מודל שבץ פוטוטרומבוטי מועשר בפיברין ורגיש ל-tPA

Summary

מודלים מסורתיים של שבץ פוטוטרומבוטי (PTS) גורמים בעיקר לצברי טסיות צפופים בעלי עמידות גבוהה לטיפול ליטי במפעיל פלסמינוגן רקמתי (tPA). כאן מוצג מודל PTS מורין שונה על ידי הזרקה משותפת של תרומבין וצבע רגיש לאור לצורך פוטואקטיבציה. מודל PTS משופר תרומבין מייצר קרישי טסיות מעורבים:פיברין והוא רגיש מאוד לפקקת tPA.

Abstract

מודל שבץ טרומבואמבולי אידיאלי דורש תכונות מסוימות, כולל הליכים כירורגיים פשוטים יחסית עם תמותה נמוכה, גודל אוטם עקבי ומיקום, משקעים של טסיות:פיברין קרישי דם מעורבים דומים לאלה בחולים, ורגישות נאותה לטיפול פיברינוליטי. מודל שבץ פוטוטרומבוטי מבוסס צבע ורד בנגל (RB) עונה על שתי הדרישות הראשונות, אך הוא עמיד מאוד לטיפול ליטי בתיווך tPA, ככל הנראה בשל הרכב הקריש העשיר בטסיות אך דל בפיברין. אנו סבורים כי שילוב של צבע RB (50 מ"ג/ק"ג) ומינון תת-טרומבוטי של תרומבין (80 U/kg) עבור פוטואקטיבציה המכוונת לענף הפרוקסימלי של עורק המוח האמצעי (MCA) עשוי לייצר קרישי דם מועשרים בפיברין ורגישים ל-tPA. ואכן, מודל הפוטוטרומבוזיס המשולב של טרומבין ו-RB (T+RB) גרם לקרישי דם מעורבים של טסיות דם:פיברין, כפי שמראים חיסונים ואימונובלוטים, ושמר על גדלים ומיקומים עקביים של אוטם בתוספת תמותה נמוכה. יתר על כן, הזרקה תוך ורידית של tPA (Alteplase, 10 מ"ג/ק"ג) תוך שעתיים לאחר הפוטואקטיבציה הפחיתה באופן משמעותי את גודל האוטם בפוטוטרומבוזיס T+RB. לפיכך, מודל שבץ פוטוטרומבוטי משופר טרומבין עשוי להיות מודל ניסיוני שימושי לבדיקת טיפולים טרומבוליטיים חדשניים.

Introduction

Endovascular thrombectomy ו- tPA-mediated thrombolysis הם שני הטיפולים היחידים שאושרו על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) לשבץ איסכמי חריף, אשר סובל ~ 700,000 חולים מדי שנה בארצות הברית¹. מכיוון שהיישום של טרומבקטומיה מוגבל לחסימת כלי דם גדולים (LVO), בעוד tPA-thrombolysis עשוי להקל על חסימות כלי דם קטנים, שניהם טיפולים יקרי ערך של שבץ איסכמי חריף². יתר על כן, השילוב של שני הטיפולים (למשל, התחלת tPA-thrombolysis בתוך 4.5 שעות מתחילת שבץ, ואחריו טרומבקטומיה) משפר את הרפרפוזיה ואת התוצאות התפקודיות³. לפיכך, אופטימיזציה של פקקת נותרה מטרה חשובה לחקר שבץ, גם בעידן של טרומבקטומיה.

