낭포성 섬유증 환자의 객담 내 녹농균의 시각화

요약

이 프로토콜은 낭포성 섬유증 환자의 객담 내에서 박테리아 세포 및 다당류 합성 위치(Psl) 다당류의 시각화 방법을 제공합니다.

초록

낭포성 섬유증 환자의 폐 내에서 녹농균을 조기에 발견하고 근절하면 만성 감염 발병 가능성을 줄일 수 있습니다. 만성 녹농균 감염의 발병은 폐 기능 저하 및 이환율 증가와 관련이 있습니다. 따라서 소아 환자의 약 10-40%에서 발생하는 항생제 요법으로 녹농균을 근절하지 못하는 이유를 밝히는 데 큰 관심이 있습니다. 녹농균(P. aeruginosa)의 숙주 청소율과 항생제 감수성에 영향을 미칠 수 있는 많은 요인 중 하나는 공간 조직(예: 응집 또는 생물막 형성) 및 다당류 생산의 변화입니다. 따라서 CF 환자의 객담 내에서 녹농균의 현장 특성을 시각화하는 데 관심이 있었습니다. 숙주 세포에 대한 3D 구조를 유지하기 위해 샘플을 하이드로겔 매트릭스에 삽입한 후 객담 샘플에 조직 투명화 기술을 적용했습니다. 조직 투명화 후 형광 라벨과 염료를 추가하여 시각화를 가능하게 했습니다. 박테리아 세포의 시각화를 위해 형광 in situ 교잡화를 수행하고, 외다당류의 시각화를 위해 형광 표지된 항-PSL 항체의 결합을 수행하고, 구조적 통찰력을 얻기 위해 숙주 세포를 염색하기 위한 DAPI 염색을 수행했습니다. 이러한 방법을 통해 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 통해 CF 환자의 객담 내 녹농균의 고해상도 이미징을 수행할 수 있었습니다.

서문

이 연구에서 실험은 소아 낭포성 섬유증(CF) 환자의 객담 내에서 녹농균의 생체 내 구조를 시각화하도록 설계되었습니다. 녹농균 감염은 소아 CF 인구의 30-40%에서 만성화됩니다. 만성 감염이 발생하면 제거가 거의 불가능합니다¹. 녹농균은 일반적으로 항균제에 더 취약하기 때문에 만성 감염을 예방하기 위해 항슈도몬 항생제로 치료한다². 안타깝게도, 모든 녹농균 분리가 항생제 치료 후 폐에서 효과적으로 제거되는 것은 아닙니다. 항생제 실패와 관련된 정확한 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 이전 연구에서는 생물막 세포 밀도, 응집 및 다당류 생산의 변화가 항생제 효능에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었습니다³. 녹농균(P. aeruginosa)은 펠(Pel), 피슬(Psl), 알긴산(alginate)의 세 가지 세포외 다당류를 생산합니다⁴. 녹농균(P. aeruginosa)의 대부분의 균주는 각 외다당류를 발현할 수 있는 유전적 능력을 가지고 있지만, 종종 한 종류의 다당류가 주로 발현된다⁵

프로토콜

연구 윤리 위원회(REB)의 승인은 인간 피험자로부터 객담 샘플을 수집하고 보관하는 데 필요합니다. 본 연구에 제시된 연구는 Hospital for Sick Children REB#1000058579의 승인을 받았습니다.

1. 객담 채취

1. 객담을 멸균 채취 컵에 보관하고 즉시 4°C에서 최대 24시간 동안 보관한 후 고정합니다.
   알림: 가래를 고정하지 않고 4°C에서 너무 오래 방치하면 세포 분해, 특히 백혈구 분해가 발생할 수 있습니다. 가능한 한 빨리 고정하는 것이 좋습니다.
2. 객담 검체를 멸균된 15mL 튜브로 옮깁니다.
3. 객담 샘플에 동일한 부피의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 추가합니다. 예를 들어, 객담 샘플이 0.5mL인 경우 0.5mL의 4% PFA를 추가합니다. 부드러운 반전으로 섞는다.
4. 4 °C에서 밤새 가래를 배양합니다.
5. 고정 객담 2mL 각각에 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가하여 샘플을 세척합니다.
   알림: 이 세척 단계에는 원심분리가 필요하지 않습니다.
6. 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
   알림: 팁을 가래에서 멀어지게 하여 피펫으로 가래를 빨아들이지 말고 표면 액체에서 매우 천천히 흡인....

결과

실험의 전체 설계는 그림 1 과 그림 2에 요약되어 있습니다. 그림 1 은 객담 처리 및 객담 제거 프로토콜에 대한 요약을 제공합니다. 객담 처리 및 청소에는 최대 17일이 소요될 수 있습니다. 그러나 프로토콜은 중단될 수 있으며 샘플은 PFA 고정 후(2일) 또는 조직 투명화 후(투명 시간에 따라 5-17일) 보관할 수 있습니다.

토론

이 프로토콜의 목적은 CF 환자의 객담에서 녹농균 세포의 현장 조직을 엿볼 수 있도록 하는 것입니다. 객담 샘플은 즉시 고정할 수 없는 경우 처리할 때까지 4°C에서 보관해야 합니다. 객담 내 녹농균(P. aeruginosa) 세포 수는 4°C에서 보관할 때 1시간, 24시간 또는 48시간에 처리하면 크게 변하지 않지만, 25°C에서 24시간 또는 48시간 동안 방치하면 박테리아 성장의 결과로 박테리아 세포 수.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution	BioRad	161-0146
8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek	ThermoFischer Scientific	155411
Anaerogen2.5L	Oxid Inc.	35108
Coverwell perfusion chambers	Electron Microscopry Sciences	70326 -12/-14
HistoDenz	Sigma	D2158
Protect RNA Rnase Inhibitor	Sigma	R7387
PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC	Eurofins		Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry)
Psl0096-Texas Red	Medimmune		The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries.
VA-044 Hardener	Wako	27776-21-21