유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8+ T 세포의 격리

요약

바이러스 감염에 이어 신장은 비교적 많은 수의 CD8⁺ T 세포를 수용하고 비 점막 T_RM 세포를 연구할 기회를 제공합니다. 여기서는 유동 세포측정 분석을 위해 마우스 신장 림프구를 분리하는 프로토콜을 설명합니다.

초록

조직-주민 기억 T 세포 (T_RM)는면역학 연구의 급속하게 확장 분야입니다. 다양한 비 림프구 조직에서 T 세포를 격리하는 것은 T_RMs를 조사하는 주요 단계 중 하나입니다. 다른 장기에 대한 림프구 절연 프로토콜에는 약간의 변화가 있습니다. 신장은 병원체 노출 또는 자가 면역 활성화 후에 특히 수많은 면역 세포 침투를 가진 필수적인 비 림프구 기관입니다. 최근 몇 년 동안, 우리 자신의 여러 실험실은 마우스와 인간 모두에서 다양한 생리 및 병리학 적 설정에서 신장 거주자 CD8⁺ T 세포를 특성화하기 시작했다. T 림프구의 풍부로 인해 신장은 비 점막 또는 비 장벽 조직에서 T_RMs를 연구하는 매력적인 모델 기관을 나타냅니다. 여기에서, 우리는 전신 바이러스성 감염 다음 마우스 신장에서 CD8⁺ T 세포를 격리하기 위하여 T_RM집중한 실험실에서 일반적으로 이용되는 프로토콜을 설명할 것입니다. 간략하게, C57BL/6 마우스에서 급성 림프구성 초리오메닌염 바이러스(LCMV) 감염 모델을 사용하여, 마우스 신장에서 림프구를 분리하고 농축하기 위해 마우스 신장에서 림프구를 분리하고 농축하는 진래성 CD8⁺ T 세포 라벨링, 밀도 그라데이션 원심을 시연하여 후속 사이클분석을 위한 시료를 준비하고 있다.

서문

조직-상주 기억(T_RM)T 세포는 성인 인간 및 감염된 마우스에서 가장 풍부한 T 세포 집단 중 하나를 나타낸다. T_RM 세포는 면역 방어의 첫 번째 라인을 제공하고 다양한 생리학적 및 병리학^적과정에 비판적으로^{관여1,2,3,4,5.} 순환 T 세포와 비교하여 T_RM 세포는 고유한 전사 프로그램^6,7,8을가진 뚜렷한 표면^마커를운반한다. T_RM 생물학에 대한 지식을 확장하는 것은 T 세포 기반 백신 및 면역 요법의 미래 발달에 필수적인 T 세포 반응을 이해하는 열쇠입니다.

모든 비 림프구 조직에 걸쳐 T_RMs의일반적으로 공유 분자 마커 이외에, 축적 증거는 조직 특정 특징이 T_RM 생물학^9의중앙 구성 요소임을 시사한다. 신장은 감염 후에 T_RM 세포를 포함하여 많은 면역 세포를 항구하고 비 점막 조직에서 T_RM 세포 생물학을 공부하는 좋은 기회를 제공합니다. 급성 LCMV(림프구성 초뇌염 바이러스) 감염은 관면 경로를 통한 잘 확립된 조직 감염 모델로 마우스에서 항원 특이적 T 세포 반응을 연구한다. 감염은 일반적으로 야생 형 마우스에서 7-10 일 이내에 해결되고 신장^10을포함한 다양한 조직에서 많은 수의 LCMV 특이적 메모리 T 세포를 남깁니다. P14 TCR(T 세포 수용체) 형질전환 마우스는 C57BL/6 마우스에서 MHC-I(클래스 I 주요 조직적합성 복합체) 분자 H2-D^b에 의해 제시된 LCMV의 면역 지배적 인 에피토프 중 하나를 인식CD8+ T 세포를 운반한다. 쥐에서 친자적으로 표시된 P14 T 세포 입양 전달 및 LCMV 감염을 결합하면 CD8⁺ 이펙터 및 메모리 T 세포가 T_RM 분화 및 항상성을 포함하여 추적됩니다.

