Visualisation de Pseudomonas aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de fibrose kystique

Résumé

Ce protocole fournit des méthodes de visualisation des cellules bactériennes et du polysaccharide du locus de synthèse des polysaccharides (Psl) dans les expectorations des patients atteints de fibrose kystique.

Résumé

La détection précoce et l’éradication de Pseudomonas aeruginosa dans les poumons des patients atteints de fibrose kystique peuvent réduire le risque de développer une infection chronique. Le développement d’infections chroniques à P. aeruginosa est associé à un déclin de la fonction pulmonaire et à une augmentation de la morbidité. Par conséquent, il y a un grand intérêt à élucider les raisons de l’échec de l’éradication de P. aeruginosa par l’antibiothérapie qui se produit chez environ 10 à 40% des patients pédiatriques. L’un des nombreux facteurs qui peuvent influer sur la clairance de l’hôte de P. aeruginosa et la sensibilité aux antibiotiques est les variations de l’organisation spatiale (comme l’agrégation ou la formation de biofilm) et la production de polysaccharides. Par conséquent, nous nous sommes intéressés à visualiser les caractéristiques in situ de P. aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose. Une technique d’élimination des tissus a été appliquée aux échantillons d’expectorations après avoir intégré les échantillons dans une matrice d’hydrogel afin de conserver les structures 3D relatives aux cellules hôtes. Après le nettoyage des tissus, des étiquettes fluorescentes et des colorants ont été ajoutés pour permettre la visualisation. L’hybridation in situ par fluorescence a été réalisée pour la visualisation des cellules bactériennes, la liaison d’anticorps anti-Psl marqués par fluorescence pour la visualisation de l’exopolysaccharide et la coloration DAPI à la coloration des cellules hôtes afin d’obtenir des informations structurelles. Ces méthodes ont permis d’obtenir une imagerie à haute résolution de P. aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose par microscopie confocale à balayage laser.

Introduction

Dans cette étude, des expériences ont été conçues pour visualiser la structure in vivo de Pseudomonas aeruginosa dans les expectorations de patients pédiatriques atteints de fibrose kystique (FK). Les infections à P. aeruginosa deviennent chroniques chez 30 à 40 % de la population pédiatrique atteinte de mucoviscidose ; Une fois que les infections chroniques se sont établies, il est presque impossible de les éliminer¹. Les isolats de P. aeruginosa provenant de patients atteints d’une infection précoce sont généralement plus sensibles aux antimicrobiens, par conséquent, ceux-ci sont traités avec des antibiotiques anti-pseudomonaux pour prévenir l’établissement d’une infection chronique². Malheureusement, tous les isolats de P. aeruginosa ne sont pas efficacement éliminés des poumons après une antibiothérapie. Les mécanismes précis associés à l’échec des antibiotiques n’ont pas été entièrement élucidés. Des études antérieures ont montré que les variations de la densité cellulaire du biofilm, de l’agrégation et de la production de polysaccharides peuvent affecter l’efficacité des antibiotiques³. P. aeruginosa produit trois polysaccharides extracellulaires : Pel, Psl et alginate⁴. La plupart des souches de P. aeruginosa ont la capacité génétique d’exprimer chacun des exopolysaccharides, bien que souvent un type de polysaccharide soit exprimé principalement⁵. L’exopolysaccharide alginate est associé à des infections chroniques dans le poumon de la mucoviscidose, ce qui entraîne un phénotype mucoïde ^6,7. Les polysaccharides Pel et Psl ont de multiples fonctions, notamment l’aide à la fixation initiale et au maintien de la structure du biofilm, et l’octroi d’une résistance aux antibiotiques⁸.

Des méthodes visant à visualiser les structures in vivo des tissus ont été développées pour une variété de types d’échantillons 9,10,11. Plus récemment, ils ont été adaptés pour visualiser in vivo les communautés microbiennes dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose¹². L’optimisation d’un protocole de nettoyage tissulaire spécifiquement pour l’identification des communautés microbiennes dans les expectorations a été développée par DePas et al., 2016¹². Le terme MiPACT, qui signifie identification médicaleaprès la t echnique CLARITY Passive, a été inventé pour l’élimination des expectorations de la mucoviscidose^11,12. Pour les techniques de nettoyage des tissus, les échantillons sont d’abord fixés, puis rendus transparents tout en laissant leur architecture inhérente intacte pour la coloration et la visualisation microscopique¹¹. La fixation et l’élimination des échantillons d’expectorations de mucoviscidose permettent aux chercheurs de répondre à des questions liées à la structure du biofilm, à la densité cellulaire bactérienne, aux associations polymicrobiennes et aux associations entre les agents pathogènes et les cellules hôtes. L’avantage d’examiner directement les bactéries qui ont été préservées dans les expectorations est qu’elles peuvent être analysées et visualisées dans un contexte spécifique à l’hôte. Bien que la croissance in vitro d’isolats cliniques en laboratoire à des fins d’expérimentation puisse être très instructive, de telles méthodes ne sont pas en mesure de recréer complètement l’environnement pulmonaire de la mucoviscidose, ce qui entraîne un décalage entre les résultats de laboratoire et les résultats pour les patients.