מודלים טרומבואמבוליים הם כלי חיוני למחקר שבץ פרה-קליני שמטרתו לשפר טיפולים טרומבוליטיים. הסיבה לכך היא שמודלים מכניים של חסימת כלי דם (למשל, חסימת MCA בתפר תוך לומינלי) אינם מייצרים קרישי דם, וההתאוששות המהירה של זרימת הדם במוח לאחר הסרת החסימה המכנית היא אידיאליזציה מוגזמת ^4,5. נכון להיום, מודלים טרומבואמבוליים עיקריים כוללים פוטוטרומבוזיס ^6,7,8, כלוריד ברזל מקומי (FeCl₃) יישום⁹, מיקרו-הזרקה של תרומבין לענף MCA 10,11, הזרקת אקס ויו (מיקרו)אמבולי לתוך MCA או עורק התרדמה המשותף (CCA)12,13,14, והיפוקסיה איסכמיה חולפת (tHI)^{15,16, 17,18}. מודלים אלה של שבץ נבדלים זה מזה בהרכב ההיסטולוגי של קרישי הדם הבאים וברגישות לטיפולים ליטיים בתיווך tPA (טבלה 1). הם גם משתנים בדרישה הכירורגית של קרניוטומיה (דרושה להזרקת תרומבין באתרו וליישום מקומי של FeCl₃), עקביות גודל אוטם ומיקום (למשל, עירוי CCA של מיקרואמבולי מניב תוצאות משתנות מאוד), והשפעות גלובליות על מערכת הלב וכלי הדם (למשל, tHI מגביר את קצב הלב ואת תפוקת הלב כדי לפצות על התרחבות כלי דם היקפית הנגרמת על ידי היפוקסיה).

למודל שבץ פוטוטרומבוטי מבוסס צבע RB (PTS) יש תכונות אטרקטיביות רבות, כולל הליכים כירורגיים פשוטים ללא קרניוטומיה, תמותה נמוכה (בדרך כלל < 5%), וגודל ומיקום צפויים של אוטם (בשטח אספקת MCA), אך יש לו שתי מגבלות עיקריות. ⁸ האזהרה הראשונה היא תגובה חלשה עד אפסית לטיפול תרומבוליטי בתיווך tPA, שהוא גם חיסרון של FeCl₃ מודל ^7,19,20. האזהרה השנייה של מודלים של שבץ מוחי PTS ו- FeCl₃ היא שהטרומבי שנוצר כתוצאה מכך מורכב מאגרגטים צפופים של טסיות עם כמות קטנה של פיברין, אשר לא רק מובילים לעמידותו לטיפול tPA-lytic, אלא גם חורגים מהדפוס של טסיות מעורבות:תרומבי פיברין בחולי שבץ איסכמי חריף^21,22. לעומת זאת, מודל המיקרו-הזרקה באתרו כולל בעיקר פיברין פולימרי ותכולה לא ודאית של טסיות¹⁰.

בהתחשב בהנמקה לעיל, שיערנו כי תערובת של RB ומינון תת-טרומבוטי של תרומבין עבור פוטואקטיבציה ממוקדת MCA באמצעות גולגולת מדוללת עשויה להגדיל את מרכיב הפיברין בטרומבי שנוצר ולהגביר את הרגישות לטיפול ליטי בתיווך tPA. איששנו השערה ^זו,23 וכאן אנו מתארים הליכים מפורטים של מודל שבץ פוטוטרומבוטי שונה (T+RB).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

פרוטוקול זה מאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת וירג'יניה ועוקב אחר הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. איור 1A מתאר את רצף ההליכים הכירורגיים של פרוטוקול זה.

1. מערך הניתוח

1. הניחו כרית חימום עם טמפרטורה של 37°C על מתאם בעלי החיים הקטנים לפחות 15 דקות לפני הניתוח. הכינו גליל אטב לאף למתאם המאפשר סיבוב ראש החיה. הכינו את חומרי ההרדמה קטמין (60 מ"ג/ק"ג)/קסילזין (10 מ"ג/ק"ג).
2. לעקר את כלי הניתוח כולל מספריים, מלקחיים, מחזיקי מיקרו-מחט, המוסטטים, צמר גפן ותפרים עם autoclave (121 ° C ב 15 psi במשך 60 דקות). הכינו דבק רקמות ומשחת עיניים. הכינו את משקפת ההגנה מפני לייזר 532 ננומטר למנתחים.
   הערה: פרוטוקול זה מתאר הליך ניתוח הישרדות גדול ויש לבצע אותו בטכניקות אספטיות.
3. הגדר את מערכת התאורה עם מקור לייזר 532 ננומטר. הכינו מקדחה דנטלית.
4. הכינו את תמיסת רוז בנגל במי מלח (10 מ"ג/מ"ל). מניחים תרומבין בקר aliquot (0.1 U/μL) על דלי קרח.
5. הזריקו קטופרופן (4.0 מ"ג/ק"ג) תת עורית לעכבר כמשכך כאבים 30 דקות לפני הניתוח או השתמשו במשטר משככי הכאבים המומלץ על ידי ההנחיות המוסדיות המקומיות.

