Isolement des cellules CD8+ T résidentes du rein de souris pour l’analyse de cytométrie de flux

Résumé

Suite à une infection virale, le rein abrite un nombre relativement important de cellules CD8⁺ T et offre la possibilité d’étudier les lymphocytes T_RM non muqueux. Ici, nous décrivons un protocole pour isoler les lymphocytes rénaux de souris pour l’analyse de cytométrie de flux.

Résumé

La cellule T de mémoire de tissu-résident_(RMT)est un domaine rapidement croissant de recherche d’immunologie. Isoler les lymphocytes T de divers tissus non lymphoïdes est l’une des étapes clés pour étudier les_RMT. Il existe de légères variations dans les protocoles d’isolement des lymphocytes pour différents organes. Le rein est un organe non lymphoïde essentiel avec de nombreuses infiltrations de cellules immunitaires, surtout après l’exposition aux pathogènes ou l’activation auto-immune. Ces dernières années, plusieurs laboratoires, y compris le nôtre ont commencé à caractériser les cellules CD8 + T^{résidentes rénales} dans divers milieux physiologiques et pathologiques chez la souris et chez l’homme. En raison de l’abondance des lymphocytes T, le rein représente un organe modèle attrayant pour étudier_{les RMT}dans les tissus non muqueux ou non-barrière. Ici, nous allons décrire un protocole couramment utilisé dans les laboratoires axés_surla RM T pour isoler les cellules CD8⁺ T des reins de souris à la suite d’une infection virale systémique. En bref, à l’aide d’un modèle aigu d’infection par le virus de la chorioméningite lymphocytique (LCMV) chez les souris C57BL/6, nous démontrons l’étiquetage intravasculaire des lymphocytes CD8⁺ T, la digestion enzymatique et la centrifugation du gradient de densité pour isoler et enrichir les lymphocytes des reins de souris afin de préparer les échantillons à l’analyse subséquente de la cytométrie du débit.

Introduction

Les cellules T de mémoire tissulaire_(RMT)représentent l’une des populations de cellules T les plus abondantes chez les souris humaines adultes et infectées. Les_{cellules T RM} fournissent la première ligne de défense immunitaire et sont impliquées de façon critique dans divers processus physiologiques et pathologiques^1,2,3,4,5. En comparaison avec les cellules T circulant, les cellules T_RM portent des marqueurs de surface distincts avec des programmes de transcription uniques^6,7,8. L’élargissement de nos connaissances_{en biologie de la} RMT est la clé pour comprendre les réponses des cellules T, ce qui est essentiel au développement futur de vaccins et d’immunothérapies à base de cellules T.

En plus des marqueurs moléculaires couramment partagés de T_RMdans tous les tissus non lymphoïdes, l’accumulation de preuves suggère que les dispositifs tissulaires spécifiques sont un composant central de la_{biologie de} RM⁹de T. Rein abrite de nombreuses cellules immunitaires, y compris_{les cellules} RM T après l’infection et offre une excellente occasion d’étudier la biologie_{des cellules} RM T dans un tissu non muqueux. L’infection aiguë de LCMV (virus lymphocytique de choriomeningitis) par voie intraperitoneal est un modèle systémique bien établi d’infection pour étudier des réponses antigène-spécifiques de cellule T chez les souris. L’infection est généralement résolue en 7-10 jours chez les souris de type sauvage et laisser un grand nombre de cellules T mémoire spécifiques au LCMV dans une variété de tissus, y compris le rein¹⁰. Les souris transgéniques P14 TCR (récepteur des lymphocytes T) portent des lymphocytes CD8⁺ T reconnaissent l’un des épitopes immuno-dominants du LCMV présentés par la molécule H2-D B de la molécule H2-D^de classe I (complexe d’histocompatibilité majeure de classe I) chez les souris C57BL/6. Combinant le transfert adoptif de cellule T de P14 agréablement marqué et l’infection de LCMV chez les souris, CD8 + effecteur^et cellules de T de mémoire sont suivis, y compris la différenciation et l’homéostasie de RM de T.