Les méthodes présentées ici peuvent être utilisées pour réparer et éliminer les expectorations afin de visualiser les bactéries, qu’elles proviennent de patients atteints de mucoviscidose ou de patients atteints d’autres infections respiratoires. Le type spécifique de coloration et d’analyse microscopique décrit ici est l’hybridation in situ par fluorescence (FISH), suivie d’une liaison anti-anticorps Psl dans l’hydrogel, et d’une analyse ultérieure par microscopie confocale à balayage laser (CLSM). Après le nettoyage des tissus, d’autres méthodes d’immunohistochimie et de microscopie peuvent également être appliquées.

Protocole

L’approbation du Comité d’éthique de la recherche (CÉR) est requise pour prélever et conserver des échantillons d’expectorations prélevés sur des sujets humains. Les études présentées ici ont été approuvées par le CER#1000058579 de l’Hôpital pour enfants malades.

1. Collecte des expectorations

1. Conservez les expectorations dans un gobelet de collecte stérile et conservez-les immédiatement à 4 °C pendant un maximum de 24 h avant la fixation.
   REMARQUE : Laisser les expectorations trop longtemps à 4 °C sans fixation peut entraîner une dégradation cellulaire, en particulier la dégradation des globules blancs. La fixation le plus tôt possible est préférable.
2. Transférez les échantillons d’expectorations dans un tube stérile de 15 ml.
3. Ajouter un volume égal de 4 % de paraformaldéhyde (PFA) aux échantillons d’expectorations. Par exemple, si l’échantillon d’expectoration est de 0,5 mL, ajoutez 0,5 mL de PFA à 4 %. Mélanger par inversion douce.
4. Incuber les expectorations pendant la nuit à 4 °C.
5. Lavez l’échantillon en ajoutant 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à chaque 2 mL d’expectorations fixes.
   REMARQUE : Aucune centrifugation n’est requise pour cette étape de lavage.
6. Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette.
   REMARQUE : Évitez d’aspirer les expectorations avec la pipette en pointant l’embout loin des expectorations et aspirez très lentement le liquide de surface. L’étape de lavage n’implique pas de centrifugation pour ne pas perturber l’intégrité structurelle des bouchons d’expectoration.
7. Répétez les étapes 1.6 à 1.7 deux fois de plus.
8. Remettre la pastille en suspension dans 2 fois le volume de PBS avec 0,01 % (p/v) d’azoture de sodium.
9. Conservez les expectorations à 4 °C.

