הדמיה של Pseudomonas aeruginosa בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטות להדמיה של תאי חיידקים ורב-סוכר סינתזת רב-סוכר (Psl) בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס.

Abstract

גילוי מוקדם ומיגור של Pseudomonas aeruginosa בריאות של חולי סיסטיק פיברוזיס יכול להפחית את הסיכוי לפתח זיהום כרוני. התפתחות זיהומים כרוניים של P. aeruginosa קשורה לירידה בתפקוד הריאות ולעלייה בתחלואה. לכן, יש עניין רב להבהיר את הסיבות לכישלון למגר P. aeruginosa עם טיפול אנטיביוטי המתרחשת בכ 10-40% מהחולים ילדים. אחד הגורמים הרבים שיכולים להשפיע על פינוי הפונדקאי של P. aeruginosa ורגישות לאנטיביוטיקה הוא שינויים בארגון המרחבי (כגון צבירה או היווצרות ביופילם) וייצור פוליסכרידים. לכן, היינו מעוניינים לדמיין את המאפיינים באתרו של P. aeruginosa בתוך כיח של חולי CF. טכניקת ניקוי רקמות יושמה על דגימות כיח לאחר הטמעת הדגימות במטריצת הידרוג'ל כדי לשמור על המבנים התלת-ממדיים ביחס לתאים המארחים. לאחר ניקוי הרקמות, נוספו תוויות פלואורסצנטיות וצבעים כדי לאפשר הדמיה. הכלאה פלואורסצנטית באתרו בוצעה לצורך הדמיה של תאי חיידקים, קשירה של נוגדנים אנטי-PSL המסומנים באופן פלואורסצנטי להדמיה של האקסופוליסכריד וצביעה DAPI כדי להכתים תאים מארחים כדי לקבל תובנה מבנית. שיטות אלה אפשרו הדמיה ברזולוציה גבוהה של P. aeruginosa בתוך כיח של חולי CF באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

Introduction

במחקר זה, ניסויים תוכננו כדי לדמיין את המבנה in vivo של Pseudomonas aeruginosa בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס ילדים (CF). זיהומים P. aeruginosa הופך כרוני ב 30-40% מאוכלוסיית CF ילדים; ברגע זיהומים כרוניים להתבסס, הם כמעט בלתי אפשרי לחסל¹. P. aeruginosa מבודד מחולים עם זיהום מוקדם הם בדרך כלל רגישים יותר מיקרוביאלית, ולכן, אלה מטופלים עם אנטיביוטיקה אנטי pseudomonal כדי למנוע הקמת זיהום כרוני². למרבה הצער, לא כל המבודדים של P. aeruginosa מנוקים ביעילות מהריאה לאחר טיפול אנטיביוטי. המנגנונים המדויקים הקשורים לכשל אנטיביוטי לא הובהרו במלואם. מחקרים קודמים הראו כי שינויים בצפיפות תאי ביופילם, צבירה וייצור רב-סוכר יכולים להשפיע על יעילות אנטיביוטיקה³. P. aeruginosa מייצר שלושה רב-סוכרים חוץ-תאיים: Pel, Psl ו-alginate⁴. לרוב הזנים של P. aeruginosa יש את היכולת הגנטית לבטא כל אחד מהאקסופוליסכרידים, אם כי לעתים קרובות סוג אחד של פוליסכריד מבוטא בעיקר⁵. אלגינט exopolysaccharide קשור לזיהומים כרוניים בריאה CF, וכתוצאה מכך פנוטיפ רירית ^6,7. לרב-סוכרים Pel ו-Psl תפקידים רבים, כולל סיוע בהתקשרות ראשונית ושמירה על מבנה הביופילם, והענקת עמידות לאנטיביוטיקה⁸.

שיטות שמטרתן לדמיין מבנים in vivo של רקמות פותחו עבור מגוון רחב של סוגי מדגם 9,10,11. לאחרונה, הם הותאמו כדי לדמיין קהילות מיקרוביאליות in vivo בתוך כיח מחולי CF¹². אופטימיזציה של פרוטוקול ניקוי רקמות במיוחד לזיהוי קהילות מיקרוביאליות בתוך כיח פותחה על ידי DePas et al., 2016¹². המונח MiPACT, ראשי תיבות של microbial identification after Passive CLARITY technique, נטבע לניקוי כיח CF^11,12. עבור טכניקות ניקוי רקמות, הדגימות מתוקנות תחילה, ולאחר מכן הופכות לשקופות תוך השארת הארכיטקטורה הטבועה בהן ללא פגע לצורך צביעה והדמיה מיקרוסקופית¹¹. תיקון וניקוי דגימות כיח CF מאפשרים לחוקרים לענות על שאלות הקשורות למבנה הביופילם, צפיפות תאי חיידקים, קשרים רב-מיקרוביאליים וקשרים בין פתוגנים לתאים מארחים. היתרון של בחינה ישירה של חיידקים שנשתמרו בתוך הכיח הוא שניתן לנתח אותם ולדמיין אותם בהקשר ספציפי למארח. למרות שגידול חוץ גופי של מבודדים קליניים במעבדה לניסויים יכול להיות אינפורמטיבי מאוד, שיטות כאלה אינן מסוגלות לשחזר באופן מלא את סביבת הריאות של CF, וכתוצאה מכך נוצר נתק בין תוצאות המעבדה לבין תוצאות המטופלים.

