낭포성 섬유증 환자의 객담 내 녹농균의 시각화

요약

이 프로토콜은 낭포성 섬유증 환자의 객담 내에서 박테리아 세포 및 다당류 합성 위치(Psl) 다당류의 시각화 방법을 제공합니다.

초록

낭포성 섬유증 환자의 폐 내에서 녹농균을 조기에 발견하고 근절하면 만성 감염 발병 가능성을 줄일 수 있습니다. 만성 녹농균 감염의 발병은 폐 기능 저하 및 이환율 증가와 관련이 있습니다. 따라서 소아 환자의 약 10-40%에서 발생하는 항생제 요법으로 녹농균을 근절하지 못하는 이유를 밝히는 데 큰 관심이 있습니다. 녹농균(P. aeruginosa)의 숙주 청소율과 항생제 감수성에 영향을 미칠 수 있는 많은 요인 중 하나는 공간 조직(예: 응집 또는 생물막 형성) 및 다당류 생산의 변화입니다. 따라서 CF 환자의 객담 내에서 녹농균의 현장 특성을 시각화하는 데 관심이 있었습니다. 숙주 세포에 대한 3D 구조를 유지하기 위해 샘플을 하이드로겔 매트릭스에 삽입한 후 객담 샘플에 조직 투명화 기술을 적용했습니다. 조직 투명화 후 형광 라벨과 염료를 추가하여 시각화를 가능하게 했습니다. 박테리아 세포의 시각화를 위해 형광 in situ 교잡화를 수행하고, 외다당류의 시각화를 위해 형광 표지된 항-PSL 항체의 결합을 수행하고, 구조적 통찰력을 얻기 위해 숙주 세포를 염색하기 위한 DAPI 염색을 수행했습니다. 이러한 방법을 통해 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 통해 CF 환자의 객담 내 녹농균의 고해상도 이미징을 수행할 수 있었습니다.

서문

이 연구에서 실험은 소아 낭포성 섬유증(CF) 환자의 객담 내에서 녹농균의 생체 내 구조를 시각화하도록 설계되었습니다. 녹농균 감염은 소아 CF 인구의 30-40%에서 만성화됩니다. 만성 감염이 발생하면 제거가 거의 불가능합니다¹. 녹농균은 일반적으로 항균제에 더 취약하기 때문에 만성 감염을 예방하기 위해 항슈도몬 항생제로 치료한다². 안타깝게도, 모든 녹농균 분리가 항생제 치료 후 폐에서 효과적으로 제거되는 것은 아닙니다. 항생제 실패와 관련된 정확한 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 이전 연구에서는 생물막 세포 밀도, 응집 및 다당류 생산의 변화가 항생제 효능에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었습니다³. 녹농균(P. aeruginosa)은 펠(Pel), 피슬(Psl), 알긴산(alginate)의 세 가지 세포외 다당류를 생산합니다⁴. 녹농균(P. aeruginosa)의 대부분의 균주는 각 외다당류를 발현할 수 있는 유전적 능력을 가지고 있지만, 종종 한 종류의 다당류가 주로 발현된다⁵. 엑소다당류 알긴산은 CF 폐의 만성 감염과 관련이 있으며, 점액성 표현형 ^6,7을 초래합니다. 다당류 Pel과 Psl은 초기 부착 및 생물막 구조 유지를 돕고 항생제 내성을 부여하는 등 여러 기능을 가지고 있습니다⁸.

조직의 생체 내 구조를 시각화하는 것을 목표로 하는 방법은 다양한 샘플 유형 9,10,11에 대해 개발되었습니다. 최근에는 CF 환자의 객담 내 생체 내 미생물 군집을 시각화하도록 맞춤화되었습니다¹². 객담 내 미생물 군집 식별을 위한 조직 투명화 프로토콜의 최적화는 DePas et al., 2016¹²에 의해 개발되었습니다. Pa ssive CLARITY technique 이후 microbial identification의 약자인 MiPACT라는 용어는 CF 가래^11,12의 제거를 위해 만들어졌습니다. 조직 투명화 기법의 경우, 표본을 먼저 고정한 다음 투명하게 렌더링하면서 염색 및 현미경 시각화를 위해 고유한 구조를 그대로 유지합니다¹¹. CF 객담 샘플을 고정하고 투명화하면 생물막 구조, 박테리아 세포 밀도, 다균 결합, 병원체와 숙주 세포 간의 연관성과 관련된 질문에 답할 수 있습니다. 객담 내에 보존된 박테리아를 직접 검사하는 것의 장점은 숙주별 맥락에서 분석하고 시각화할 수 있다는 것입니다. 실험을 위해 실험실에서 임상 분리체의 체외 성장은 매우 유익할 수 있지만, 이러한 방법은 CF 폐 환경을 완전히 재현할 수 없으므로 실험실 결과와 환자 결과 사이에 단절이 발생합니다.

