Kistik Fibrozis Hastalarının Balgamında Pseudomonas aeruginosa'nın Görüntülenmesi

Özet

Bu protokol, kistik fibrozis hastalarının balgamındaki bakteri hücrelerinin ve polisakkarit sentez lokusu (Psl) polisakkaritinin görüntülenmesi için yöntemler sağlar.

Özet

Kistik fibroz hastalarının akciğerlerinde Pseudomonas aeruginosa'nın erken tespiti ve eradikasyonu, kronik enfeksiyon gelişme şansını azaltabilir. Kronik P. aeruginosa enfeksiyonlarının gelişimi, akciğer fonksiyonlarında azalma ve artmış morbidite ile ilişkilidir. Bu nedenle, pediatrik hastaların yaklaşık %10-40'ında görülen antibiyotik tedavisi ile P. aeruginosa'nın eradike edilememesinin nedenlerinin aydınlatılmasına büyük ilgi vardır. P. aeruginosa'nın konakçı klirensini ve antibiyotik duyarlılığını etkileyebilecek birçok faktörden biri, mekansal organizasyondaki (agregasyon veya biyofilm oluşumu gibi) ve polisakkarit üretimindeki farklılıklardır. Bu nedenle, KF hastalarının balgamında P. aeruginosa'nın in situ özelliklerini görselleştirmek istedik. Balgam örneklerine, konakçı hücrelere göre 3 boyutlu yapıları korumak için örnekleri bir hidrojel matrisine gömdükten sonra bir doku temizleme tekniği uygulandı. Doku temizlendikten sonra, görselleştirmeye izin vermek için floresan etiketler ve boyalar eklendi. Bakteri hücrelerinin görselleştirilmesi için floresan in situ hibridizasyon, ekzopolisakkaritin görselleştirilmesi için floresan etiketli anti-Psl-antikorlarının bağlanması ve yapısal içgörü elde etmek için konakçı hücreleri boyamak için DAPI boyama gerçekleştirildi. Bu yöntemler, konfokal lazer tarama mikroskobu ile KF hastalarının balgamında P. aeruginosa'nın yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine izin verdi.

Giriş

Bu çalışmada, pediatrik kistik fibrozis (KF) hastalarının balgamında Pseudomonas aeruginosa'nın in vivo yapısını görselleştirmek için deneyler tasarlanmıştır. P. aeruginosa enfeksiyonları pediatrik KF popülasyonunun% 30-40'ında kronikleşir; Kronik enfeksiyonlar bir kez yerleştikten sonra, ortadan kaldırılması neredeyse imkansızdır¹. Erken enfeksiyonu olan hastalardan P. aeruginosa izolatları genellikle antimikrobiyallere daha duyarlıdır, bu nedenle bunlar kronik enfeksiyonun oluşmasını önlemek için anti-psödomonal antibiyotiklerle tedavi edilir². Ne yazık ki, tüm P. aeruginosa izolatları antibiyotik tedavisini takiben akciğerden etkili bir şekilde temizlenmez. Antibiyotik yetmezliği ile ilişkili kesin mekanizmalar tam olarak aydınlatılamamıştır. Önceki çalışmalar, biyofilm hücre yoğunluğu, agregasyonu ve polisakkarit üretimindeki değişikliklerin antibiyotik etkinliğini etkileyebileceğini göstermiştir³. P. aeruginosa üç hücre dışı polisakkarit üretir: Pel, Psl ve aljinat⁴. P. aeruginosa'nın çoğu suşu, ekzopolisakkaritlerin her birini eksprese etmek için genetik kapasiteye sahiptir, ancak genellikle bir tür polisakkarit ağırlıklı olarak⁵ eksprese edilir. Ekzopolisakkarit aljinat, KF akciğerindeki kronik enfeksiyonlarla ilişkilidir ve bu da mukoid fenotip ^6,7 ile sonuçlanır. Polisakkaritler Pel ve Psl, ilk bağlanmaya ve biyofilm yapısının korunmasına yardımcı olmak ve antibiyotik direnci kazandırmak dahil olmak üzere birçok işleve sahiptir⁸.

