Визуализация синегнойной палочки в мокроте больных муковисцидозом

Резюме

Этот протокол предоставляет методы визуализации бактериальных клеток и полисахаридного локуса синтеза полисахаридов (Psl) полисахарида в мокроте пациентов с муковисцидозом.

Аннотация

Раннее выявление и эрадикация синегнойной палочки в легких пациентов с муковисцидозом может снизить вероятность развития хронической инфекции. Развитие хронических инфекций, вызванных P. aeruginosa, связано со снижением функции легких и повышением заболеваемости. В связи с этим существует большой интерес к выяснению причин невозможности эрадикации P. aeruginosa с помощью антибиотикотерапии, которая встречается примерно у 10-40% пациентов детского возраста. Одним из многих факторов, которые могут повлиять на клиренс P. aeruginosa и чувствительность к антибиотикам, являются вариации в пространственной организации (например, агрегация или образование биопленки) и продукция полисахаридов. Поэтому нам было интересно визуализировать in situ характеристики P. aeruginosa в мокроте пациентов с муковисцидозом. Метод очистки тканей был применен к образцам мокроты после встраивания образцов в гидрогелевую матрицу для сохранения 3D-структур относительно клеток-хозяев. После очистки тканей были добавлены флуоресцентные метки и красители, чтобы обеспечить визуализацию. Флуоресцентную гибридизацию in situ проводили для визуализации бактериальных клеток, связывание флуоресцентно меченных анти-Psl-антител для визуализации экзополисахарида и окрашивание DAPI для окрашивания клеток-хозяев для получения структурного понимания. Эти методы позволили получить высокоразрешающую визуализацию P. aeruginosa в мокроте пациентов с муковисцидозом с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Введение

В данном исследовании были разработаны эксперименты по визуализации in vivo структуры Pseudomonas aeruginosa в мокроте детей с муковисцидозом (МВ). Инфекции, вызванные P. aeruginosa, становятся хроническими у 30-40% детей с муковисцидозом; После того, как хронические инфекции укореняются, их практически невозможно устранить1. Изоляты P. aeruginosa, полученные от пациентов с ранней инфекцией, как правило, более восприимчивы к противомикробным препаратам, поэтому их лечат антисинегнойными антибиотиками для предотвращения развития хронической инфекции². К сожалению, не все изоляты P. aeruginosa эффективно выводятся из легких после антибиотикотерапии. Точные механизмы, связанные с недостаточностью антибиотиков, до конца не выяснены. Предыдущие исследования показали, что вариации плотности клеток биопленки, агрегации и продукции полисахаридов могут влиять на эффективность антибиотиков³. P. aeruginosa продуцирует три внеклеточных полисахарида: Pel, Psl и альгинат⁴. Большинство штаммов P. aeruginosa обладают генетической способностью экспрессировать каждый из экзополисахаридов, хотя часто экспрессируется^{преимущественно один} тип полисахаридов 5. Экзополисахарид альгинат ассоциирован с хроническими инфекциями в легких при муковисцидозе, что приводит к мукоидному фенотипу ^6,7. Полисахариды Pel и Psl выполняют множество функций, включая помощь в первоначальном прикреплении и поддержании структуры биопленки, а также обеспечение устойчивости к антибиотикам⁸.

Методы, направленные на визуализацию in vivo структур тканей, разработаны для различных типов образцов ^9,10,11. Совсем недавно они были адаптированы для визуализации микробных сообществ in vivo в мокроте пациентов с муковисцидозом¹². Оптимизация протокола очищения тканей специально для идентификации микробных сообществ в мокроте была разработана DePas et al., 2016¹². Термин MiPACT, который расшифровывается как microbial iидентификация после Passive CLARITY technique, был придуман для очищения мокроты CF^11,12. При использовании методов очистки тканей образцы сначала фиксируются, а затем становятся прозрачными, оставляя при этом присущую им архитектуру нетронутой для окрашивания и микроскопической визуализации¹¹. Фиксация и очистка образцов мокроты CF позволяют исследователям ответить на вопросы, связанные со структурой биопленки, плотностью бактериальных клеток, полимикробными ассоциациями и ассоциациями между патогенами и клетками-хозяевами. Преимущество непосредственного исследования бактерий, сохранившихся в мокроте, заключается в том, что они могут быть проанализированы и визуализированы в контексте, специфичном для хозяина. Несмотря на то, что выращивание in vitro клинических изолятов в лаборатории для экспериментов может быть очень информативным, такие методы не могут полностью воссоздать среду легких при муковисцидозе, что приводит к разрыву между лабораторными результатами и исходами пациентов.