장 내 상피 림프구(IEL) 구획 및 침샘과 같은 일부 장벽 조직에서는, 확립된 림프구 절연 절차는 마우스 LCMV^{모델(11)에서}혈액 매개 T 세포 오염을 최소화한 T_RM 세포의 높은 비율을 산출한다. 그러나 신장과 같은 비장벽 조직에서 조밀한 혈관 망에는 많은 수의 순환 CD8⁺ T 세포가 포함되어 있습니다. 성공적인 관류조차도 모든 순환 CD8⁺ T 세포를 효율적으로 제거할 수 없다는 것이 잘 문서화되어 있습니다. 이러한 기술적 장애물을 극복하기 위해, 내트라바스 항체 염색은 T_RM ^{실험실(12)에서}가장 일반적으로 사용되는 기술 중 하나로 확립되었다. 잠시, 안락사 전에 3-5 분, 3 μg /마우스 안티 CD8 항체 (CD8⁺ T 세포를 레이블) 정맥으로 전달된다. 그대로 혈관 벽은 시간의 이 짧은 기간 (즉, 3-5 분) 안에 항체의 급속한 확산을 방지하고 단지 내트라바스 내 세포가 표지됩니다. 표준 림프구 절연 프로토콜에 따라, 비대 혈관 세포대 는 유동 세포 세포를 사용하여 쉽게 구별될 수 있다.

여기서, 우리는^13일전에 CD45.1⁺ P14 T 세포 및 LCMV 감염을 받은 C57BL/6 마우스를 사용하여 신장 CD8+ T 세포의 신장^CD8+ T 세포의 내트라바스 내 라벨링, 림프구 절연 및 유동 세포 측정 분석을 수행하기 위해 T_RM 실험실에서 일반적으로 사용되는 표준 프로토콜을 설명할 것이다. 동일한 프로토콜은 신장에 있는 이펙터 및 메모리 T 세포를 둘 다 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜에 따라 수행된 모든 동물 실험은 각 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받아야 합니다. 여기에 설명 된 모든 절차는 IACUC UT 건강 샌 안토니오에 의해 승인되었습니다.

1. P14 T 세포의 채택 전달 C57BL/6 받는 사람 및 LCMV 감염

1. 6-12 주에 P14 마우스를 사용 하십시오. 기증자 P14 TCR 형질전환 마우스의 성별이 C57BL/6 받는 쥐의 성별과 일치해야 하는지 확인하십시오. 그렇지 않으면, 암컷 마우스로 옮겨지는 남성 T 세포와 같은 세포는 12일 경에 순환하는 기증자 T 세포의 면역 매개 거부를 초래할 것이다^14.
2. 제조 업체의 프로토콜에 따라 마우스 CD8⁺ T 세포 정화 키트를 사용하여 P14 TCR 형질형 마우스의 비장 및 림프절에서 순진한 CD8⁺ T 세포를 정화합니다.
   1. 간략하게 비장과 림프절을 해부하고 샘플을 으깨서 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
   2. 순진한 T 세포를 농축하려면, 제1 항체 인큐베이션^{단계(13)에서}비오틴 항 CD44 항체를 첨가한다.
      참고: 이 단계에서 사용되는 음의 선택 상용 키트에는 두 단계의 인큐베이션(즉, 비오틴 항체 혼합물 인큐베이션 및 스트렙타비딘 자성 비드 인큐베이션)에 대한 두 가지 주요 성분이 포함되어 있습니다.
3. 혈혈계를 사용하여 세포를 계산하고 200 μL에 1,000 ~10,000개의 정제된 P14 T 세포를 꼬리 정맥을 통해 각 성일치 C57BL/6 수신자에게 주입한다.
   참고: 상세한 꼬리 정맥 주입 프로토콜은 2단계에서 설명됩니다.
4. 다음 날, 모든 C57BL/6 수신자는 복막 경로를 통해 PBS의 200 μL에서 희석된 2 x 10⁵ pfu LCMV 암스트롱을 받습니다.

2. CD8⁺ T 셀의 내트라바스큘러 라벨링

참고: 연구 관심사에 따라 감염 후 다른 시간 점을 선택할 수 있습니다. 일 30 포스트 감염의 예 (단계 후 30 단계 1.4) 종종 CD8 T 세포 응답에 대한 초기 메모리 시간 지점으로 간주됩니다.

