Visualizzazione di Pseudomonas aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica

Riepilogo

Questo protocollo fornisce metodi per la visualizzazione delle cellule batteriche e del polisaccaride del locus di sintesi dei polisaccaridi (Psl) all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica.

Abstract

La diagnosi precoce e l'eradicazione di Pseudomonas aeruginosa nei polmoni dei pazienti affetti da fibrosi cistica possono ridurre la possibilità di sviluppare un'infezione cronica. Lo sviluppo di infezioni croniche da P. aeruginosa è associato a un declino della funzione polmonare e a un aumento della morbilità. Pertanto, c'è un grande interesse a chiarire le ragioni della mancata eradicazione di P. aeruginosa con la terapia antibiotica che si verifica in circa il 10-40% dei pazienti pediatrici. Uno dei molti fattori che possono influenzare la clearance dell'ospite di P. aeruginosa e la suscettibilità agli antibiotici sono le variazioni nell'organizzazione spaziale (come l'aggregazione o la formazione di biofilm) e nella produzione di polisaccaridi. Pertanto, eravamo interessati a visualizzare le caratteristiche in situ di P. aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti con FC. Una tecnica di pulizia dei tessuti è stata applicata ai campioni di espettorato dopo aver incorporato i campioni in una matrice di idrogel per mantenere le strutture 3D relative alle cellule ospiti. Dopo la pulizia dei tessuti, sono state aggiunte etichette fluorescenti e coloranti per consentire la visualizzazione. L'ibridazione fluorescente in situ è stata eseguita per la visualizzazione di cellule batteriche, il legame di anticorpi anti-Psl marcati in modo fluorescente per la visualizzazione dell'esopolisaccaride e la colorazione DAPI per colorare le cellule ospiti per ottenere informazioni strutturali. Questi metodi hanno permesso l'imaging ad alta risoluzione di P. aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da FC tramite microscopia confocale a scansione laser.

Introduzione

In questo studio, gli esperimenti sono stati progettati per visualizzare la struttura in vivo di Pseudomonas aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti pediatrici affetti da fibrosi cistica (FC). Le infezioni da P. aeruginosa diventano croniche nel 30-40% della popolazione pediatrica FC; Una volta che le infezioni croniche si sono stabilite, sono quasi impossibili da eliminare¹. Gli isolati di P. aeruginosa provenienti da pazienti con infezione precoce sono generalmente più suscettibili agli antimicrobici, pertanto vengono trattati con antibiotici anti-pseudomonali per prevenire l'instaurarsi di infezioni croniche². Sfortunatamente, non tutti gli isolati di P. aeruginosa vengono eliminati efficacemente dal polmone dopo la terapia antibiotica. I meccanismi precisi associati al fallimento degli antibiotici non sono stati completamente chiariti. Studi precedenti hanno dimostrato che le variazioni nella densità cellulare del biofilm, nell'aggregazione e nella produzione di polisaccaridi possono influenzare l'efficacia degli antibiotici³. P. aeruginosa produce tre polisaccaridi extracellulari: Pel, Psl e alginato⁴. La maggior parte dei ceppi di P. aeruginosa ha la capacità genetica di esprimere ciascuno degli esopolisaccaridi, anche se spesso un tipo di polisaccaride è espresso prevalentemente⁵. L'alginato di esopolisaccaride è associato a infezioni croniche nel polmone FC, con conseguente fenotipo^{mucoide 6,7}. I polisaccaridi Pel e Psl hanno molteplici funzioni, tra cui aiutare l'attacco iniziale e il mantenimento della struttura del biofilm e conferire resistenza agli antibiotici⁸.

Sono stati sviluppati metodi volti a visualizzare in vivo le strutture dei tessuti per una varietà di tipi di campioni 9,10,11. Più recentemente, sono stati adattati per visualizzare le comunità microbiche in vivo all'interno dell'espettorato di pazienti con FC¹². L'ottimizzazione di un protocollo di pulizia tissutale specifico per l'identificazione delle comunità microbiche all'interno dell'espettorato è stata sviluppata da DePas et al., 2016¹². Il termine MiPACT, che sta per identificazione microbiale dopo la tecnica di Passive CLARITY, è stato coniato per la rimozione dell'espettorato FC^11,12. Per le tecniche di purificazione dei tessuti, i campioni vengono prima fissati, quindi resi trasparenti, lasciando intatta la loro architettura intrinseca per la colorazione e la visualizzazione microscopica¹¹. La fissazione e la cancellazione dei campioni di espettorato FC consentono ai ricercatori di rispondere a domande relative alla struttura del biofilm, alla densità delle cellule batteriche, alle associazioni polimicrobiche e alle associazioni tra agenti patogeni e cellule ospiti. Il vantaggio di esaminare direttamente i batteri che sono stati conservati all'interno dell'espettorato è che possono essere analizzati e visualizzati in un contesto specifico dell'ospite. Sebbene la crescita in vitro di isolati clinici in laboratorio per la sperimentazione possa essere molto istruttiva, tali metodi non sono in grado di ricreare completamente l'ambiente polmonare della fibrosi cistica, con conseguente disconnessione tra i risultati di laboratorio e gli esiti dei pazienti.