Методы, представленные здесь, могут быть использованы для фиксации и очищения мокроты для визуализации бактерий, будь то у пациентов с муковисцидозом или у пациентов с другими респираторными инфекциями. Специфическим типом окрашивания и микроскопического анализа, описанным в настоящем документе, является флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) с последующим связыванием анти-Psl-антител в гидрогеле и последующим анализом с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). После очищения тканей могут быть применены другие методы иммуногистохимии и микроскопии.

протокол

Для сбора и хранения образцов мокроты, взятых у людей, требуется одобрение Совета по этике исследований (REB). Исследования, представленные здесь, были одобрены Больницей для больных детей REB#1000058579.

1. Сбор мокроты

1. Отхаркивающую мокроту хранить в стерильном стаканчике для сбора и немедленно хранить при температуре 4 °C в течение максимум 24 ч до фиксации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком длительное оставление мокроты при температуре 4 °C без фиксации может привести к клеточной деградации, особенно к деградации белых кровяных телец. Предпочтительна фиксация как можно скорее.
2. Переложите образцы мокроты в стерильную пробирку объемом 15 мл.
3. Добавьте равный объем 4% параформальдегида (PFA) к образцам мокроты. Например, если образец мокроты составляет 0,5 мл, добавьте 0,5 мл 4% PFA. Перемешайте путем мягкой инверсии.
4. Инкубируйте мокроту в течение ночи при температуре 4 °C.
5. Промойте образец, добавив 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) на каждые 2 мл фиксированной мокроты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого этапа промывки не требуется центрифугирование.
6. Осторожно удалите надосадочную жидкость пипеткой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте всасывания мокроты пипеткой, направляя кончик в сторону от мокроты и очень медленно отсасывая поверхностную жидкость. Этап промывки не включает центрифугирование, чтобы не нарушить структурную целостность мокротных пробок.
7. Повторите шаги 1.6-1.7 еще два раза.
8. Ресуспендируйте гранулу в 2-кратном объеме PBS с 0,01 % (по массе) азида натрия.
9. Мокроту хранить при температуре 4 °C.