1. PBS에서 비오틴 항 CD8α 항체를 15 μg/mL로 희석시다. 각 마우스가 3μg 항체를 포함하는 PBS의 200 μL을 수신하도록 합니다.
   참고: 비오틴 안티 CD8 항체는 최종 FACS 염색 패널을 설계하는 것이 더 유연할 수 있도록 여기에 사용됩니다. 형광염표지 항체는 직접 사용될 수 있다. 그러나, FACS 염색 대 정맥 라벨링에 대 한 단일 클론 항체의 다른 클론을 사용 하 여 중요 하다.
2. 마우스의 꼬리 정맥을 5-10분 동안 오버 헤드 열램프로 가열하여 정맥을 팽창시킵니다.
   참고: 동물과과열을 방지하기 위해 각별한 주의를 기울여야 합니다. 마우스가 움직이지 않으면 열을 줄이거나 열램프를 제거합니다.
3. 100 U 인슐린 주사기(28G)에 미리 희석된 안티 CD8α 항체 혼합물의 200 μL을 끌어내고 피스톤을 위아래로 이동하여 기포를 제거합니다. 바늘을 구부려 바늘과 주사기 사이에 150° 각도를 만들고, 벨위로, 그래서 바늘은 정맥과 평행할 것입니다.
4. 적절한 크기의 설치류 억제제로 마우스를 억제하고 70%에탄올로 꼬리를 스프레이하여 정맥을 명확하게 볼 수 있도록 합니다.
   참고: 구속 기간은 최소한으로 유지되어야 합니다.
5. 지배적이지 않은 손의 엄지와 가운데 손가락으로 말단 끝에 꼬리를 잡습니다. 바늘이 삽입될 사이트 아래에 검지 손가락을 놓습니다.
6. 주사기를 지배적인 손으로 잡고 바늘을 정맥에 넣고 심장의 방향을 향해 평행하게 삽입합니다.
   참고: 올바르게 배치할 때 바늘은 정맥으로 원활하게 이동해야 합니다.
7. 꼬리 정맥을 통해 200 μL의 항 CD8α 항체를 천천히 주입하십시오.
   참고: 꼬리에 바늘 위에 저항 또는 백색 영역이 보이는 경우, 바늘은 정맥 안쪽에 있지 않습니다. 꼬리 끝 부분에 가까운 초기 주입을 시작합니다. 필요한 경우, 후속 주사에 대 한 꼬리의 바닥을 향해 앞으로 이동.
8. 바늘을 제거하고 출혈이 멈출 때까지 압축을 부드럽게 적용합니다.
9. 마우스를 케이지로 되돌리고 3-5분 후에 마우스를 안락사시하십시오.
   참고: 마우스는 자궁 경부 탈구 다음에 이소플루란 챔버를 통해 안락사되어야 합니다. CO₂ 흡입과 같은 다른 방법은 최대 5분이 소요되며 정맥 내 항체 라벨링 시간의 불필요한 변화를 유발할 수 있다.
10. 가위를 사용하여 신장을 해부하고, 신장 전체를 미세 원심 분리 튜브의 1.5 mL로 옮기고 추가 처리가 될 때까지 샘플을 얼음 위에 둡니다.
    참고: 손상되지 않은 전체 신장은 후속 처리 및 소화 전에 몇 시간 동안 얼음에 안전하게 보관할 수 있습니다.

3. 신장의 효소 소화

1. 각 마우스에 3mL의 소화용액(RPMI/2% FCS/1 mg/ml 콜라게나아제 B)을 함유한 6개의 웰 플레이트를 준비하여 얼음 위에 보관합니다.
   참고: 주식 콜라게나아제 B 용액이 농도가 높은(예: 20x)에서 -20°C 이하로 제조 및 보관할 수 있습니다. 작업 솔루션은 신선하게 준비해야 합니다. 현재 프로토콜에 사용되는 모든 솔루션/버퍼에 대한 레시피에 대한 표 1을 참조하십시오.
2. 1.5mL 마이크로센심분리기 샘플 튜브에 300 μL의 소화 용액을 추가하고 신장 샘플을 직선 스프링 가위로 다진다.
   참고: 신장 조직은 직경이 1.5mm 이하의 크기로 균일한 조각으로 잘라야 합니다. 캡슐화 단계가 필요하지 않습니다.
3. 다진 신장 샘플을 소화 용액을 함유한 6개의 웰 플레이트로 이송
   참고: 6개의 웰 플레이트는 처리해야 할 샘플이 여러 개 있을 때만 편의를 위해 사용됩니다.
4. 37°C에서 부드러운 흔들림(약 60rpm)으로 샘플을 45분 동안 배양합니다.
5. 소화 후, 접시 내부에 직접 3mL 주사기의 플런저 플랜지로 조직을 으깨고 15mL 원문 튜브로 옮김합니다.
   참고: 밀도 그라데이션 원심분리가 살아있는 림프구를 정화하기 위해 옆에서 수행되기 때문에 일반적으로 세포 스트레이너를 통한 여과는 이 단계에서 필요하지 않습니다.
6. 4°C에서 5분 동안 500 x g의 샘플을 회전시.
7. RPMI/10% FCS의 3mL에서 펠릿을 다시 중단합니다.