2. קשירת עורק התרדמה המשותף ipsilateral

1. מרדימים עכברי C57BL/6NCrl זכרים בני 10-14 שבועות במשקל 22 עד 30 גרם על ידי הזרקה תוך שרירית של קטמין (60 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג).
   הערה: ההליך הכירורגי כולו, המקיף את קשירת עורק התרדמה המשותף האיפסילטרלי באמצעות ניטור זרימת הדם במוח, צפוי להימשך ~ 120 דקות. משטר ההרדמה יהיה יעיל בדרך כלל למשך כל הזמן הזה, אך יש להעריך מחדש את עומק ההרדמה לפחות כל 15 דקות. תוך כדי לימוד נהלים אלה, ייתכן שיהיה צורך במינון מחדש של ההרדמה.
2. בצע צביטה בבוהן כדי לוודא שבעל החיים מורדם לחלוטין. הסר את השיער על הצוואר השמאלי עבור קשירת CCA ואת הראש עבור גולגולת דילול עם קרם הסרת שיער.
3. הניחו את העכבר על מתאם בעלי החיים הקטנים במצב שכיבה. לעקר את אזור הניתוח על ידי ניגוב העור עם שלוש החלקות לסירוגין של פובידון-יוד ו -70% אתנול.
4. אבטחו את ראש העכבר באמצעות אוזניות. תחת מיקרוסקופ מנתח, יש לבצע חתך שמאלי-צווארי בקוטר 0.5 ס"מ באמצעות זוג מיקרו-מספריים ומלקחיים ישרים ברוחב של כ-0.2 ס"מ לקו האמצע.
5. השתמשו בזוג מלקחיים משוננים עדינים כדי לפרק את הרקמה הרכה ואת הפאשיה כדי לחשוף את עורק התרדמה המשותף השמאלי (LCCA). יש להפריד בזהירות את ה-CCA השמאלי מהעצב הווגאלי באמצעות זוג מלקחיים עדינים וחלקים.
6. מניחים תפר קבוע בעל קשר כפול סביב LCCA באמצעות תפר משי 5-0 חתוך למקטעים של 20 מ"מ, ולאחר מכן סוגרים את הפצע באמצעות אטבי פצע סטריליים.

