{модели 11}. Тем не менее, в небарьерных тканях, таких как почки, плотная сосудистая сеть содержит большое количество циркулирующих CD8 и Т-клеток. Было хорошо задокументировано, что даже успешная перфузия не может эффективно удалить все циркулирующие CD8^{и Т-клетки.} Чтобы преодолеть это техническое препятствие, внутрисосудистые антитела окрашивания была создана в качестве одного из наиболее часто используемых методов в T_RM ^{лаборатории 12}. Короче говоря, за 3-5 минут до эвтаназии, 3 мкг / мышь анти-CD8 антитела (для обозначения^CD8 и Т-клеток) доставляется внутривенно. Нетронутая стенка кровеносных сосудов предотвращает быстрое распространение антител в течение этого короткого периода времени (т.е. 3-5 минут) и только внутрисосудистые клетки помечены. Следуя стандартному протоколу изоляции лимфоцитов, внутрисосудистые и экстрасосудистые клетки можно легко отличить с помощью цитометрии потока.

Здесь мы опишем стандартный протокол, обычно используемый в_{лабораториях} T RM для выполнения внутрисосудистой маркировки, лимфоцитоцитов изоляции и цитометрического анализа почек CD8^и Т-клеток с помощью мыши C57BL/6, которая получила CD45.1 и P14 T-клеток и инфекции LCMV за 30^{дней до 13}. Тот же протокол может быть использован для изучения как эффектор и Т-клетки памяти в почках.

протокол

Все эксперименты на животных, выполненные в соответствии с этим протоколом, должны быть одобрены соответствующим институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC). Все процедуры, описанные здесь, были одобрены IACUC UT Health San Antonio.

1. Приемная передача Т-клеток P14 в реципиенты C57BL/6 и инфекции LCMV

1. Используйте мышей P14 в возрасте 6-12 недель. Убедитесь, что пол донора P14 TCR трансгенной мыши должны соответствовать полу C57BL/6 мышей-реципиентов. В противном случае, клетки, такие как мужские Т-клетки передачи в самок мышей приведет к иммунной опосредованное отторжение циркулирующих донорских Т-клеток примерно в 12^{дней 14}.
2. Очистить наивные CD8^и Т-клетки из селезенки и лимфатических узлов трансгенной мыши P14 TCR с помощью мыши CD8^и комплекта для очистки Т-клеток в соответствии с протоколом производителя.
   1. Короче говоря, вскрыть селезенки и лимфатических узлов, пюре образцов для создания одноклеточной подвески.
   2. Чтобы обогатить наивные Т-клетки, добавьте биотин-анти-CD44 антитела во время первого шага инкубации антител¹³.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательный выбор коммерческого комплекта, используемого на этом этапе, содержит два основных компонента для двух этапов инкубации (т.е. инкубации биотин-антителовой смеси и инкубации стрептавидина-магнитного бисера).
3. Используйте гемоцитометр, чтобы подсчитать клетки и ввести от 1000 до 10000 очищенных P14 Т-клеток в 200 йл PBS в каждом полу соответствует C57BL/6 получателя через хвостовую вену.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный протокол инъекции вены хвоста описан в шаге 2.
4. На следующий день все получатели C57BL/6 получают 2 x 10⁵ pfu LCMV Armstrong, разбавленные в 200 МЛ PBS через внутриперитонеальный маршрут.

2. Внутрисосудистая маркировка клеток CD8^и Т

ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от интересов исследования, различные точки времени могут быть выбраны после инфекции. Пример инфекции столба дня 30 (день 30 после шага 1.4) продемонстрирован, который часто рассмотрен как предыдущий пункт времени памяти для реакции клетки CD8 T.