Dokuların in vivo yapılarını görselleştirmeyi amaçlayan yöntemler, çeşitli numune tipleri için geliştirilmiştir ^9,10,11. Daha yakın zamanlarda, KF hastalarından balgam içindeki in vivo mikrobiyal toplulukları görselleştirmek için uyarlanmışlardır¹². Özellikle balgam içindeki mikrobiyal toplulukların tanımlanması için bir doku temizleme protokolünün optimizasyonu DePas ve ark., 2016¹² tarafından geliştirilmiştir. Passive CLARITY technique'den sonra microbial iidentification anlamına gelen MiPACT terimi, CF balgam^11,12'nin temizlenmesi için icat edildi. Doku temizleme teknikleri için, örnekler önce sabitlenir, daha sonra boyama ve mikroskobik görselleştirme için doğal mimarileri bozulmadan bırakılırken şeffaf hale getirilir¹¹. KF balgam örneklerinin sabitlenmesi ve temizlenmesi, araştırmacıların biyofilm yapısı, bakteriyel hücre yoğunluğu, polimikrobiyal ilişkiler ve patojenler ile konakçı hücreler arasındaki ilişkiler ile ilgili soruları yanıtlamasına olanak tanır. Balgam içinde korunmuş bakterileri doğrudan incelemenin avantajı, konakçıya özgü bir bağlamda analiz edilebilmeleri ve görselleştirilebilmeleridir. Deney için laboratuvarda klinik izolatların in vitro büyümesi çok bilgilendirici olabilse de, bu tür yöntemler KF akciğer ortamını tam olarak yeniden oluşturamaz ve bu da laboratuvar sonuçları ile hasta sonuçları arasında bir kopukluğa neden olur.

Burada sunulan yöntemler, KF hastalarından veya diğer solunum yolu enfeksiyonları olan hastalardan bakterileri görselleştirmek için balgamı sabitlemek ve temizlemek için kullanılabilir. Burada tarif edilen spesifik boyama ve mikroskobik analiz türü, floresan in situ hibridizasyon (FISH), ardından hidrojel içinde anti-Psl-antikor bağlanması ve ardından konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) yoluyla analizdir. Doku temizliğini takiben diğer immünohistokimya ve mikroskopi yöntemleri de uygulanabilir.

Protokol

İnsan deneklerden balgam örneklerinin toplanması ve saklanması için Araştırma Etik Kurulu (REB) onayı gereklidir. Burada sunulan çalışmalar Hasta Çocuklar Hastanesi REB # 1000058579 tarafından onaylanmıştır.

1. Balgam Toplama

1. Balgam söktürücü balgamı steril bir toplama kabında saklayın ve fiksasyondan hemen önce en fazla 24 saat 4 °C'de saklayın.
   NOT: Balgamı fiksasyon olmadan 4 ° C'de çok uzun süre bırakmak, hücresel bozulmaya, özellikle beyaz kan hücrelerinin bozulmasına neden olabilir. Mümkün olan en kısa sürede sabitleme tercih edilir.
2. Balgam örneklerini steril 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
3. Balgam örneklerine eşit hacimde %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. Örneğin, balgam örneği 0.5 mL ise, 0.5 mL %4 PFA ekleyin. Hafifçe ters çevirerek karıştırın.
4. Balgamı gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
5. Her 2 mL sabit balgama 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek numuneyi yıkayın.
   NOT: Bu yıkama adımı için santrifüj gerekmez.
6. Süpernatanı bir pipetle dikkatlice çıkarın.
   NOT: Ucu balgamdan uzağa doğrultarak balgamı pipetle emmekten kaçının ve yüzeydeki sıvıyı çok yavaş bir şekilde aspire edin. Yıkama adımı, balgam tıkaçlarının yapısal bütünlüğünü bozmamak için santrifüj içermez.
7. 1.6-1.7 adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
8. Pelet, %0,01 (a/h) sodyum azid ile PBS hacminin 2 katı kadar yeniden süspanse edilir.
9. Balgamı 4 °C'de saklayın.