여기에 제시된 방법은 CF 환자나 다른 호흡기 감염 환자의 박테리아를 시각화하기 위해 객담을 고정하고 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 본 명세서에 기술된 염색 및 현미경 분석의 특정 유형은 형광 in situ hybridization(FISH), 하이드로겔 내 항-PSL 항체 결합, 그리고 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 통한 후속 분석이다. 조직 투명화 후 다른 면역조직화학 및 현미경 검사법도 적용할 수 있습니다.

프로토콜

연구 윤리 위원회(REB)의 승인은 인간 피험자로부터 객담 샘플을 수집하고 보관하는 데 필요합니다. 본 연구에 제시된 연구는 Hospital for Sick Children REB#1000058579의 승인을 받았습니다.

1. 객담 채취

1. 객담을 멸균 채취 컵에 보관하고 즉시 4°C에서 최대 24시간 동안 보관한 후 고정합니다.
   알림: 가래를 고정하지 않고 4°C에서 너무 오래 방치하면 세포 분해, 특히 백혈구 분해가 발생할 수 있습니다. 가능한 한 빨리 고정하는 것이 좋습니다.
2. 객담 검체를 멸균된 15mL 튜브로 옮깁니다.
3. 객담 샘플에 동일한 부피의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 추가합니다. 예를 들어, 객담 샘플이 0.5mL인 경우 0.5mL의 4% PFA를 추가합니다. 부드러운 반전으로 섞는다.
4. 4 °C에서 밤새 가래를 배양합니다.
5. 고정 객담 2mL 각각에 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가하여 샘플을 세척합니다.
   알림: 이 세척 단계에는 원심분리가 필요하지 않습니다.
6. 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
   알림: 팁을 가래에서 멀어지게 하여 피펫으로 가래를 빨아들이지 말고 표면 액체에서 매우 천천히 흡인하십시오. 세척 단계에는 가래 플러그의 구조적 무결성을 방해하지 않도록 원심 분리가 포함되지 않습니다.
7. 1.6-1.7단계를 두 번 더 반복합니다.
8. 펠릿을 PBS 부피의 2배에 0.01%(w/v) 아지드화나트륨으로 재현탁시킵니다.
9. 객담은 4 °C에서 보관한다.