1. Разбавить биотин анти-CD8 "антитела к 15 мкг / мл в PBS. Убедитесь, что каждая мышь получает 200 МКЛ PBS, содержащего 3 мкг антитела.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Биотин анти-CD8 антитела используется здесь так, что он будет более гибким для разработки окончательного FACS окрашивания панели. Флуоресцентные красители помечены антитела могут быть использованы непосредственно. Тем не менее, важно использовать различные клоны моноклональных антител для внутривенной маркировки по сравнению с FACS окрашивания.
2. Правильно нагреть хвостовую вену мышей накладным тепловым лампой на 5-10 мин, чтобы расширить вены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо принять дополнительные меры для предотвращения перегрева животных. Уменьшите огонь или удалите тепловую лампу, если мыши перестали передвигаться.
3. Нарисуйте 200 мкл предварительно вытянутой анти-CD8 "смесь антител в 100 U инсулин шприц (28G) и удалить любые пузырьки воздуха, перемещая поршень вверх и вниз. Согните иглу, чтобы создать угол 150 "между иглой и шприцем, скошенный вверх, так что игла будет параллельно вены.
4. Сдерживайте мышь с грызуном хваскиватель соответствующего размера и спрей хвост с 70% этанола, чтобы сделать вену хорошо видны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность ограничения должна быть сведена к минимуму.
5. Держите хвост на дистального конца большим и средним пальцами не доминирующей руки. Поместите указательный палец под сайт, где игла будет вставлена.
6. Держите шприц доминирующей рукой и вставьте иглу в вену параллельно в направлении сердца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При правильном размещении игла должна плавно перемещаться в вену.
7. Медленно вводите 200 МКЛ антител против CD8 через хвостовую вену.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть сопротивление или белая область рассматривается выше иглы на хвосте, игла не внутри вены. Начните начальную инъекцию близко к кончику хвоста. При необходимости двигайтесь вперед к нижней части хвоста для последующих инъекций.
8. Снимите иглу и осторожно нанесите сжатие до тех пор, пока кровотечение не остановится.
9. Верните мышь в клетку и усылите мышь через 3-5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши должны быть усыпляются через изофлюран камеры следуют шейки матки дислокации. Другие методы, такие как вдыхание CO₂ займет до 5 минут и может ввести ненужные изменения внутривенного времени маркировки антител.
10. Рассекают почки ножницами, передают всю почку в 1,5 мл микроцентрифугных трубок и оставляют образцы на льду до дальнейшей обработки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Intact всей почки можно безопасно хранить на льду в течение нескольких часов до последующей обработки и пищеварения.

3. Энзиматическое пищеварение почек

1. Приготовьте 6 хорошо пластин, содержащих 3 мл раствора пищеварения (RPMI/2% FCS/1 мг/мл коллагеназы B) для каждой мыши, хранить на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор коллагеназы B в более высокой концентрации (например, 20x) может быть подготовлен и сохранен при или ниже -20 градусов по Цельсию. Рабочее решение должно быть подготовлено свежим. Пожалуйста, смотрите таблицу 1 для рецептов для всех решений / буфера, используемого в текущем протоколе.
2. Добавьте 300 МКЛ раствора пищеварения в 1,5 мл микроцентрифуг образцов труб и фарш образцов почек с прямыми ножницами весной.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Почечная ткань должна быть измельчена на ные кусочки размером не более 1,5 мм в диаметре. Шаг по декапсуляции не требуется.
3. Передача образцов рубленых почек на 6 пластин, содержащих раствор пищеварения
   ПРИМЕЧАНИЕ: 6 пластин хорошо используются для удобства только тогда, когда Есть несколько образцов для обработки.
4. Инкубировать образцы при 37 градусов по Цельсию с нежным качания (около 60 об / мин) в течение 45 мин.
5. После пищеварения, пюре ткани с поршень фланг 3 мл шприца непосредственно внутри блюда, и передать в 15 мл конических трубок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно фильтрация через ситечко клетки не требуется на этом этапе, потому что плотность градиентной центрифугации выполняется рядом, чтобы очистить живые лимфоциты.
6. Спин вниз образцов на 500 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию.
7. Переусердуйте гранулы в 3 мл RPMI/10% FCS.

4. Градиентная центрифуга плотности для обогащения лимфоцитов из переваренной почки

1. Спин вниз образца на 500 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию.
2. Удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы с 5 мл смеси Percoll/RPMI (44% Percoll и 56% RPMI без FBS).
3. Положите кончик пипетки 3 мл, содержащей 3 мл 67% Percoll/PBS (67% Percoll и 33% PBS) непосредственно в нижней части каждой трубки, и медленно отпустите раствор так, чтобы тяжелый раствор (67% Percoll/PBS) образует отчетливый слой внизу и световое решение (44% Percoll/RPMI) поднимается вверх. Вместе образуются коктейльные слои.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для вновь прибывших плотность градиента среды от поставщика, добавить 1/10 объем стерильных 10x PBS в бутылку, хорошо перемешать и рассмотреть PBS сбалансированной плотности градиента среды, как 100% решение.
4. Спин образцов на 900 х г в течение 20 мин при комнатной температуре с пониженным ускорителем и настройки тормоза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для центрифуг с ускорителем и настройками тормоза (по шкале 1-9 (1 означает минимум и 9 средств максимум)), используйте 6 для ускорителя и 4 для тормоза.
5. Аккуратно снимите трубки с центрифуги, не нарушая слоев;
   ПРИМЕЧАНИЕ: Четкий слой лимфоцитов идентифицируется между слоем RPMI розового цвета и бесцветным слоем PBS.
6. Удалите верхний слой с передачи пипетки, не касаясь лимфоцитов слоя.
7. Перенесите слой лимфоцитов в новую трубку 15 мл, заполните трубку PBS/5% FCS и перемешайте трубку 4-6x медленно, чтобы обеспечить достаточное смешивание.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет важное значение для вымыть любой остаточный Percoll.
8. Спин вниз образцов на 500 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию.
9. Удалите супернатант и повторно приостановить гранулы клетки с 500 йл полной среды RPMI. Клетки готовы к окрашивания цитометрии потока.