2. Balgamın MiPACT (doku temizleme tekniği) işlenmesi

1. Hidrojel bileşenlerini (%30 29:1 akrilamid: bis-akrilamid, sertleştirici ve PBS) 72 saat önce anaerobik bir paket içeren kapalı bir kapta gazdan arındırın.
   NOT: Anaerobik paket ve kapalı kap gereklidir çünkü oksijen akrilamid polimerizasyonunu inhibe eder. Alternatif olarak, bu adım anaerobik bir başlıkta gerçekleştirilerek, kapalı bir kaba vakum uygulanarak veya_N2 gazının akrilamid karışımından köpürtülmesiyle oksijen çıkarılabilir.
   1. Kapalı anaerobik kabın içinde kapağı kapalı olacak şekilde 15 mL'lik bir tüpe 2 mL %30 29:1 akrilamid: bis-akrilamid çözeltisi ekleyin.
   2. 15 mL'lik bir tüpte 5 mL PBS'ye 0,5 g sertleştirici ekleyerek konsantre bir %10 (a/h) sertleştirici stoğu yapın. Kapağı tüpün dışında bırakın ve kapalı anaerobik kapta saklayın.
   3. Anaerobik kabın içinde, kapağı kapalı olarak bir tüpte birkaç mL steril PBS bırakın.
2. 15 mL'lik bir tüpte PBS'de nihai konsantrasyonu %0.2 sertleştirici ve %4 29:1 akrilamid olan 5 mL hidrojel çözeltisi yapın. Ters çevirerek karıştırın ve filtre sterilize edin.
3. Balgam örneklerini buzdolabından çıkarın, ardından steril koşullar altında bir neşter ile küçük bölümler halinde (kabaca 5 mm çapında) kesin.
   NOT: Balgam oldukça akışkansa, bu adım yine de gerçekleştirilebilir, ancak istenen fraksiyonları ayırmak için neşteri kullanmadan önce balgamı cımbızla saklama solüsyonundan çıkarmak daha fazla sabır ve pratik gerektirir.
4. Kesilen balgam örneklerini 8 odacıklı bir kapak camı slaytının kuyusuna yerleştirin.
5. Balgam içeren kuyucukların her birine adım 2.2'den 300 μL filtre sterilize hidrojel çözeltisi ekleyin.
6. 8 odacıklı kapak camını anaerobik paket içeren kapalı bir kabın içine 37 °C'de 3 saat yerleştirin.
   NOT: Gömülü balgam ile hidrojel polimerize edildikten sonra sert jel kıvamında olmalıdır.
7. Katılaşmış hidrojel balgam numunelerini 5 mL %8 sodyum dodesil sülfat (SDS), pH 8 içeren 15 mL'lik bir kültür tüpüne aktarın ve numunelerin 37 °C'de (çalkalayarak veya çalkalanmadan) 3-14 gün boyunca balgam şeffaf hale gelene kadar temizlenmesine izin verin.
   NOT: Temizleme süreleri balgam bileşimine bağlıdır ve genellikle çalkalama ile azaltılabilir. Ancak çalkalama hızını numune bütünlüğünü bozacak kadar artırmamaya özen gösterin. DNA açısından zengin örneklerin temizlenmesi, mukus açısından zengin örneklere kıyasla daha uzun sürer.
8. %8 SDS çözeltisini bir atık toplama kabına boşaltın. Steril cımbız kullanarak, hidrojel gömülü her numuneyi steril 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hidrojelleri yıkamak için 50 mL'lik konik tüplerin her birine 10 mL PBS ekleyin ve çözeltiyi boşaltmadan önce 30 dakika ila 1 saat bekletin. Bunu 2 kat daha tekrarlayın.
   NOT: Bu yıkama adımı santrifüj içermez. Fazla sıvı ve süpernatant bir pipetle dikkatlice çıkarılır.
9. Yıkanmış numuneleri 4 °C'de %0,01 (a/h) sodyum azid ve 1x RNaz inhibitörü ile PBS'de saklayın.

3. Hidrojel floresan in situ hibridizasyon (FISH) protokolü

1. Hidrojel numunelerini steril cımbız kullanarak saklama solüsyonlarından çıkarın ve numuneleri steril bir yüzeye (cam slayt veya Petri kabı gibi) yerleştirin.
2. Steril bir neşter kullanarak hidrojelleri ~ 1 mm kalınlığında dilimler halinde kesin.
3. Hidrojelin 1 mm'lik bölümlerini steril 1,5 mL'lik tüplerin içine yerleştirin.
4. 1.5 mL'lik bir tüpte 1 mL hibridizasyon tamponu (%25 formamid, 0.9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7.6], %0.01 SDS, saflaştırılmış ve deiyonize_H2O) hazırlayın.
5. Floresan etiketli PseaerA probunu (150.7 nM¹²) hibridizasyon tamponuna ekleyin ve ters çevirerek karıştırın.
   NOT: Formalin çözeltisi açık alevden uzak tutulmalıdır. Hibridizasyon tamponu önceden hazırlanabilir ve -20 ° C'de alikotlarda saklanabilir¹³.
6. Hidrojelin her ~1 mm'lik bölümüne 200-500 μL hibridizasyon tamponu ekleyin ve hidrojel numunesinin tamamının suya daldırıldığından emin olun.
7. PseaerA probunun hidrojel numunelerini ~ 18-24 saat, 46 °C'de çalkalamadan karanlıkta bırakarak hibridize olmasına izin verin.
8. Hibridizasyon tamponunu bir atık toplama kabına boşaltın.
9. 1,5 mL'lik tüplerin her birine 1 mL yıkama tamponu ekleyerek numuneleri filtreyle sterilize edilmiş yıkama tamponu (337,5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (Etilendiamintetraasetik asit) [pH 7,2], %0,01 SDS ve saflaştırılmış ve deiyonize_H2O) ile bir kez durulayın ve ardından çıkarın.
   NOT: Yıkama tamponu önceden yapılabilir ve oda sıcaklığında (RT) saklanabilir.
10. Tüplere 1 mL taze yıkama tamponu ekleyin, ardından numuneleri karanlıkta 48 °C'de 6 saat çalkalamadan inkübe edin.