2. Traitement MiPACT (technique de nettoyage des tissus) des expectorations

1. Dégazer les composants de l’hydrogel (30 % d’acrylamide 29 :1 : bis-acrylamide, durcisseur et PBS) dans un récipient hermétique contenant une compresse anaérobie pendant 72 h.
   REMARQUE : Le pack anaérobie et le récipient scellé sont nécessaires car l’oxygène inhibe la polymérisation de l’acrylamide. Alternativement, l’oxygène peut être éliminé en effectuant cette étape dans une hotte anaérobie, en appliquant un vide dans un récipient scellé ou en faisant bouillonner du gaz N₂ à travers le mélange d’acrylamide.
   1. Ajouter 2 mL d’une solution d’acrylamide :bis-acrylamide 29 :1 à 30 % dans un tube de 15 mL avec le bouchon retiré à l’intérieur du récipient anaérobie scellé.
   2. Préparez un bouillon concentré de durcisseur à 10 % (p/v) en ajoutant 0,5 g de durcisseur à 5 mL de PBS dans un tube de 15 mL. Laissez le bouchon hors du tube et rangez-le dans le récipient anaérobie scellé.
   3. Laissez quelques ml de PBS stérile dans un tube, sans bouchon, à l’intérieur du récipient anaérobie.
2. Préparer une solution de 5 mL d’hydrogel avec une concentration finale de 0,2 % de durcisseur et de 4 % d’acrylamide 29 :1 : bis-acrylamide dans du PBS dans un tube de 15 mL. Mélanger par inversion et filtrer stériliser.
3. Retirez les échantillons d’expectorations du réfrigérateur, puis coupez-les en petites sections (environ 5 mm de diamètre) dans des conditions stériles avec un scalpel.
   REMARQUE : Si les expectorations sont assez fluides, cette étape peut toujours être effectuée, cependant, il faut une patience et une pratique accrues pour retirer les expectorations de la solution de stockage avec une pince à épiler avant d’utiliser le scalpel pour séparer les fractions souhaitées.
4. Placez les échantillons d’expectorations coupés à l’intérieur d’un puits d’une lame de verre de protection à 8 chambres.
5. Ajouter 300 μL de solution d’hydrogel stérilisée par filtre de l’étape 2.2 dans chacun des puits contenant des expectorations.
6. Placez le verre de protection à 8 chambres à l’intérieur d’un récipient hermétique contenant un pack anaérobie pendant 3 h à 37 °C.
   REMARQUE : Une fois polymérisé, l’hydrogel avec des expectorations incrustées doit avoir la consistance d’un gel ferme.
7. Transférez les échantillons d’expectorations d’hydrogel solidifié dans un tube de culture de 15 mL contenant 5 mL de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 8 %, pH 8, et laissez les échantillons s’éclaircir pendant 3 à 14 jours à 37 °C (avec ou sans secousse), jusqu’à ce que les expectorations deviennent transparentes.
   REMARQUE : Les temps d’élimination dépendent de la composition des expectorations et peuvent généralement être diminués en agitant. Cependant, veillez à ne pas augmenter la vitesse d’agitation au point de perturber l’intégrité de l’échantillon. Les échantillons plus riches en ADN prennent plus de temps à effacer que les échantillons riches en mucus.
8. Décanter la solution de SDS à 8 % dans un conteneur de collecte des déchets. À l’aide d’une pince à épiler stérile, transférez chaque échantillon enrobé d’hydrogel dans un tube conique stérile de 50 ml. Ajouter 10 mL de PBS dans chacun des tubes coniques de 50 mL pour laver les hydrogels et laisser reposer la solution pendant 30 min à 1 h avant de décanter. Répétez cette opération 2 fois de plus.
   REMARQUE : Cette étape de lavage n’implique pas de centrifugation. L’excès de liquide et le surnageant sont soigneusement éliminés à l’aide d’une pipette.
9. Conservez les échantillons lavés dans du PBS avec de l’azoture de sodium à 0,01 % (p/v) et 1x inhibiteur de la RNase à 4 °C.

3. Protocole d’hybridation in situ fluorescente à l’hydrogel (FISH)

1. Retirez les échantillons d’hydrogel de leur solution de stockage à l’aide d’une pince à épiler stérile et placez-les sur une surface stérile (comme une lame de verre ou une boîte de Pétri).
2. À l’aide d’un scalpel stérile, coupez les hydrogels en tranches de ~ 1 mm d’épaisseur.
3. Placez les sections d’hydrogel de 1 mm dans des tubes stériles de 1,5 ml.
4. Préparer 1 mL de tampon d’hybridation (formamide à 25 %, NaCl à 0,9 M, Tris-HCl à 20 mM [pH 7,6], SDS à 0,01 %, H₂O purifié et déminéralisé) dans un tube de 1,5 mL.
5. Ajouter la sonde PseaerA marquée par fluorescence (150,7 nM¹²) dans le tampon d’hybridation et mélanger par inversion.
   REMARQUE : La solution de formol doit être tenue à l’écart d’une flamme nue. Le tampon d’hybridation peut être préparé à l’avance et stocké en aliquotes à -20 °C¹³.
6. Ajouter 200 à 500 μL de tampon d’hybridation à chaque section d’hydrogel de ~1 mm et s’assurer que la totalité de l’échantillon d’hydrogel est immergée.
7. Permettre à la sonde PseaerA de s’hybrider avec les échantillons d’hydrogel en les plaçant dans l’obscurité pendant ~ 18-24 h, à 46 °C, sans secouer.
8. Décanter le tampon d’hybridation dans un conteneur de collecte des déchets.
9. Rincez les échantillons une fois avec un tampon de lavage stérilisé par filtre (337,5 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 5 mM d’EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) [pH 7,2], 0,01 % de SDS et de H₂O purifié et déminéralisé) en ajoutant 1 mL de tampon de lavage dans chacun des tubes de 1,5 mL, puis retirez-le.
   REMARQUE : Le tampon de lavage peut être préparé à l’avance et stocké à température ambiante (RT).
10. Ajouter 1 mL de tampon de lavage frais dans les tubes, puis incuber les échantillons dans l’obscurité pendant 6 h à 48 °C, sans agiter.