3. דילול גולגולת מעל ענף MCA ופוטואקטיבציה

1. הפוך את העכבר למצב נוטה על מתאם בעלי החיים הקטנים. סובבו את גליל האטב לאף ל-15°. לעקר את אזור הניתוח על ידי ניגוב העור עם שלוש החלקות לסירוגין של betadine ו 70% אתנול.
2. בצעו חתך של 0.8 ס"מ בקרקפת באמצעות זוג מיקרו-מספריים ומלקחיים ישרים לאורך עין שמאל ואוזן כדי לחשוף את שריר הרקתי, שנמצא בין העין לאוזן (איור 1B).
3. תחת המיקרוסקופ המנתח מבצעים חתך של 0.5 ס"מ לאורך קצה שריר הטמפורליס בעצם הקודקודית השמאלית על ידי זוג מלקחיים משוננים עדינים. בצע חתך אנכי שני של 0.3 ס"מ בשריר טמפורליס על ידי מספריים מיקרו. משכו את השריר הרקתי כדי לחשוף את קצה העצם הקודקודית ואת עצם הקשקש. הקפידו לדמיין את נקודת הציון של התפר העטרתי בין העצמות הקדמיות והקודקודיות (איור 1B,C).
4. לחות הגולגולת על ידי מריחת מי מלח סטריליים כדי לחשוף את ה-MCA השמאלי. סמן את ענף MCA הפרוקסימלי על עצם הקשקש בעט טוש. ציירו בעדינות עיגול בקוטר של כ-1 מ"מ המקיף את האזור המסומן עם מקדח שיניים פנאומטי (קביעת מהירות בור ב-50% מבקר המהירות), ולאחר מכן דקלו את הגולגולת בעומק של כ-0.2 מ"מ מבלי לגעת מתחת לדורה. מפסיקים את הקידוח עד שנשארת שכבה דקה מאוד של עצם.
5. ערבבו את תמיסת התרומבין (T, 0.1 U/μL, 80 U/kg) ואת תמיסת Rose bengal (RB, 10 מ"ג/מ"ל, 50 מ"ג/ק"ג) בהתבסס על משקל גוף העכבר. לדוגמה, עבור עכבר של 25 גרם משקל גוף, לערבב 20 μL של תרומבין (0.1 U / μL) ו 125 μL של RB (10 מ"ג / מ"ל).
6. הזריקו באיטיות תמיסת T+RB (145 מיקרוליטר לכל 25 גרם משקל גוף) לתוך הסינוס הרטרו-אורביטלי בעזרת מזרק אינסולין (מחט #31G).
   הערה: בניסויי פיילוט, שיעור התמותה של מינונים הולכים וגדלים של תרומבין מעורבב עם המינון הסטנדרטי של צבע RB (50 מ"ג / ק"ג) נבדק עבור photoactivation. התמותה הייתה 0% עבור תרומבין 80 U/kg (n=13), 43% עבור תרומבין 120 U/kg (n=7), ו-100% עבור תרומבין 160 U/kg (n = 5) ו- 200 U/kg thrombin (n = 5). לכן נבחרה מנה של 80 U/kg טרומבין לדגם זה. הדמיית חוזה כתמי לייזר שימשה גם כדי לשלול את האפשרות של קרישת דם משתוללת ליד חלל המסלול לאחר הזרקת סינוס רטרו-אורביטלית של T+RB (איור משלים 1), כמו גם שקיעת פיברין נרחבת בהמיספרה הנגדית שלא הייתה נתונה להארה בלייזר (איור משלים 2).
7. יש למרוח משחת עיניים על שתי העיניים למניעת יובש.
8. החל את התאורה עם אור לייזר 532 ננומטר (עם אנרגיה של 0.5 mW) באתר שנקדח במרחק של 2 אינץ 'למשך 20 דקות. דמיינו את התאורה על הענף הפרוקסימלי של MCA באמצעות משקפת הגנה מפני לייזר (איור 1, C,D).
   הערה: MCA עם תאורה של 532 ננומטר מראה פלואורסצנטיות אדומה מתחת למשקפת. ה-MCA הדיסטלי ייעלם לאחר הארה של 10 דקות. אין לכלול את בעל החיים אם זרימת ה-MCA הדיסטלית עדיין קיימת לאחר הארה של 20 דקות.
9. הפסק את תאורת הלייזר לאחר 20 דקות. סגור את הפצע עם אטבי פצע סטריליים.

4. הדמיה תוך חיונית (אופציונלית)

הערה: כדי לאפיין את היווצרות הפקקת in-vivo, השתמש בהדמיה תוך ויראלית על ידי קונפוקל דיסק ספין עם מערכת פוטואקטיבציה²³.

1. צור חלון גולגולתי ~ 3 מ"מ בקוטר על עצם הקודקוד של הגולגולת.
2. הניחו כוסית כיסוי על חלון הגולגולת ואתרו את ה-MCA הדיסטלי (~ 50 מיקרומטר קוטר) תחת יעד טבילה במים פי 20.
3. יש לתייג את טסיות הדם במחזור הדם על ידי הזרקת וריד זנב של נוגדן אנטי-GPIbβ מצומד DyLight488-(0.1 מ"ג/ק"ג) 5 דקות לפני ההדמיה.
4. הזריקו את תמיסת התערובת של טרומבין (80 U/kg) ו-Rose bengal (50 מ"ג/ק"ג) על ידי רטרו-אורביטל 5 דקות לפני ההדמיה.
5. צלם את ה- MCA באמצעות מערכת לייזר 561 ננומטר עם קרן לייזר בקוטר 10 מיקרומטר והקלט את התמונה עד להיווצרות פקקת.