Dans certains tissus de barrière, tels que le compartiment intraepithelial intestinal de lymphocytes (IEL) et les glandes salivaires, la procédure établie d’isolement de lymphocyte donne le pourcentage élevé des_{cellules de} RM de T avec la contamination minimale de cellule T par sang dans le modèle¹¹de souris de LCMV. Cependant, dans les tissus non barrière, tels que le rein, le réseau vasculaire dense contient un grand nombre de cellules CD8⁺ T circulant. Il a été bien documenté que même la perfusion réussie ne peut pas supprimer efficacement toutes les cellules CD8⁺ T en circulation. Pour surmonter cet obstacle technique, la coloration intravasculaire d’anticorps a été établie comme l’une des techniques les plus couramment employées dans les_{laboratoires de} RM de T^12. En bref, 3-5 minutes avant l’euthanasie, 3 anticorps anti-CD8 μg/souris (pour étiqueter les lymphocytes CD8⁺ T) sont livrés par voie intraveineuse. La paroi intacte des vaisseaux sanguins empêche la diffusion rapide de l’anticorps dans ce court laps de temps (c.-à-d. 3-5 minutes) et seules les cellules intravasculaires sont étiquetées. Suivant le protocole standard d’isolement de lymphocyte, les cellules intravasculaires contre extravascular peuvent être facilement distinguées utilisant la cytométrie de flux.

Ici, nous allons décrire un protocole standard couramment utilisé dans les laboratoires T_RM pour effectuer l’étiquetage intravasculaire, l’isolement des lymphocytes et l’analyse de cytométrie du flux des cellules rénales CD8⁺ T à l’aide d’une souris C57BL/6 qui a reçu des lymphocytes T CD45.1⁺ P14 et l’infection par le LCMV 30 jours^{avant 13}. Le même protocole peut être utilisé pour étudier à la fois les cellules T effectrices et de mémoire dans le rein.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux réalisées à la suite de ce protocole doivent être approuvées par le Comité institutionnel respectif de soins et d’utilisation des animaux (IACUC). Toutes les procédures décrites ici ont été approuvées par IACUC UT Health San Antonio.

1. Transfert adoptif des cellules T P14 dans les receveurs de C57BL/6 et infection par le LCMV

1. Utilisez des souris P14 à l’âge de 6 à 12 semaines. Assurez-vous que le sexe de la souris transgénique P14 TCR donneuse doit correspondre au sexe des souris receveurs de C57BL/6. Dans le cas contraire, les cellules telles que les cellules T mâles se transférant chez les souris femelles entraîneront le rejet immunisé-médiatisé des cellules T de donneur circulant dans environ 12^{jours 14.}
2. Purifier les cellules CD8⁺ T naïves de la rate et des ganglions lymphatiques d’une souris transgénique P14 TCR à l’aide du kit de purification des cellules T CD8⁺ T de souris suivant le protocole du fabricant.
   1. Brièvement, disséquer la rate et les ganglions lymphatiques, écraser les échantillons pour générer une suspension cellulaire unique.
   2. Pour enrichir les lymphocytes T naïfs, ajoutez de l’anticorps biotine-anti-CD44 lors de la première étape d’incubation des^{anticorps 13}.
      REMARQUE : La trousse commerciale de sélection négative utilisée à cette étape contient deux composantes majeures pour deux étapes d’incubation (c.-à-d. incubation du mélange biotine-anticorps et incubation de perles magnétiques streptavidines).
3. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules et injecter de 1 000 à 10 000 cellules T P14 purifiées dans 200 μL de PBS dans chaque récepteur C57BL/6 correspondant au sexe par l’intermédiaire de la veine de la queue.
   REMARQUE : Le protocole détaillé d’injection de veine de queue est décrit dans l’étape 2.
4. Le lendemain, tous les bénéficiaires du C57BL/6 reçoivent 2 x 10 LCMV Armstrong de⁵ pfu dilués en 200 μL de PBS par un itinéraire intraperitoneal.

2. Étiquetage intravasculaire des cellules CD8⁺ T

REMARQUE : Selon les intérêts de recherche, différents points de temps peuvent être choisis après l’infection. Un exemple de jour 30 post-infection (jour 30 après l’étape 1.4) est démontré, qui est souvent considéré comme un point de temps de mémoire précoce pour la réponse des lymphocytes T CD8.