2. 객담의 MiPACT(조직 청소 기술) 처리

1. 하이드로겔 성분(30% 29:1 아크릴아미드:비스-아크릴아미드, 경화제 및 PBS)을 혐기성 팩이 들어 있는 밀봉된 용기에서 72시간 전에 가스를 제거합니다.
   알림: 산소가 아크릴아마이드 중합을 억제하기 때문에 혐기성 팩과 밀봉된 용기가 필요합니다. 대안적으로, 산소는 혐기성 후드 내에서 이 단계를 수행하거나, 밀봉된 용기에 진공을 적용하거나, 아크릴아마이드 혼합물을 통해_N2 가스를 버블링함으로써 제거될 수 있다.
   1. 밀봉된 혐기성 용기 내부의 뚜껑을 닫은 상태에서 30% 29:1 아크릴아마이드:비스-아크릴아미드 용액 2mL를 15mL 튜브에 추가합니다.
   2. 15mL 튜브에 PBS 5mL에 경화제 0.5g을 첨가하여 10%(w/v) 경화제의 농축액을 만듭니다. 튜브의 뚜껑을 닫고 밀봉된 혐기성 용기에 보관하십시오.
   3. 멸균 PBS 몇 mL를 혐기성 용기 내부의 뚜껑을 닫은 상태로 튜브에 그대로 둡니다.
2. 15mL 튜브에 PBS의 0.2% 경화제와 4% 29:1 아크릴아마이드:비스-아크릴아미드의 최종 농도로 하이드로겔 용액 5mL를 만듭니다. 반전으로 혼합하고 필터 살균합니다.
3. 냉장고에서 가래 샘플을 꺼낸 다음 메스로 멸균 상태에서 작은 부분(직경 약 5mm)으로 자릅니다.
   알림: 가래가 매우 유동적인 경우에도 이 단계를 수행할 수 있지만 메스를 사용하여 원하는 분획을 분리하기 전에 핀셋으로 보관 용액에서 가래를 제거하려면 더 많은 인내심과 연습이 필요합니다.
4. 절단된 객담 샘플을 8개의 챔버가 있는 커버글라스 슬라이드의 우물 안에 넣습니다.
5. 300단계에서 필터 멸균 하이드로겔 용액 2.2μL를 객담이 포함된 각 웰에 추가합니다.
6. 혐기성 팩이 들어 있는 밀폐된 용기 안에 8개의 챔버 커버글라스를 37°C에서 3시간 동안 보관합니다.
   알림: 일단 중합되면 가래가 내장된 하이드로겔은 단단한 겔의 농도여야 합니다.
7. 응고된 하이드로겔 객담 샘플을 pH 8의 8% 도데실 황산나트륨(SDS) 5mL가 들어 있는 15mL 배양 튜브로 옮기고 가래가 투명해질 때까지 37°C(흔들림 유무에 관계없이)에서 3-14일 동안 샘플을 투명하게 둡니다.
   알림: 청소 시간은 객담 성분에 따라 다르며 일반적으로 흔들면 줄일 수 있습니다. 그러나 샘플 무결성을 방해할 정도로 진탕 속도를 높이지 않도록 주의하십시오. DNA가 풍부한 샘플은 점액이 풍부한 샘플에 비해 투명화하는 데 더 오래 걸립니다.
8. 8% SDS 용액을 폐기물 수거 용기에 디캔팅합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 각 하이드로겔 포매 샘플을 멸균 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 50mL 코니컬 튜브 각각에 PBS 10mL를 추가하여 하이드로겔을 세척하고 용액을 30분에서 1시간 동안 그대로 두었다가 디캔팅합니다. 이것을 2배 더 반복하십시오.
   알림: 이 세척 단계에는 원심분리가 포함되지 않습니다. 과도한 체액과 상층액은 피펫으로 조심스럽게 제거합니다.
9. 세척된 시료를 0.01%(w/v)의 아지드화나트륨 및 1x RNase 억제제와 함께 4°C에서 PBS에 보관합니다.

3. 하이드로겔 형광 in situ hybridization (FISH) 프로토콜

1. 멸균 핀셋을 사용하여 보관 용액에서 하이드로겔 샘플을 제거하고 멸균 표면(예: 유리 슬라이드 또는 페트리 접시)에 샘플을 놓습니다.
2. 멸균 메스를 사용하여 하이드로겔을 ~ 1mm 두께로 자릅니다.
3. 하이드로겔 1mm 절편을 멸균 1.5mL 튜브 안에 넣습니다.
4. 1.5 mL 튜브에 1 mL 혼성 완충액 (25 % 포름 아미드, 0.9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7.6], 0.01 % SDS, 정제 및 탈 이온화 H₂O)을 준비합니다.
5. 형광 표지된 PseaerA 프로브(150.7nM¹²)를 혼성화 버퍼에 추가하고 반전으로 혼합합니다.
   알림: 포르말린 용액은 화염에서 멀리 떨어져 있어야 합니다. 혼성화 완충액은 고급으로 제조될 수 있고, -20°C에서 부분 표본으로 저장될 수^{있다 13}.
6. 하이드로겔의 각 ~1mm 섹션에 200-500μL의 혼성화 완충액을 추가하고 하이드로겔 샘플 전체가 잠기도록 합니다.
7. PseaerA 프로브가 흔들리지 않고 46°C에서 ~ 18-24시간 동안 어둠 속에 두어 하이드로겔 샘플과 하이브리드화되도록 합니다.
8. 혼성화 완충액을 폐기물 수거 용기에 디캔팅합니다.
9. 필터 멸균 세척 완충액 (337.5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) [pH 7.2], 0.01 % SDS)로 샘플을 한 번 헹구고 1.5 mL 튜브 각각에 세척 완충액 1mL를 첨가하여 정제 및 탈 이온화 된 H₂O)를 제거한 다음 제거합니다.
   알림: 세척 버퍼는 미리 만들어 실온(RT)에서 보관할 수 있습니다.
10. 1mL의 신선한 세척 완충액을 튜브에 넣은 다음 어두운 곳에서 48°C에서 6시간 동안 흔들지 않고 샘플을 배양합니다.