ניתן להשתמש בשיטות המוצגות כאן כדי לתקן ולנקות כיח כדי לדמיין חיידקים, בין אם מחולי CF או חולים עם זיהומים אחרים בדרכי הנשימה. הסוג הספציפי של צביעה וניתוח מיקרוסקופי המתואר כאן הוא הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH), ואחריה קשירת נוגדנים נגד PSL בתוך ההידרוג'ל, וניתוח עוקב באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM). לאחר ניקוי רקמות, ניתן ליישם גם שיטות אחרות של אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

אישור ועדת האתיקה של המחקר (REB) נדרש כדי לאסוף ולאחסן דגימות כיח מנבדקים אנושיים. מחקרים המוצגים כאן אושרו על ידי בית החולים לילדים חולים REB#1000058579.

1. איסוף כיח

1. יש לאחסן את הכיח הצפוי בכוס איסוף סטרילית ולאחסן מיד בטמפרטורה של 4°C למשך 24 שעות לכל היותר לפני הקיבוע.
   הערה: השארת הכיח זמן רב מדי בטמפרטורה של 4°C ללא קיבוע עלולה להוביל לפירוק התאים, במיוחד להתפרקות תאי הדם הלבנים. קיבוע בהקדם האפשרי עדיף.
2. מעבירים את דגימות הכיח לצינור סטרילי של 15 מ"ל.
3. הוסף נפח שווה של 4% paraformaldehyde (PFA) לדגימות כיח. לדוגמה, אם דגימת הכיח היא 0.5 מ"ל, הוסף 0.5 מ"ל של 4% PFA. מערבבים בהיפוך עדין.
4. לדגור על כיח לילה ב 4 °C (75 °F).
5. לשטוף את הדגימה על ידי הוספת 5 מ"ל של פוספט buffered מלוחים (PBS) לכל 2 מ"ל של כיח קבוע.
   הערה: אין צורך בצנטריפוגה לשלב שטיפה זה.
6. בזהירות להסיר את supernatant עם פיפטה.
   הערה: הימנעו מלמצוץ את הכיח עם פיפטה על ידי הפניית הקצה הרחק מהכיח ושאפו לאט מאוד מהנוזל שעל פני השטח. שלב השטיפה אינו כרוך בצנטריפוגה כדי לא להפריע לשלמות המבנית של תקעי הכיח.
7. חזור על שלבים 1.6-1.7 פעמיים נוספות.
8. השהה מחדש את הגלולה בנפח פי 2 של PBS עם 0.01% (w/v) נתרן אזיד.
9. לאחסן את הכיח ב 4 °C.