1. Diluer l’anticorps biotine anti-CD8α à 15 μg/mL dans PBS. Assurez-vous que chaque souris reçoit 200 μL de PBS contenant 3 μg d’anticorps.
   REMARQUE : L’anticorps anti-CD8 biotine est utilisé ici afin qu’il soit plus flexible pour concevoir le panneau de coloration final FACS. L’anticorps fluorescent étiqueté colorant peut être utilisé directement. Cependant, il est important d’utiliser différents clones d’anticorps monoclonaux pour l’étiquetage intraveineux par rapport à la coloration FACS.
2. Chauffer correctement la veine de la queue des souris avec une lampe thermique aérienne pendant 5-10 min pour dilater les veines.
   REMARQUE : Il faut prendre des précautions supplémentaires pour éviter la surchauffe des animaux. Réduisez le feu ou retirez la lampe thermique si les souris s’arrêtaient pour se déplacer.
3. Dessinez 200 μL d’anticorps anti-CD8α prédiluté dans une seringue à insuline 100 U (28G) et éliminez les bulles d’air en déplaçant le piston de haut en bas. Pliez l’aiguille pour créer un angle de 150° entre l’aiguille et la seringue, biseauter vers le haut, de sorte que l’aiguille sera parallèle à la veine.
4. Retenez la souris avec un restrainer de rongeur de taille appropriée et vaporisez la queue avec 70% d’éthanol pour rendre la veine clairement visible.
   REMARQUE : La durée de la retenue doit être maintenue au minimum.
5. Tenez la queue à l’extrémité distale avec le pouce et les doigts du milieu de la main non dominante. Placez l’index sous le site où l’aiguille sera insérée.
6. Tenez la seringue avec la main dominante et insérez l’aiguille dans la veine en parallèle vers la direction du cœur.
   REMARQUE : Lorsque vous vous placez correctement, l’aiguille doit se déplacer en douceur dans la veine.
7. Injectez lentement 200 μL d’anticorps anti-CD8α par la veine de la queue.
   REMARQUE : S’il y a une résistance ou si une zone blanche est vue au-dessus de l’aiguille sur la queue, l’aiguille n’est pas à l’intérieur de la veine. Commencez l’injection initiale près de la pointe de la queue. Si nécessaire, avancez vers le bas de la queue pour les injections subséquentes.
8. Retirer l’aiguille et appliquer délicatement la compression jusqu’à ce que le saignement s’arrête.
9. Retourner la souris dans la cage et euthanasier la souris après 3-5 min.
   REMARQUE : Les souris doivent être euthanasiées par chambre d’isoflurane suivie de la dislocation cervicale. D’autres méthodes, telles que_{l’inhalation de CO 2,} prennent jusqu’à 5 minutes et peuvent introduire une variation inutile du temps d’étiquetage intraveineux des anticorps.
10. Disséquer le rein à l’aide de ciseaux, transférer le rein entier à 1,5 mL de tubes de microcentrifugeuse et laisser les échantillons sur la glace jusqu’à ce que le traitement ultérieur.
    REMARQUE : Le rein entier intact peut être stocké en toute sécurité sur la glace pendant quelques heures avant le traitement et la digestion subséquents.