4. Hidrojel ve Psl0096 antikor bağlanması

1. Yıkama tamponunu 1 mL'lik bir pipetleyici kullanarak steril olarak çıkarın.
2. %2 BSA çözeltisinden 1 mL ekleyip çıkararak numuneleri PBS çözeltisinde %2 BSA (a/h) ile durulayın.
3. Spesifik olmayan protein bağlanmasını bloke etmek için hidrojel numunelerine 500 μL %2 BSA/PBS çözeltisi ekleyin. Daha sonra numuneleri gece boyunca, karanlıkta, RT'de çalkalamadan inkübe edin.
4. 1 mL'lik bir pipet kullanarak bloke edici solüsyonu steril olarak çıkarın.
5. Antikoru 500 μL taze %2 BSA/PBS içinde 0.112 μg/mL'lik nihai konsantrasyona seyrelterek Psl0096-Texas Red antikor çözeltisini hazırlayın.
6. 500 μL'lik antikor çözeltisini hidrojel örneklerine ekleyin ve bunları RT'de 6 saat boyunca ışıktan korunarak, çalkalamadan inkübe edin.

5. DAPI (4′,6′-diamidino-2-fenilindol) boyama

1. Manyetik karıştırma çubuğu içeren bir şişeye 40 g iyonik olmayan yoğunluk gradyan ortamı, 30 μL Tween20, 3 μg sodyum azid ve 30 mL PBS ekleyerek kırılma indisi eşleştirme çözeltisini (RIMS) hazırlayın. Çözeltiyi manyetik bir karıştırıcı üzerinde 15 dakika veya tamamen eriyene kadar karıştırın.
2. Filtre, 10 mL'lik bir şırınga ve steril 0.2 μm'lik bir filtre kullanarak çözeltiyi 50 mL'lik bir konik tüpe sterilize eder.
   NOT: Çözelti 4 °C'de birkaç ay saklanabilir.
3. Psl0096-Texas Red antikor solüsyonunu steril 1 mL'lik bir pipetle çıkarın.
4. Hidrojel örneklerini 1 mL PBS ekleyip çıkararak durulayın.
5. Hidrojel numunelerini 250 μL RIMS çözeltisi ve 10 μg/mL DAPI ile RT'de gece boyunca karanlıkta hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
6. Konfokal görüntülemeden önce, numuneleri 0,9 mm veya 1,7 mm perfüzyon odalarına monte edin ve bir cam lamel ile kapatın.
   NOT: FISH ve/veya immünohistokimyadan sonra ve RIMS'e daldırılmadan önce, balgam mukozasının görüntülenmesi isteniyorsa floresan lektin boyaları uygulanabilir¹².

6. Görüntüleme

1. 25x, 40x, 63x veya 100x büyütmelerde standart teknikleri kullanarak konfokal lazer tarama mikroskobu görüntüleme gerçekleştirin.

Sonuçlar

Deneyin genel tasarımı Şekil 1 ve Şekil 2'de özetlenmiştir. Şekil 1 , balgam işleme ve balgam temizleme protokollerinin bir özetini sağlar. Balgam işleme ve temizleme 17 güne kadar sürebilir. Bununla birlikte, protokol durdurulabilir ve numuneler PFA ile fiksasyondan sonra (2. gün) veya doku temizliğinden sonra (temizleme süresine bağlı olarak 5-17. günler) saklanabilir. Şekil 2'de F...

Tartışmalar

Bu protokolün amacı, KF hastalarından balgamda P. aeruginosa hücrelerinin in-situ organizasyonuna bir bakış sağlamaktır. Balgam örnekleri, hemen sabitlenemiyorlarsa işlenene kadar 4 °C'de saklanmalıdır. Balgamdaki P. aeruginosa hücre sayılarının, 4 °C'de saklandığında 1 saat, 24 saat veya 48 saatte işlenirse önemli ölçüde değişmediği, ancak 24 veya 48 saat boyunca 25 °C'de bırakılırsa, bakteri büyümesinin bir sonucu olarak bakteri hücre sayılarının önemli ölçüd...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution	BioRad	161-0146
8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek	ThermoFischer Scientific	155411
Anaerogen2.5L	Oxid Inc.	35108
Coverwell perfusion chambers	Electron Microscopry Sciences	70326 -12/-14
HistoDenz	Sigma	D2158
Protect RNA Rnase Inhibitor	Sigma	R7387
PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC	Eurofins		Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry)
Psl0096-Texas Red	Medimmune		The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries.
VA-044 Hardener	Wako	27776-21-21