5. ניהול tPA

1. הניחו את בעל החיים המרדים על כרית חמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בנקודת הזמן שלאחר הפוטואקטיבציה שנבחרה, הרטיבו גזה עם ~ 45 מעלות צלזיוס מים חמים ועטפו אותה על הזנב למשך דקה.
2. הזריקו tPA אנושי רקומביננטי (10 מ"ג/ק"ג) דרך וריד הזנב עם 50% בולוס ו-50% במשך 30 דקות על ידי משאבת עירוי.
   הערה: למרות שהמינון הקליני של tPA רקומביננטי אנושי לטיפול בשבץ איסכמי חריף הוא 0.9 מ"ג/ק"ג, מינון גבוה יותר (10 מ"ג/ק"ג) משמש בדרך כלל במכרסמים כדי לפצות על תגובתיות tPA חוצת מינים מופחתת. כמו כן, עקבנו אחר הפרוטוקול הסטנדרטי של מתן tPA במודלים פרה-קליניים של שבץ, והשתמשנו ב-50% כבולוס וב-50% שהוחדרו דרך וריד הזנב במשך 30 ^דקות.24

6. ניטור זרימת הדם במוח (CBF)

הערה: כדי לאשר התאוששות CBF לאחר טיפול tPA, השתמש במערכת הדמיית ניגודיות לייזר דו-ממדית¹⁵ והקלט מיד לאחר פוטוטרומבוזיס (שלב 3.9) או ב -24 שעות לאחר טיפול tPA.

1. מניחים בעל חיים מורדם במצב נוטה ומבצעים חתך בקו האמצע בקרקפת כשהגולגולת חשופה.
2. לחות את הגולגולת עם מלוחים סטריליים בעדינות להחיל את ג'ל אולטרסאונד על הגולגולת. הימנע מכל שיער ובועה בג'ל, אשר יפריע את אות CBF.
3. עקוב אחר CBF בשתי ההמיספרות המוחיות תחת תמונת ניגודיות של נקודות לייזר במשך 10 דקות.
4. לאחר הקלטת תמונת CBF, סגור את הקרקפת עם דבק רקמות והחזיר את החיה לכלוב.
5. נתח CBF באזורים שנבחרו וחשב את אחוז ההתאוששות CBF בהשוואה לאזור נגדי.
6. לאחר מכן, החזירו את בעל החיים לכלוב חם להתאוששות. עקוב אחר העכברים במשך 5-10 דקות עד שהם מתאוששים מההרדמה. הניחו מזון רטוב בכלוב והחזירו למתקן לטיפול בבעלי חיים.
   הערה: ספק משככי כאבים לאחר ניתוח כפי שהומלץ על ידי ההנחיות המוסדיות המקומיות.

7. מדידת נפח Infarct על ידי צביעת triphenyl tetrazolium chloride (TTC)

1. עשרים וארבע שעות לאחר פוטוטרומבוזיס, יש להרדים את בעל החיים עמוקות בהתאם להנחיות המוסדיות המקומיות לניתוח שאינו הישרדותי.
   הערה: אנו נותנים tribromoethanol (avertin) 250 מ"ג / ק"ג באמצעות הזרקה intraperitoneal (IP).
2. בצע זילוח transcardial עם PBS, לאסוף מוח טרי להטביע 3% ג'ל אגר.
3. חתכו את פרוסת המוח בעובי 1 מ"מ על ידי ויברטום, ודגרו בתמיסת 2% TTC למשך 10 דקות.
4. כמת את נפח האוטם הכולל מ-6 פרוסות מוח כנפח המוחלט על ידי תוכנת ImageJ.
   הערה: בצקת במוח לא שימשה כמדידת תוצאה משתי סיבות. ראשית, כתם TTC מודד את כדאיות הרקמה (באמצעות פעילות הפחתת המיטוכונדריה) שהיא תוצאה חמורה יותר מאשר בצקת. שנית, ככל שהאוטם מתקדם, הן בצקת ואסוגנית והן בצקת ציטוטוקסית מתרחשות ולא ניתן להבחין בהן בקלות על ידי שיטות מדידת בצקת המוח הסטנדרטיות. אולם השתמשנו בתיוג אנטי-אימונוגלובין (IgG) כדי להעריך את שלמות מחסום הדם-מוח (BBB), ומצאנו אקסטרווסציה דומה של IgG לאחר 6 שעות לאחר פוטואקטיבציה הן במודלים של שבץ RB והן ב-T+RB (איור משלים 3).