3. Digestion enzymatique du rein

1. Préparer 6 plaques de puits contenant 3mL de la solution de digestion (RPMI/2% FCS/1 mg/ml de Collagène B) pour chaque souris, conserver sur la glace.
   REMARQUE : La solution de collagène B à concentration plus élevée (p. ex., 20 x) peut être préparée et stockée à -20 °C ou moins. La solution de travail doit être préparée fraîchement. Veuillez consulter le tableau 1 pour les recettes de toutes les solutions/tampons utilisés dans le protocole actuel.
2. Ajouter 300 μL de solution de digestion dans les tubes d’échantillon de microcentrifugeuse de 1,5 mL et hacher les échantillons de rein à l’aide d’un ciseaux à ressort droit.
   REMARQUE : Le tissu rénal doit être émincé en morceaux même dont la taille ne doit pas avoir plus de 1,5 mm de diamètre. Aucune étape de décapsulation n’est requise.
3. Transférer les échantillons de rein hachés dans 6 plaques de puits contenant la solution de digestion
   REMARQUE : 6 plaques de puits ne sont utilisées pour plus de commodité que lorsqu’il y a plusieurs échantillons à traiter.
4. Incuber les échantillons à 37 °C avec un basculement doux (environ 60 rpm) pendant 45 min.
5. Après digestion, écraser le tissu avec la bride de piston d’une seringue de 3 mL directement à l’intérieur du plat, et transférer dans des tubes coniques de 15 mL.
   REMARQUE : Habituellement, la filtration à travers une passoire cellulaire n’est pas nécessaire à cette étape parce que la centrifugation du gradient de densité est effectuée à côté de purifier les lymphocytes vivants.
6. Faites tourner les échantillons à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
7. Resuspendez la pastille en 3 mL de RPMI/10% FCS.

4. Centrifugation de gradient de densité pour enrichir des lymphocytes du rein digéré

1. Faites tourner l’échantillon à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
2. Retirez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire avec 5 mL de mélange Percoll/RPMI de 44% (44% Percoll + 56% RPMI sans FBS).
3. Placez la pointe d’une pipette de 3 mL contenant 3 mL de 67% Percoll/PBS (67% Percoll + 33% PBS) directement au fond de chaque tube, et relâchez lentement la solution de sorte que la solution lourde (67% Percoll/PBS) forme une couche distincte au fond et la solution légère (44% Percoll/RPMI) est soulevée. Ensemble, des couches de cocktails se formeront.
   REMARQUE : Pour le milieu de gradient de densité nouvellement arrivé du fournisseur, ajoutez 1/10 volume de 10x PBS stérile à la bouteille, mélangez bien et considérez le milieu de gradient de densité équilibré par PBS comme solution de 100 %.
4. Faites tourner les échantillons à 900 x g pendant 20 min à température ambiante avec un réglage réduit de l’accélérateur et des freins.
   REMARQUE : Pour les centrifugeuses avec réglages d’accélérateur et de frein (sur une échelle de 1 à 9 (1 signifie minimum et 9 moyens maximum)), utilisez 6 pour l’accélérateur et 4 pour le frein.
5. Retirer soigneusement les tubes de la centrifugeuse sans déranger les couches;
   REMARQUE : Une couche claire de lymphocyte est identifiée entre la couche rose de RPMI de couleur et la couche incolore de PBS.
6. Retirer la couche supérieure à l’l’insurma de transfert sans toucher la couche lymphocyte.
7. Transférer la couche de lymphocytes dans un nouveau tube de 15 mL, remplir le tube de PBS/5% fcs et mélanger en inversant le tube 4-6x lentement pour assurer un mélange suffisant.
   REMARQUE : Cette étape est importante pour laver tout Percoll résiduel.
8. Faites tourner les échantillons à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
9. Retirer le supernatant et suspendre à nouveau la pastille cellulaire avec 500 μL de milieu RPMI complet. Les cellules sont prêtes pour la coloration de cytométrie d’écoulement.

5. Coloration et analyse de cytométrie de flux

REMARQUE : Veuillez suivre le protocole standard de coloration de cytométrie d’écoulement pour des lymphocytes de T.