2. MiPACT (טכניקת ניקוי רקמות) עיבוד של כיח

1. יש לנטרל את רכיבי ההידרוג'ל (30% 29:1 אקרילאמיד:bis-acrylamide, hardner ו-PBS) במיכל אטום המכיל אריזה אנאירובית לפני 72 שעות.
   הערה: האריזה האנאירובית והמיכל האטום נחוצים מכיוון שחמצן מעכב פילמור אקרילאמיד. לחלופין, ניתן להסיר חמצן על ידי ביצוע שלב זה במכסה מנוע אנאירובי, על ידי מריחת ואקום על מיכל אטום, או על ידי בעבוע גז N₂ דרך תערובת האקרילאמיד.
   1. הוסף 2 מ"ל של 30% 29:1 תמיסת אקרילאמיד:ביס-אקרילאמיד לצינור 15 מ"ל כשהמכסה כבוי בתוך המיכל האנאירובי האטום.
   2. צור מלאי מרוכז של 10% (w/v) מקשה על ידי הוספת 0.5 גרם של מקשה ל- 5 מ"ל PBS בצינור של 15 מ"ל. השאירו את הפקק מחוץ לצינור ואחסנו במיכל האנאירובי האטום.
   3. השאירו כמה מ"ל של PBS סטרילי בצינור, כשהמכסה כבוי, בתוך המיכל האנאירובי.
2. הפוך 5 מ"ל פתרון של הידרוג'ל עם ריכוז סופי של 0.2% מקשה ו 4% 29: 1 אקרילאמיד: bis-acrylamide ב PBS בצינור 15 מ"ל. מערבבים בהיפוך ומסננים.
3. מוציאים דגימות כיח מהמקרר, ואז חותכים לחתיכות קטנות (בערך 5 מ"מ קוטר) בתנאים סטריליים עם אזמל.
   הערה: אם הכיח נוזלי למדי עדיין ניתן לבצע שלב זה, עם זאת, נדרשת סבלנות מוגברת ותרגול כדי להסיר את הכיח מתמיסת האחסון בפינצטה לפני השימוש באזמל כדי להפריד את השברים הרצויים.
4. הניחו את דגימות הכיח החתוכות בתוך באר של מגלשת זכוכית כיסוי בעלת 8 תאים.
5. הוסף 300 μL של תמיסת הידרוג'ל מעוקרת מסנן משלב 2.2 לכל אחת מהבארות המכילות כיח.
6. הניחו את 8 תאי הזכוכית בתוך מיכל אטום המכיל אריזה אנאירובית למשך 3 שעות בטמפרטורה של 37°C.
   הערה: לאחר פולימר הידרוג'ל עם כיח מוטבע צריך להיות עקביות של ג'ל מוצק.
7. העבירו את דגימות כיח ההידרוג'ל המוצק לצינור תרבית של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של 8% נתרן דודציל סולפט (SDS), pH 8, ואפשרו לדגימות להתנקות במשך 3-14 ימים בטמפרטורה של 37°C (עם או בלי טלטול), עד שהכיח הופך שקוף.
   הערה: זמני הניקוי תלויים בהרכב הכיח ובדרך כלל ניתן להפחית אותם עם רעידות. עם זאת, יש להקפיד שלא להגביר את מהירות הרעידה עד כדי הפרעה לשלמות הדגימה. לדגימות עשירות יותר בדנ"א לוקח זמן רב יותר להתנקות בהשוואה לדגימות עשירות בליחה.
8. יש לרוקן את פתרון 8% SDS לתוך מיכל איסוף פסולת. באמצעות פינצטה סטרילית להעביר כל דגימה משובצת הידרוג'ל לצינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל. הוסף 10 מ"ל של PBS לכל אחד צינורות חרוטי 50 מ"ל כדי לשטוף את hydrogels ולתת את הפתרון לשבת במשך 30 דקות עד 1 שעה לפני decanting. חזור על פעולה זו פעמיים נוספות.
   הערה: שלב שטיפה זה אינו כרוך בצנטריפוגה. עודף נוזל supernatant מוסרים בזהירות עם פיפטה.
9. אחסנו דגימות שטופות ב-PBS עם 0.01% (w/v) נתרן אזיד ו-1x מעכב RNase ב-4°C.

3. פרוטוקול הכלאה פלואורסצנטית של הידרוג'ל באתרו (FISH)

1. הסירו את דגימות ההידרוג'ל מתמיסת האחסון שלהן באמצעות פינצטה סטרילית והניחו את הדגימות על משטח סטרילי (כגון מגלשת זכוכית או צלחת פטרי).
2. בעזרת אזמל סטרילי חותכים את ההידרוג'לים לפרוסות בעובי ~ 1 מ"מ.
3. מניחים את חלקי ההידרוג'ל בקוטר 1 מ"מ בתוך צינורות סטריליים של 1.5 מ"ל.
4. הכן 1 מ"ל את חיץ ההכלאה (25% פורממיד, 0.9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7.6], 0.01% SDS, מטוהר ונטול יונים H₂O) בצינור של 1.5 מ"ל.
5. הוסף את הגשושית PseaerA המסומנת באופן פלואורסצנטי (150.7 ננומטר¹²) למאגר ההכלאה וערבב באמצעות היפוך.
   הערה: יש להרחיק את תמיסת הפורמלין מלהבה פתוחה. ניתן להכין את חיץ ההכלאה בצורה מתקדמת ולאחסן באליציטוטים ב -20 ° C¹³.
6. הוסף 200-500 μL של חיץ הכלאה לכל קטע ~ 1 מ"מ של הידרוג'ל וודא שכל דגימת ההידרוג'ל שקועה.
7. אפשר לגשושית PseaerA לבצע הכלאה עם דגימות ההידרוג'ל על ידי הצבתן בחושך למשך ~ 18-24 שעות, ב 46 מעלות צלזיוס, מבלי לרעוד.
8. מרוקנים את מאגר ההכלאה לתוך מיכל איסוף פסולת.
9. יש לשטוף דגימות פעם אחת עם חיץ כביסה מעוקר מסנן (337.5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (חומצה Ethylenediaminetetraacetic) [pH 7.2], 0.01% SDS, ו מטוהר ו deionized H₂O) על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ כביסה לכל אחד צינורות 1.5 מ"ל ולאחר מכן להסיר אותו.
   הערה: ניתן להכין מראש את חיץ הכביסה ולאחסן אותו בטמפרטורת החדר (RT).
10. הוסף 1 מ"ל של חיץ כביסה טרי לצינורות, ולאחר מכן לדגור על הדגימות בחושך במשך 6 שעות ב 48 ° C, מבלי לרעוד.