I metodi qui presentati possono essere utilizzati per fissare e liberare l'espettorato per visualizzare i batteri, sia di pazienti FC che di pazienti con altre infezioni respiratorie. Il tipo specifico di colorazione e analisi microscopica qui descritto è l'ibridazione fluorescente in situ (FISH), seguita dal legame anti-Psl-anticorpo all'interno dell'idrogel e dalla successiva analisi tramite microscopia a scansione laser confocale (CLSM). Dopo la pulizia dei tessuti, possono essere applicati anche altri metodi di immunoistochimica e microscopia.

Protocollo

Per raccogliere e conservare campioni di espettorato da soggetti umani è necessaria l'approvazione del Research Ethics Board (REB). Gli studi qui presentati sono stati approvati dall'Hospital for Sick Children REB#1000058579.

1. Raccolta dell'espettorato

1. Conservare l'espettorato espettorato in una coppetta sterile e conservare immediatamente a 4 °C per un massimo di 24 ore prima della fissazione.
   NOTA: Lasciare l'espettorato troppo a lungo a 4 °C senza fissazione può portare alla degradazione cellulare, in particolare alla degradazione dei globuli bianchi. È preferibile fissarlo il prima possibile.
2. Trasferire i campioni di espettorato in una provetta sterile da 15 ml.
3. Aggiungere un volume uguale di paraformaldeide (PFA) al 4% ai campioni di espettorato. Ad esempio, se il campione di espettorato è di 0,5 mL, aggiungere 0,5 mL di PFA al 4%. Mescolare con leggera inversione.
4. Incubare l'espettorato per una notte a 4 °C.
5. Lavare il campione aggiungendo 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a ogni 2 mL di espettorato fisso.
   NOTA: Non è necessaria alcuna centrifugazione per questa fase di lavaggio.
6. Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta.
   NOTA: Evitare di aspirare l'espettorato con la pipetta puntando la punta lontano dall'espettorato e aspirare molto lentamente il liquido superficiale. La fase di lavaggio non prevede centrifugazione per non disturbare l'integrità strutturale dei tappi di espettorato.
7. Ripetere i passaggi 1.6-1.7 altre due volte.
8. Risospendere il pellet in 2 volte il volume del PBS con lo 0,01 % (p/v) di sodio azide.
9. Conservare l'espettorato a 4 °C.