1. Prenez environ 1 x 10⁶ cellules pour chaque coloration FACS.
   REMARQUE : Utilisez une plaque de puits U-bottom 96 pour la coloration FACS. Toutefois, si seulement un nombre limité d’échantillons sont impliqués, des tubes FACS de 5 mL peuvent également être utilisés.
2. Faites tourner les cellules à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnatant.
3. Resuspendez chaque échantillon dans 50 μL de tampon FACS contenant 10 μg/mL de bloqueur FCR 2.4G2 (un anticorps monoclonal anti-CD16/32 pour bloquer l’interaction entre l’anticorps FACS ajouté avec fcr). Incuber sur la glace pendant 15 min.
4. Sans centrifugation supplémentaire, ajouter 50 μL de mélange d’anticorps colorant de surface pour chaque échantillon de sorte que le volume final de coloration soit de 100 μL/chaque échantillon. Incuber sur la glace pendant 30 min dans l’obscurité.
   REMARQUE : Inclure la streptavidine étiquetée fluorescente (2 μg/mL ou suivre la recommandation du fabricant) dans le mélange d’anticorps pour étiqueter les lymphocytes CD8α⁺ INTRAvasculaire CD8⁺ T et utiliser des anticorps anti-CD8β étiquetés fluorescents pour étiqueter toutes les lymphocytes T CD8. Le mélange d’anticorps est fait en ajoutant les quantités désirées d’anticorps intéressés dans le tampon FACS.
5. Lavez les échantillons avec PBS deux fois. Pour chaque lavage, remplir les puits de 96 plaques de puits avec du PBS froid, tourner à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnatant.
6. Resuspendez les cellules dans 100 μL/puits de colorant vivant/mort dilué. Incuber sur la glace pendant 30 min dans l’obscurité.
   NOTE : Même avec le spin moyen de gradient de densité, l’étape enzymatique de digestion induit souvent la mort significative de cellules dans les cellules T tissue-resident dues à la signalisation d’ARTC2.2/P2RX7^15. La coloration de colorant vivant/mort est fortement recommandée avant fixation. Nanocorps anti-ARTC2 peut être administré dans les souris avant l’euthanasie pour prévenir la mort cellulaire induite par l’isolement cellulaire.
7. Lavez les échantillons avec le tampon FACS deux fois. Pour chaque lavage, remplissez les puits de la plaque de 96 puits avec tampon FACS froid, tournez à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et jetez le supernatant.
8. Resuspendez les cellules en tampon de fixation de 100 μL/puits. Incuber à 37 °C pendant 10 min.
   REMARQUE : La fixation du tampon est faite fraîchement en diluant le formaldéhyde avec le PBS à une concentration finale de formaldéhyde de 2 %.
9. Lavez les échantillons avec le tampon FACS deux fois. Pour chaque lavage, remplir les puits de 96 plaques de puits avec un tampon FACS froid, tourner à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le supernatant.
10. Resuspendez les cellules en tampon FACS de 250 μL/puits. Sceller la plaque, la conserver à 4 °C et la protéger de la lumière jusqu’à l’analyse facs.
    REMARQUE : Avant l’analyse facs, filtrer les échantillons à travers un maillage en nylon de 70 μM pour éliminer les grappes cellulaires possibles qui peuvent obstruer la machine FACS.

Résultats

Le protocole décrit ici est résumé dans un diagramme de flux (Figure 1A). Au jour 30 infection de poteau de LCMV, nous avons exécuté l’étiquetage intravasculaire des cellules CD8⁺ T. 5 minutes plus tard, les deux reins de l’animal ont été disséqués, hachés finement et soumis à la digestion des collagènes. Les lymphocytes ont été purifiés à partir des échantillons digérés par centrifugation percoll et analysés par cytométrie d’écoulement. Comme le montr...

Discussion

Comme l’immunité spécifique aux tissus est un domaine de recherche en expansion rapide, l’accumulation de preuves suggère que les cellules immunitaires, en particulier la population de lymphocytes peuvent être identifiés dans presque tous les organes chez les souris adultes humaines ou infectées ou immunisées. Le modèle d’infection de souris de LCMV est un modèle bien établi pour étudier la réponse de cellule T antigène-spécifique, l’effecteur et la différenciation de cellule T de mémoire comprena...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisherbrand	05-408-130
15 ml Conical Tubes	Corning	431470
3 ml syringe	BD	309657
37C incubator	VWR
Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7)	Tonbo Biosciences	30-0081-U025
Calf Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30073.03
Collegenase B	Millipore Sigma	11088807001
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-9AM
Insulin Syringe	BD	329424
Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical	RS 5692
Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit	Biolegend	480043
overhead heat lamp	Amazon	B00333PZZG
PBS
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	17089101
rocker	VWR
RPMI	GE Healthcare Life Sciences	SH30096.01
Solid Brass Mouse Restrainer	Braintree Scientific, Inc	SAI-MBR
Swing Bucket Centrifuge with refrigerator	Thermofisher
Tissue Culture 6-well plate	Corning	3516