4. Liaison à l’hydrogel et à l’anticorps Psl0096

1. Retirer stérilement le tampon de lavage à l’aide d’une pipette de 1 ml.
2. Rincer les échantillons avec un BSA à 2 % (p/v) dans une solution de PBS en ajoutant et en retirant 1 mL de la solution de BSA à 2 %.
3. Ajouter 500 μL de la solution BSA/PBS à 2 % aux échantillons d’hydrogel pour bloquer la liaison aux protéines non spécifiques. Ensuite, incubez les échantillons pendant la nuit, dans l’obscurité, à RT, sans secouer.
4. Retirer stérilement la solution bloquante à l’aide d’une pipette de 1 ml.
5. Préparer la solution d’anticorps Psl0096-Texas Red en diluant l’anticorps à une concentration finale de 0,112 μg/mL dans 500 μL de BSA/PBS frais à 2 %.
6. Ajouter la solution d’anticorps à 500 μL aux échantillons d’hydrogel et les incuber à RT pendant 6 h, à l’abri de la lumière, sans agitation.

5. Coloration DAPI (4′,6′-diamidino-2-phénylindole)

1. Préparer la solution d’adaptation de l’indice de réfraction (RIMS) en ajoutant 40 g de milieu à gradient de densité non ionique, 30 μL de Tween20, 3 μg d’azoture de sodium et 30 mL de PBS dans une fiole contenant une barre d’agitation magnétique. Remuez la solution pendant 15 minutes sur un agitateur magnétique ou jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute.
2. Filtrer Stériliser la solution dans un tube conique de 50 mL à l’aide d’une seringue de 10 mL et d’un filtre stérile de 0,2 μm.
   REMARQUE : La solution peut être conservée à 4 °C pendant plusieurs mois.
3. Retirez la solution d’anticorps Psl0096-Texas Red à l’aide d’une pipette stérile de 1 ml.
4. Rincez les échantillons d’hydrogel en ajoutant puis en retirant 1 mL de PBS.
5. Incuber les échantillons d’hydrogel avec 250 μL de solution RIMS et 10 μg/mL de DAPI à RT en agitant doucement, dans l’obscurité, pendant la nuit.
6. Avant l’imagerie confocale, montez les échantillons sur des chambres de perfusion de 0,9 mm ou 1,7 mm et scellez-les avec une lamelle en verre.
   REMARQUE : Après la FISH et/ou l’immunohistochimie et avant l’immersion dans le RIMS, des colorations fluorescentes de lectine peuvent être appliquées si la visualisation de la muqueuse des expectorations est souhaitée¹².

6. Imagerie

1. Effectuez une imagerie confocale de microscopie à balayage laser à l’aide de techniques standard à des grossissements de 25x, 40x, 63x ou 100x.

Résultats

La conception globale de l’expérience est résumée à la figure 1 et à la figure 2. La figure 1 résume les protocoles de traitement et d’élimination des expectorations. Le traitement et l’élimination des expectorations peuvent prendre jusqu’à 17 jours. Cependant, le protocole peut être arrêté et les échantillons peuvent être stockés après la fixation avec la PFA (jour 2) ou après le nettoyage des tissus (jours...

Discussion

L’objectif de ce protocole est de permettre d’avoir un aperçu de l’organisation in situ des cellules de P. aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose. Les échantillons d’expectorations doivent être conservés à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient traités s’ils ne peuvent pas être fixés immédiatement. Il a été démontré que le nombre de cellules de P. aeruginosa dans les expectorations ne change pas de manière significative s’il est traité à 1 h, 24...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution	BioRad	161-0146
8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek	ThermoFischer Scientific	155411
Anaerogen2.5L	Oxid Inc.	35108
Coverwell perfusion chambers	Electron Microscopry Sciences	70326 -12/-14
HistoDenz	Sigma	D2158
Protect RNA Rnase Inhibitor	Sigma	R7387
PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC	Eurofins		Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry)
Psl0096-Texas Red	Medimmune		The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries.
VA-044 Hardener	Wako	27776-21-21