2. MiPACT (tecnica di pulizia dei tessuti) trattamento dell'espettorato

1. Degassare i componenti dell'idrogel (30% acrilammide 29:1: bis-acrilammide, indurente e PBS) in un contenitore sigillato contenente un impacco anaerobico prima per 72 ore.
   NOTA: Il pacchetto anaerobico e il contenitore sigillato sono necessari perché l'ossigeno inibisce la polimerizzazione dell'acrilammide. In alternativa, l'ossigeno può essere rimosso eseguendo questo passaggio in una cappa anaerobica, applicando un vuoto a un contenitore sigillato o facendo gorgogliare il gas N₂ attraverso la miscela di acrilammide.
   1. Aggiungere 2 mL di una soluzione di acrilammide:bis-acrilammide 29:1 al 30% in una provetta da 15 mL senza tappo all'interno del contenitore anaerobico sigillato.
   2. Preparare un impasto concentrato di indurente al 10% (p/v) aggiungendo 0,5 g di indurente a 5 mL di PBS in una provetta da 15 mL. Lasciare il tappo staccato dal tubo e conservare nel contenitore anaerobico sigillato.
   3. Lasciare alcuni ml di PBS sterile in una provetta, senza tappo, all'interno del contenitore anaerobico.
2. Preparare una soluzione di 5 mL di idrogel con una concentrazione finale di indurente allo 0,2% e 4% di acrilammide:bis-acrilammide 29:1 in PBS in una provetta da 15 mL. Miscelare per inversione e sterilizzare con filtro.
3. Rimuovere i campioni di espettorato dal frigorifero, quindi tagliarli in piccole sezioni (circa 5 mm di diametro) in condizioni sterili con un bisturi.
   NOTA: Se l'espettorato è abbastanza fluido, questo passaggio può ancora essere eseguito, tuttavia, ci vuole maggiore pazienza e pratica per rimuovere l'espettorato dalla soluzione di conservazione con una pinzetta prima di utilizzare il bisturi per separare le frazioni desiderate.
4. Posizionare i campioni di espettorato tagliati all'interno di un pozzetto di un vetrino di copertura a 8 camere.
5. Aggiungere 300 μL di soluzione di idrogel sterilizzata con filtro della fase 2.2 a ciascuno dei pozzetti che contengono espettorato.
6. Collocare il coperchio a 8 camere all'interno di un contenitore sigillato contenente un impacco anaerobico per 3 ore a 37 °C.
   NOTA: Una volta polimerizzato, l'idrogel con l'espettorato incorporato dovrebbe avere la consistenza di un gel solido.
7. Trasferire i campioni di espettorato di idrogel solidificato in una provetta di coltura da 15 mL contenente 5 mL di sodio dodecil solfato (SDS) all'8%, pH 8, e lasciare che i campioni si chiariscano per 3-14 giorni a 37 °C (con o senza agitazione), fino a quando l'espettorato diventa trasparente.
   NOTA: I tempi di pulizia dipendono dalla composizione dell'espettorato e generalmente possono essere ridotti con l'agitazione. Tuttavia, fare attenzione a non aumentare la velocità di agitazione fino al punto di interrompere l'integrità del campione. I campioni più ricchi di DNA richiedono più tempo per essere eliminati rispetto ai campioni ricchi di muco.
8. Travasare la soluzione SDS all'8% in un contenitore per la raccolta dei rifiuti. Utilizzando una pinzetta sterile, trasferire ogni campione incorporato in idrogel in una provetta conica sterile da 50 ml. Aggiungere 10 mL di PBS a ciascuna delle provette coniche da 50 mL per lavare gli idrogel e lasciare riposare la soluzione per 30 minuti a 1 ora prima di travasare. Ripeti l'operazione altre 2 volte.
   NOTA: Questa fase di lavaggio non prevede centrifugazione. Il liquido in eccesso e il surnatante vengono accuratamente rimossi con una pipetta.
9. Conservare i campioni lavati in PBS con sodio azide allo 0,01% (p/v) e 1x inibitore della RNasi a 4 °C.

3. Protocollo di ibridazione in situ fluorescente idrogel (FISH)

1. Rimuovere i campioni di idrogel dalla soluzione di conservazione utilizzando una pinzetta sterile e posizionare i campioni su una superficie sterile (come un vetrino o una capsula di Petri).
2. Utilizzando un bisturi sterile, tagliare gli idrogel in fette spesse ~ 1 mm.
3. Posizionare le sezioni di idrogel da 1 mm all'interno di provette sterili da 1,5 mL.
4. Preparare 1 mL di tampone di ibridazione (25% di formammide, 0,9 M NaCl, 20 mM di Tris-HCl [pH 7,6], 0,01% di SDS, H₂O purificato e deionizzato) in una provetta da 1,5 mL.
5. Aggiungere la sonda PseaerA marcata con fluorescenza (150,7 nM¹²) al tampone di ibridazione e miscelare per inversione.
   NOTA: La soluzione di formalina deve essere tenuta lontana da fiamme libere. Il tampone di ibridazione può essere preparato in anticipo e conservato in aliquote a -20 °C¹³.
6. Aggiungere 200-500 μL di tampone di ibridazione a ciascuna sezione di ~1 mm di idrogel e assicurarsi che l'intero campione di idrogel sia immerso.
7. Consentire alla sonda PseaerA di ibridarsi con i campioni di idrogel mettendoli al buio per ~ 18-24 h, a 46 °C, senza agitare.
8. Travasare il tampone di ibridazione in un contenitore per la raccolta dei rifiuti.
9. Sciacquare i campioni una volta con tampone di lavaggio sterilizzato con filtro (337,5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) [pH 7,2], 0,01% SDS e H₂O purificato e deionizzato) aggiungendo 1 mL di tampone di lavaggio a ciascuna delle provette da 1,5 mL e quindi rimuoverlo.
   NOTA: Il tampone di lavaggio può essere preparato in anticipo e conservato a temperatura ambiente (RT).
10. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio fresco alle provette, quindi incubare i campioni al buio per 6 ore a 48 °C, senza agitare.