4. 소화된 신장에서 림프구를 풍부하게 하기 위한 밀도 그라데이션 원심분리

1. 4°C에서 5분 동안 500 x g의 샘플을 회전시.
2. 상체를 제거하고 44 % Percoll / RPMI 믹스 (44 % Percoll + 56 % FBS없이 RPMI)의 5 mL로 셀 펠릿을 다시 중단하십시오.
3. 각 튜브의 바닥에 67% Percoll/PBS(67% Percoll + 33% PBS)의 3mL을 함유한 3mL 파이펫의 끝을 넣고, 무거운 용액(67% Percoll/PBS)이 바닥에 뚜렷한 층을 형성하고 광용액(Percoll/RPMI)이 상승하도록 솔루션을 천천히 방출한다. 함께 칵테일 레이어가 형성됩니다.
   참고: 공급업체에서 새로 도착한 밀도 그라데이션 배지의 경우 1/10 부피의 멸균 10x PBS를 병에 넣고 잘 섞고 PBS 균형 밀도 그라데이션 배지를 100% 솔루션으로 고려하십시오.
4. 가속기와 브레이크 설정을 줄인 실온에서 20분 동안 900 x g로 샘플을 회전시.
   참고: 가속기 및 브레이크 설정이 있는 원심분리기의 경우(1-9스케일(최소 1회, 최대 9회)에 가속기용 6개, 브레이크에 4를 사용하십시오.
5. 조심스럽게 층을 방해하지 않고 원심분리기에서 튜브를 제거;
   참고: 분홍색 색상 RPMI 층과 무색 PBS 층 사이에 명확한 림프구 층이 식별됩니다.
6. 림프구 층을 만지지 않고 이송 파이펫으로 위쪽 레이어를 제거합니다.
7. 림프구 층을 새로운 15mL 튜브로 옮기고, 튜브를 PBS/5% FCS로 채우고 튜브를 4-6x 천천히 반전시켜 충분한 혼합을 보장합니다.
   참고: 이 단계는 잔류 퍼콜을 씻어내는 것이 중요합니다.
8. 4°C에서 5분 동안 500 x g의 샘플을 회전시.
9. 상체를 제거하고 완전한 RPMI 배지의 500 μL로 셀 펠릿을 다시 중단합니다. 세포는 유동 세포측정 얼룩에 대한 준비가되어 있습니다.

5. 유동 세포측정물 염색 및 분석

참고: T 림프구에 대한 표준 흐름 세포측정 염색 프로토콜을 따르십시오.