2. MiPACT (техника очищения тканей) обработка мокроты

1. Дегазируйте гидрогелевые компоненты (30% акриламид 29:1: бис-акриламид, отвердитель и PBS) в герметичном контейнере, содержащем анаэробную упаковку, в течение 72 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анаэробная упаковка и герметичный контейнер необходимы, потому что кислород ингибирует полимеризацию акриламида. В качестве альтернативы кислород можно удалить, выполнив этот этап в анаэробном колпаке, применив вакуум к герметичному контейнеру или продувая газ N₂ через смесь акриламида.
   1. Добавьте 2 мл 30% раствора акриламид:бис-акриламид 29:1 в пробирку объемом 15 мл со снятой крышкой внутри герметичного анаэробного контейнера.
   2. Приготовьте концентрированный бульон из 10% отвердителя, добавив 0,5 г отвердителя к 5 мл PBS в пробирке объемом 15 мл. Снимите крышку с тюбика и храните в герметичном анаэробном контейнере.
   3. Оставьте несколько мл стерильного PBS в пробирке со снятой крышкой внутри анаэробного контейнера.
2. Делают 5 мл раствора гидрогеля с конечной концентрацией 0,2% отвердителя и 4% акриламид:бис-акриламид 29:1 в ПБС в пробирке 15 мл. Перемешать инверсией и процедить, стерилизовать.
3. Извлеките образцы мокроты из холодильника, затем нарежьте их небольшими кусочками (примерно 5 мм в диаметре) в стерильных условиях с помощью скальпеля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если мокрота довольно жидкая, то этот шаг все еще можно выполнить, однако требуется больше терпения и практики, чтобы удалить мокроту из раствора для хранения пинцетом перед использованием скальпеля для разделения желаемых фракций.
4. Срезанные образцы мокроты помещают в лунку 8-камерного предметного стекла.
5. Добавьте 300 мкл стерилизованного фильтрующим раствором гидрогеля с этапа 2.2 в каждую лунку, содержащую мокроту.
6. Поместите 8-камерное покровное стекло в герметичный контейнер с анаэробным пакетом на 3 ч при температуре 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После полимеризации гидрогель с вкрапленной мокротой должен иметь консистенцию твердого геля.
7. Переложите образцы затвердевшей гидрогелевой мокроты в культуральную пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл 8% додецилсульфата натрия (SDS), pH 8, и дайте образцам очиститься в течение 3-14 дней при 37 °C (с встряхиванием или без него), пока мокрота не станет прозрачной.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время очищения зависит от состава мокроты и, как правило, может быть уменьшено при встряхивании. Однако следите за тем, чтобы скорость встряхивания не нарушила целостность образца. Более богатые ДНК образцы требуют больше времени для очистки по сравнению с образцами, богатыми слизью.
8. Сцедите 8%-ный раствор SDS в контейнер для сбора отходов. С помощью стерильного пинцета перенесите каждый образец, погруженный в гидрогель, в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл. Добавьте 10 мл PBS в каждую из конических пробирок объемом 50 мл, чтобы промыть гидрогели, и дайте раствору постоять от 30 минут до 1 ч перед декантацией. Повторите это еще 2 раза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап промывки не включает центрифугирование. Лишнюю жидкость и надосадочную жидкость осторожно удаляют пипеткой.
9. Хранят промытые образцы в PBS с 0,01% (по массе) азида натрия и 1x ингибитором РНКазы при 4 °C.

3. Протокол гидрогелевой флуоресцентной гибридизации in situ (FISH)

1. Извлеките образцы гидрогеля из раствора для хранения с помощью стерильного пинцета и поместите образцы на стерильную поверхность (например, предметное стекло или чашку Петри).
2. С помощью стерильного скальпеля нарежьте гидрогели ломтиками толщиной ~ 1 мм.
3. Поместите кусочки гидрогеля диаметром 1 мм в стерильные пробирки объемом 1,5 мл.
4. Готовят 1 мл гибридизационного буфера (25% формамида, 0,9 М NaCl, 20 мМ Tris-HCl [рН 7,6], 0,01% SDS, очищенного и деионизированного H₂O) в пробирке объемом 1,5 мл.
5. Добавьте флуоресцентно меченый зонд PseaerA (150,7 нМ¹²) в буфер гибридизации и перемешайте путем инверсии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор формалина следует хранить вдали от открытого огня. Буфер для гибридизации может быть приготовлен заранее и храниться в аликвотах при -20 °C¹³.
6. Добавьте 200-500 мкл гибридизационного буфера на каждый участок гидрогеля ~1 мм и убедитесь, что весь образец гидрогеля погружен в воду.
7. Дайте зонду PseaerA гибридизироваться с образцами гидрогеля, поместив их в темноту на ~ 18-24 ч при 46 °C, не встряхивая.
8. Сцедите буфер гибридизации в контейнер для сбора отходов.
9. Промойте образцы один раз стерилизованным промывочным буфером (337,5 мМ NaCl, 20 мМ Tris-HCl, 5 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) [pH 7,2], 0,01% SDS и очищенный и деионизированный H₂O), добавив 1 мл промывочного буфера в каждую из пробирок объемом 1,5 мл, а затем удалите его.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для промывки можно сделать заранее и хранить при комнатной температуре (RT).
10. Добавьте в пробирки 1 мл свежего буфера для промывки, затем инкубируйте образцы в темноте в течение 6 ч при 48 °C, не встряхивая.