4. Idrogel e legame anticorpale Psl0096

1. Rimuovere sterilmente il tampone di lavaggio utilizzando un pipettitore da 1 ml.
2. Sciacquare i campioni con una soluzione di BSA al 2% (p/v) in PBS aggiungendo e rimuovendo 1 mL di soluzione di BSA al 2%.
3. Aggiungere 500 μL della soluzione BSA/PBS al 2% ai campioni di idrogel per bloccare il legame proteico non specifico. Quindi incubare i campioni per una notte, al buio, a RT, senza agitare.
4. Rimuovere sterilmente la soluzione bloccante utilizzando una pipetta da 1 ml.
5. Preparare la soluzione di anticorpi Psl0096-Texas Red diluendo l'anticorpo a una concentrazione finale di 0,112 μg/mL in 500 μL di BSA/PBS fresco al 2%.
6. Aggiungere la soluzione anticorpale da 500 μL ai campioni di idrogel e incubarli a RT per 6 ore, al riparo dalla luce, senza agitare.

5. Colorazione DAPI (4′,6′-diamidino-2-fenilindolo)

1. Preparare la soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione (RIMS) aggiungendo 40 g di mezzo a gradiente di densità non ionica, 30 μL di Tween20, 3 μg di sodio azide e 30 mL di PBS a un matraccio contenente un'ancoretta magnetica. Agitare la soluzione per 15 minuti su un agitatore magnetico o fino a completa dissoluzione.
2. Filtro: sterilizzare la soluzione in una provetta conica da 50 mL utilizzando una siringa da 10 mL e un filtro sterile da 0,2 μm.
   NOTA: La soluzione può essere conservata a 4 °C per diversi mesi.
3. Rimuovere la soluzione di anticorpi Psl0096-Texas Red con una pipetta sterile da 1 mL.
4. Sciacquare i campioni di idrogel aggiungendo e rimuovendo 1 ml di PBS.
5. Incubare i campioni di idrogel con 250 μL di soluzione RIMS e 10 μg/mL di DAPI a RT agitando delicatamente, al buio, durante la notte.
6. Prima dell'imaging confocale, montare i campioni su camere di perfusione da 0,9 mm o 1,7 mm e sigillare con un vetrino coprioggetto.
   NOTA: Dopo la FISH e/o l'immunoistochimica e prima dell'immersione in RIMS, è possibile applicare colorazioni fluorescenti di lectina se si desidera visualizzare la mucosa dell'espettorato¹².

6. Imaging

1. Eseguire l'imaging al microscopio a scansione laser confocale utilizzando tecniche standard con ingrandimenti 25x, 40x, 63x o 100x.

Risultati

Il disegno generale dell'esperimento è riassunto nella Figura 1 e nella Figura 2. La Figura 1 fornisce un riepilogo dei protocolli di elaborazione e di eliminazione dell'espettorato. L'elaborazione e la rimozione dell'espettorato possono richiedere fino a 17 giorni. Tuttavia, il protocollo può essere interrotto e i campioni possono essere conservati dopo la fissazione con PFA (giorno 2) o dopo la pulizia dei tessuti (giorni 5-17 a...

Discussione

Lo scopo di questo protocollo è quello di consentire uno sguardo sull'organizzazione in situ delle cellule di P. aeruginosa nell'espettorato di pazienti con fibrosi cistica. I campioni di espettorato devono essere conservati a 4 °C fino al momento dell'elaborazione, se non possono essere fissati immediatamente. È stato dimostrato che il numero di cellule di P. aeruginosa nell'espettorato non cambia in modo significativo se processato a 1 ora, 24 ore o 48 ore, se conservato a 4 °C, anche se lasciato ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution	BioRad	161-0146
8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek	ThermoFischer Scientific	155411
Anaerogen2.5L	Oxid Inc.	35108
Coverwell perfusion chambers	Electron Microscopry Sciences	70326 -12/-14
HistoDenz	Sigma	D2158
Protect RNA Rnase Inhibitor	Sigma	R7387
PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC	Eurofins		Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry)
Psl0096-Texas Red	Medimmune		The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries.
VA-044 Hardener	Wako	27776-21-21