1. 각 FACS 염색에 대해 약 1 x 10⁶ 셀을 복용하십시오.
   참고: FACS 염색에 U-바닥 96 웰 플레이트를 사용합니다. 그러나 제한된 수의 샘플만 있으면 5mL FACS 튜브도 사용할 수 있습니다.
2. 4°C에서 5분 동안 500 x g의 셀을 회전시. 상부체를 폐기합니다.
3. 2.4G2 FcR 차단제의 10 μg/mL을 포함하는 FACS 버퍼의 50 μL에서 각 샘플을 재연 (FCR과 추가 된 FACS 항체 사이의 상호 작용을 차단하는 안티 CD16/32 단일 클론 항체). 15분 동안 얼음에 배양합니다.
4. 추가 원심 분리없이, 최종 염색 부피가 100 μL / 각 샘플되도록 각 샘플에 대한 표면 염색 항체 혼합물의 50 μL을 추가합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 얼음에 배양.
   참고: CD8α⁺ 내트라바스 CD8⁺ T 세포를 라벨로 표시하고 모든 CD8 T 세포에 라벨을 붙이는 형광 성 연쇄상 구균(2 μg/mL 또는 제조업체의 권장 사항을 따르십시오)을 포함합니다. 항체 혼합물은 FACS 버퍼에 원하는 양의 관심 있는 항체를 첨가하여 만들어집니다.
5. PBS로 샘플을 두 번 세척합니다. 각 세척에 대해, 차가운 PBS와 96 웰 플레이트의 우물을 채우고, 4 °C에서 5 분 동안 500 x g에서 회전하고 상수판을 폐기하십시오.
6. 희석 된 라이브 / 죽음의 염료의 100 μL / 웰에서 세포를 다시 중단합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 얼음에 배양.
   참고: 밀도 그라데이션 배지 스핀이 있더라도 효소 소화 단계는 ARTC2.2/P2RX7 신호^15로인해 조직 거주자 T 세포에서 중요한 세포 사멸을 유도합니다. 라이브/데스 염료 염색은 고정 하기 전에 적극 권장 합니다. 항-ARTC2 nanobody 세포 격리 유도 세포 죽음을 방지 하기 위해 안락사 전에 마우스로 관리 될 수 있습니다.
7. FACS 버퍼로 샘플을 두 번 세척합니다. 각 세척에 대해, 차가운 FACS 버퍼와 96 웰 플레이트의 우물을 채우고, 4 °C에서 5 분 동안 500 x g에서 회전하고 상체를 폐기하십시오.
8. 100 μL/웰 고정 버퍼에서 셀을 다시 일시 중지합니다. 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
   참고: 고정 버퍼는 PBS로 포름알데히드를 2% 포름알데히드의 최종 농도로 희석하여 신선하게 만들어집니다.
9. FACS 버퍼로 샘플을 두 번 세척합니다. 각 세척에 대해, 차가운 FACS 버퍼와 96 웰 플레이트의 우물을 채우고, 4 °C에서 5 분 동안 500 x g에서 회전하고 상체를 폐기하십시오.
10. 250 μL/잘 FACS 버퍼에서 셀을 다시 중단합니다. 플레이트를 밀봉하고 4°C에 보관하고 FACS 분석까지 빛으로부터 보호하십시오.
    참고: FACS 분석 전에 70 μM 나일론 메시를 통해 샘플을 필터링하여 FACS 기계를 막을 수 있는 가능한 셀 클러스터를 제거합니다.

결과

여기에 설명된 프로토콜은 플로우차트(그림 1A)로요약되어 있습니다. 30 일째LCMV 감염, 우리는 CD8⁺ T 세포의 내트라바스큘러 라벨링을 수행했습니다. 5분 후, 동물의 두 신장은 해부되고, 다진 후 콜라게나아제 소화를 당했습니다. 림프구는 Percoll 원심분리를 통해 소화된 시료로부터 더 정제되었고 유동 세포측정에 의해 분석되었다. 도 1B에도시?...

토론

조직 특정 면역은 연구의 급속한 확장 영역으로, 축적 증거는 면역 세포, 특히 림프구 인구성인 인간 또는 감염 또는 예방 접종 마우스에 거의 모든 기관에서 식별 될 수 있음을 시사한다. LCMV 마우스 감염 모델은 여러 조직에 걸쳐 T_RM 생물학을 포함하는 항원 특이적 T 세포 반응, 이펙터 및 메모리 T 세포 분화를 연구하는 잘 확립된 모델이다. 여기서, 우리는 신장에 있는 CD8⁺ T 세포?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisherbrand	05-408-130
15 ml Conical Tubes	Corning	431470
3 ml syringe	BD	309657
37C incubator	VWR
Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7)	Tonbo Biosciences	30-0081-U025
Calf Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30073.03
Collegenase B	Millipore Sigma	11088807001
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-9AM
Insulin Syringe	BD	329424
Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical	RS 5692
Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit	Biolegend	480043
overhead heat lamp	Amazon	B00333PZZG
PBS
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	17089101
rocker	VWR
RPMI	GE Healthcare Life Sciences	SH30096.01
Solid Brass Mouse Restrainer	Braintree Scientific, Inc	SAI-MBR
Swing Bucket Centrifuge with refrigerator	Thermofisher
Tissue Culture 6-well plate	Corning	3516