4. Связывание гидрогеля и антител Psl0096

1. Стерильно удалите буфер для промывки с помощью пипеттора объемом 1 мл.
2. Промойте образцы 2%-ным раствором BSA (w/v) в растворе PBS, добавив и удалив 1 мл 2%-ного раствора BSA.
3. Добавьте 500 мкл 2% раствора BSA/PBS к образцам гидрогеля, чтобы заблокировать неспецифическое связывание с белками. Затем инкубируют образцы в течение ночи, в темноте, при РТ, не встряхивая.
4. Стерильно удалить блокирующий раствор с помощью пипетки объемом 1 мл.
5. Приготовьте раствор антител Psl0096-Texas Red, разбавив антитело до конечной концентрации 0,112 мкг/мл в 500 мкл свежего 2% BSA/PBS.
6. Добавляют раствор антител 500 мкл к образцам гидрогеля и инкубируют их при РТ в течение 6 ч, защищенные от света, без встряхивания.

5. Окрашивание DAPI (4′,6′-диамидино-2-фенилиндол)

1. Приготовьте раствор для согласования показателя преломления (RIMS), добавив 40 г неионогенной среды градиента плотности, 30 мкл Tween20, 3 мкг азида натрия и 30 мл PBS в колбу, содержащую магнитную мешалку. Перемешивайте раствор в течение 15 мин на магнитной мешалке или до полного растворения.
2. Фильтр стерилизуют раствор в коническую пробирку объемом 50 мл с помощью шприца объемом 10 мл и стерильного фильтра 0,2 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор можно хранить при температуре 4 °C в течение нескольких месяцев.
3. Удалить раствор антител Psl0096-Texas Red стерильной пипеткой объемом 1 мл.
4. Промойте образцы гидрогеля, добавив, а затем удалив 1 мл PBS.
5. Инкубируют образцы гидрогеля с 250 мкл раствора RIMS и 10 мкг/мл DAPI при RT при легком встряхивании, в темноте, в течение ночи.
6. Перед проведением конфокальной визуализации образцы помещают в перфузионные камеры диаметром 0,9 мм или 1,7 мм и запечатывают стеклянным покровным стеклом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После FISH и/или иммуногистохимии и перед погружением в RIMS можно применять флуоресцентные лектиновые красители, если требуется визуализация слизистой мокроты¹².

6. Визуализация

1. Выполняйте конфокальную лазерную сканирующую микроскопию с использованием стандартных методов с 25-кратным, 40-кратным, 63-кратным или 100-кратным увеличением.

Результаты

Общий план эксперимента представлен на рисунке 1 и рисунке 2. На рисунке 1 представлена краткая информация о протоколах обработки мокроты и ее очищения. Обработка и выведение мокроты может занять до 17 дней. Тем не менее, протокол может быть...

Обсуждение

Цель этого протокола – дать представление об организации клеток P. aeruginosa in situ в мокроте пациентов с муковисцидозом. Образцы мокроты следует хранить при температуре 4 °C до обработки, если они не могут быть немедленно зафиксированы. Было продемонстрировано, что количество клеток P....

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution	BioRad	161-0146
8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek	ThermoFischer Scientific	155411
Anaerogen2.5L	Oxid Inc.	35108
Coverwell perfusion chambers	Electron Microscopry Sciences	70326 -12/-14
HistoDenz	Sigma	D2158
Protect RNA Rnase Inhibitor	Sigma	R7387
PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC	Eurofins		Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry)
Psl0096-Texas Red	Medimmune		The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries.
VA-044 Hardener	Wako	27776-21-21