8. מדידת היווצרות פקקת

הערה: כדי למדוד את היווצרות הפקקת, אסוף את המוח בשעה אחת ושעתיים לאחר פוטוטרומבוזיס למדידת פקקת ב- MCA על ידי אימונוכימיה (IHC) ולמדידת פיברין בהמיספרה של המוח על ידי אימונובלוט, בהתאמה.

1. ביצוע IHC לאפיון הרכב קרישי דם. תקן את המוח עם 4% paraformaldehyde במשך הלילה ולאחר מכן לייבש את המוח עם 30% סוכרוז עבור הטבעה OCT.
2. חתכו את המוח עם אוריינטציה סגיטלית בעובי 20 מיקרומטר, ובצעו את IHC עם נוגדנים ספציפיים נגד פיברינוגן, טסיות דם (גליקופרוטאין IIb), תאי דם אדומים (TER119) וכלי דם (איזולקטין GS-IB4).
3. בצע את המדידה של פיברין בחצי המוח על ידי immunoblot עם נוגדן נגד פיברינוגן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ראשית, השווינו את תכולת הפיברין ב-RB לעומת קרישי דם הנגרמים על-ידי T+RB כתוצאה מפוטוטרומבוזיס. עכברים הוקרבו על ידי זילוח טרנסקרדיאלי של מקבעים בשעה 2 לאחר הפוטואקטיבציה, ומוחות הוסרו לצורך צביעה אימונופלואורסצנטית של ענף MCA במישורים אורכיים ורוחביים. בפוטוטרומבוזיס RB, ענף ה-MCA היה עמוס בצפיפ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שבץ פוטוטרומבוטי RB מסורתי, שהוצג בשנת 1985, הוא מודל אטרקטיבי של איסכמיה מוחית מוקדית עבור הליכים כירורגיים פשוטים, תמותה נמוכה, ושחזור גבוה של אוטם מוחי. ⁵ במודל זה, הצבע הפוטודינמי RB מפעיל במהירות טסיות דם עם עירור אור, מה שמוביל לצברים צפופים החוסמים את כלי הדם ^5,8,23...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma	T8877	infarct
4-0 Nylon monofilament suture	LOOK	766B	surgical supplies
5-0 silk suture	Harvard Apparatus	624143	surgical supplies
543nm laser beam	Melles Griot	25-LGP-193-249	photothrombosis
adult male mice	Charles River	C57BL/6	10~14 weeks old (22~30 g)
Anesthesia bar for mouse adaptor	machine shop, UVA		surgical setup
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)	Sigma	T48402	euthanasia
Dental drill	Dentamerica	Rotex 782	surgical setup
Digital microscope	Dino-Lite	AM2111	brain imaging
Dissecting microscope	Olympus	SZ40	surgical setup
Fine curved forceps (serrated)	FST	11370-31	surgical instrument
Fine curved forceps (smooth)	FST	11373-12	surgical instrument
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488	Invitrogen	A11008	Immunohistochemistry
Halsted-Mosquito hemostats	FST	13008-12	surgical instrument
Heat pump with warming pad	Gaymar	TP700	surgical setup
infusion pump	KD Scientific	200	thrombolytic treatment
Insulin syringe with 31G needle	BD	328291	photothrombosis
Ketamine	CCM, UVA		anesthesia
Laser protective google 532nm	Thorlabs	LG3	photothrombosis
Ketoprofen	CCM, UVA		NSAID analgesia
micro needle holders	FST	12060-01	surgical instrument
micro scissors	FST	15000-03	surgical instrument
MoorFLPI-2 blood flow imager	Moor	780-nm laser source	Laser Speckle Contrast Imaging
Mouse adaptor	RWD	68014	surgical setup
Puralube Vet ointment	Fisher	NC0138063	eye dryness prevention
Retractor tips	Kent Scientific	Surgi-5014-2	surgical setup
Rose Bengal	Sigma	198250	photothrombosis
Thrombin	Sigma	T7513	photothrombosis
Tissue glue	Abbott Laboratories	NC9855218	surgical supplies
tPA	Genetech	Cathflo activase 2mg	thrombolytic treatment
Vibratome	Stoelting	51425	TTC infacrt
Xylazine	CCM, UVA		anesthesia