4. קשירת נוגדנים הידרוג'ל ו-Psl0096

1. הסירו באופן סטרילי את חיץ הכביסה באמצעות פיפטור 1 מ"ל.
2. שטוף את הדגימות עם 2% BSA (w/v) בתמיסת PBS על ידי הוספה והסרה של 1 מ"ל של תמיסת 2% BSA.
3. הוסף 500 μL של תמיסת 2% BSA/PBS לדגימות ההידרוג'ל כדי לחסום קשירת חלבונים לא ספציפיים. לאחר מכן דגרו על הדגימות למשך הלילה, בחושך, ב-RT, מבלי לרעוד.
4. הסר באופן סטרילי את פתרון החסימה באמצעות פיפטה 1 מ"ל.
5. הכן את תמיסת הנוגדנים Psl0096-Texas Red על ידי דילול הנוגדן לריכוז סופי של 0.112 מיקרוגרם/מ"ל ב-500 מיקרוליטר של 2% BSA/PBS טריים.
6. הוסף את תמיסת הנוגדנים 500 μL לדגימות ההידרוג'ל ודגר אותן ב- RT במשך 6 שעות, מוגן מפני אור, ללא רעידות.

5. DAPI (4′,6′-diamidino-2-phenylindole) צביעה

1. הכינו את תמיסת התאמת אינדקס השבירה (RIMS) על ידי הוספת 40 גרם של מדיום שיפוע צפיפות לא יוני, 30 מיקרוליטר של Tween20, 3 מיקרוגרם נתרן אזיד ו-30 מ"ל של PBS לבקבוק המכיל מוט ערבוב מגנטי. ערבבו את התמיסה במשך 15 דקות על בחש מגנטי, או עד להמסה מלאה.
2. מסננים לעקר את התמיסה לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל באמצעות מזרק 10 מ"ל ומסנן סטרילי 0.2 מיקרומטר.
   הערה: ניתן לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C למשך מספר חודשים.
3. הסר את תמיסת הנוגדנים Psl0096-Texas Red עם פיפטה סטרילית של 1 מ"ל.
4. שטפו את דגימות ההידרוג'ל על ידי הוספה ולאחר מכן הסרה של 1 מ"ל PBS.
5. דגרו על דגימות ההידרוג'ל עם 250 μL של תמיסת RIMS ו-10 מיקרוגרם/מ"ל של DAPI ב-RT עם רעידות עדינות, בחושך, למשך הלילה.
6. לפני ההדמיה הקונפוקלית יש להרכיב את הדגימות על תאי זילוח בקוטר 0.9 מ"מ או 1.7 מ"מ ולאטום באמצעות כיסוי זכוכית.
   הערה: לאחר FISH ו/או אימונוהיסטוכימיה ולפני טבילה ב-RIMS, ניתן למרוח כתמי לקטין פלואורסצנטיים אם רוצים הדמיה של רירית הכיח¹².

6. הדמיה

1. בצע הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית לסריקת לייזר בטכניקות סטנדרטיות בהגדלות של 25x, 40x, 63x או 100x.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

התכנון הכולל של הניסוי מסוכם באיור 1 ובאיור 2. איור 1 מספק סיכום של פרוטוקולי עיבוד כיח וניקוי כיח. עיבוד וניקוי כיח עשויים להימשך עד 17 יום. עם זאת, ניתן לעצור את הפרוטוקול, וניתן לאחסן דגימות לאחר קיבוע עם PFA (יום 2) או לאחר ניקוי רקמות (ימים 5-17 ב?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר הצצה לארגון באתרו של תאי P. aeruginosa בכיח מחולי CF. דגימות כיח יש לאחסן ב 4 ° C עד עיבוד אם הם לא יכולים להיות קבועים מיד. הוכח כי מספרי תאי P. aeruginosa בכיח אינם משתנים באופן משמעותי אם הם מעובדים ב 1 שעות, 24 שעות, או 48 שעות, כאשר מאוחסנים ב 4 ° C, אם כי אם נשאר ב 25 ° C במשך...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution	BioRad	161-0146
8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek	ThermoFischer Scientific	155411
Anaerogen2.5L	Oxid Inc.	35108
Coverwell perfusion chambers	Electron Microscopry Sciences	70326 -12/-14
HistoDenz	Sigma	D2158
Protect RNA Rnase Inhibitor	Sigma	R7387
PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC	Eurofins		Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry)
Psl0096-Texas Red	Medimmune		The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries.
VA-044 Hardener	Wako	27776-21-21