5. Окрашивание и анализ цитометрии потока

ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, следуйте стандартному протоколу окрашивания цитометрии потока для Т-лимфоцитов.

1. Возьмите около 1 х 10^{6 клеток} для каждого FACS окрашивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте U-дно 96 хорошо пластины для окрашивания FACS. Однако, если задействовано лишь ограниченное количество образцов, можно также использовать трубки FACS объемом 5 мл.
2. Спин вниз клетки при 500 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию. Откажитесь от супернатанта.
3. Переподход каждого образца в 50 МКЛ буфера FACS, содержащего 10 мкг/мл блокатора FcR 2.4G2 FcR (анти-CD16/32 моноклонального антитела, чтобы блокировать взаимодействие между добавленными антителами FACS с FcR). Инкубировать на льду в течение 15 минут.
4. Без дальнейшего центрифугирования добавьте 50 МКЛ смеси поверхностных окрашивающих антител для каждого образца, так что окончательный объем окрашивания составляет 100 йл/каждый образец. Инкубировать на льду в течение 30 минут в темноте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Включите флуоресцентно помеченный стрептавидин (2 мкг/мл или следуйте рекомендации производителя) в смесь антител для обозначения CD8 » внутрисосудистых^CD8 и Т-клеток и использовать флуоресцентные помечены анти-CD8 "антитела для обозначения всех CD8 Т-клеток. Смесь антител производится путем добавления желаемого количества заинтересованных антител в буфер FACS.
5. Вымойте образцы с PBS дважды. Для каждого мытья, заполнить скважины 96 хорошо пластины с холодной PBS, спина на 500 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию и отказаться от супернатанта.
6. Переусердствует с клетками в 100 мкл/колодец разбавленного живого/смертного красителя. Инкубировать на льду в течение 30 минут в темноте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Даже при плотности градиент среднего спина, энзиматический этап пищеварения часто вызывает значительную гибель клеток в ткани резидентов Т-клеток из-за ARTC2.2/P2RX7^{сигнализации 15}. Live / смерть красителя окрашивания настоятельно рекомендуется до фиксации. Анти-ARTC2 нанотело может управляться в мышей до эвтаназии, чтобы предотвратить клеточной изоляции индуцированной клеточной смерти.
7. Вымойте образцы буфером FACS дважды. Для каждой стирки заполните колодцы 96-колодец пластины с холодным буфером FACS, спина на 500 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию и отказаться от супернатанта.
8. Повторное приостановление ячеек в буфере фиксации 100 йл/хорошо. Инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация буфера делается только путем разбавления формальдегида с PBS до окончательной концентрации 2% формальдегида.
9. Вымойте образцы буфером FACS дважды. Для каждой стирки заполните колодцы 96 колодцев холодным буфером FACS, вращайте при 500 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия и отбрасывайте супернатант.
10. Повторное приостановление ячеек в буфере 250 МКЛ/хорошо FACS. Печать пластины, хранить при 4 градусов по Цельсию и защитить от света до анализа FACS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед анализом FACS, фильтруем образцы через нейлоновую сетку 70 МКМ, чтобы удалить возможные кластеры клеток, которые могут засорить машину FACS.

Результаты

Протокол, описанный здесь, обобщен на диаграмме потока(рисунок 1A). На 30-й день после LCMV инфекции, мы выполнили внутрисосудистой маркировки CD8 и Т-клеток. Через 5 минут обе почки животного были вскрыты, измельчены и подверглись пищеварению коллагеназы. Лимфоциты были ...

Обсуждение

Поскольку специфический иммунитет тканей является быстро расширяющейся областью исследований, накопление доказательств свидетельствует о том, что иммунные клетки, особенно популяция лимфоцитов, могут быть выявлены почти во всех органах у взрослых людей или инфицированных или иммун?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisherbrand	05-408-130
15 ml Conical Tubes	Corning	431470
3 ml syringe	BD	309657
37C incubator	VWR
Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7)	Tonbo Biosciences	30-0081-U025
Calf Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30073.03
Collegenase B	Millipore Sigma	11088807001
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-9AM
Insulin Syringe	BD	329424
Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical	RS 5692
Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit	Biolegend	480043
overhead heat lamp	Amazon	B00333PZZG
PBS
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	17089101
rocker	VWR
RPMI	GE Healthcare Life Sciences	SH30096.01
Solid Brass Mouse Restrainer	Braintree Scientific, Inc	SAI-MBR
Swing Bucket Centrifuge with refrigerator	Thermofisher
Tissue Culture 6-well plate	Corning	3516