4. 하이드로겔 및 Psl0096 항체 결합

1. 1mL 피펫터를 사용하여 세척 버퍼를 멸균 상태로 제거합니다.
2. 2% BSA 용액 1mL를 추가 및 제거하여 PBS 용액에서 2% BSA(w/v)로 샘플을 헹굽니다.
3. 하이드로겔 샘플에 2% BSA/PBS 용액 500μL를 첨가하여 비특이적 단백질 결합을 차단합니다. 그런 다음 샘플을 밤새 어두운 곳에서, 흔들지 않고 RT에서 배양합니다.
4. 1mL 피펫을 사용하여 차단 용액을 멸균 제거합니다.
5. 항체를 500μL의 신선한 2% BSA/PBS에 최종 농도 0.112μg/mL로 희석하여 Psl0096-Texas Red 항체 용액을 준비합니다.
6. 하이드로겔 샘플에 500μL 항체 용액을 추가하고 흔들리지 않고 빛으로부터 보호된 상태에서 실온에서 6시간 동안 배양합니다.

5. DAPI(4′,6′-diamidino-2-phenylindole) 염색

1. 자기 교반 막대가 들어 있는 플라스크에 비이온 밀도 그래디언트 배지 40g, Tween20 30μL, 아지드화나트륨 3μg, PBS 30mL를 첨가하여 굴절률 매칭 용액(RIMS)을 준비합니다. 용액을 자석 교반기에서 15분 동안 또는 완전히 녹을 때까지 저어줍니다.
2. 10mL 주사기와 멸균 0.2μm 필터를 사용하여 용액을 50mL 원뿔형 튜브로 필터 멸균합니다.
   참고: 용액은 4°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
3. 멸균 1mL 피펫으로 Psl0096-Texas Red 항체 용액을 제거합니다.
4. 하이드로겔 샘플을 헹구고 PBS 1mL를 추가한 다음 제거합니다.
5. 하이드로겔 샘플을 250μL의 RIMS 용액과 10μg/mL의 DAPI로 RT에서 어둠 속에서 밤새 부드럽게 흔들어 배양합니다.
6. 컨포칼 이미징 전에 샘플을 0.9mm 또는 1.7mm 관류 챔버에 장착하고 유리 커버슬립으로 밀봉합니다.
   참고: FISH 및/또는 면역조직화학 검사 후 RIMS에 담그기 전, 객담 점액의 시각화가 필요한 경우 형광 렉틴 염색을 적용할 수 있다¹².

6. 이미징

1. 표준 기술을 사용하여 25x, 40x, 63x 또는 100x 배율에서 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 이미징을 수행합니다.

결과

실험의 전체 설계는 그림 1 과 그림 2에 요약되어 있습니다. 그림 1 은 객담 처리 및 객담 제거 프로토콜에 대한 요약을 제공합니다. 객담 처리 및 청소에는 최대 17일이 소요될 수 있습니다. 그러나 프로토콜은 중단될 수 있으며 샘플은 PFA 고정 후(2일) 또는 조직 투명화 후(투명 시간에 따라 5-17일) 보관할 수 있습니다.

토론

이 프로토콜의 목적은 CF 환자의 객담에서 녹농균 세포의 현장 조직을 엿볼 수 있도록 하는 것입니다. 객담 샘플은 즉시 고정할 수 없는 경우 처리할 때까지 4°C에서 보관해야 합니다. 객담 내 녹농균(P. aeruginosa) 세포 수는 4°C에서 보관할 때 1시간, 24시간 또는 48시간에 처리하면 크게 변하지 않지만, 25°C에서 24시간 또는 48시간 동안 방치하면 박테리아 성장의 결과로 박테리아 세포 수...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution	BioRad	161-0146
8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek	ThermoFischer Scientific	155411
Anaerogen2.5L	Oxid Inc.	35108
Coverwell perfusion chambers	Electron Microscopry Sciences	70326 -12/-14
HistoDenz	Sigma	D2158
Protect RNA Rnase Inhibitor	Sigma	R7387
PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC	Eurofins		Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry)
Psl0096-Texas Red	Medimmune		The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries.
VA-044 Hardener	Wako	27776-21-21