Fibrin ile zenginleştirilmiş ve tPA'ya duyarlı fototrombotik inme modeli

Özet

Geleneksel fototrombotik inme (PTS) modelleri esas olarak doku plazminojen aktivatörü (tPA) litik tedavisine karşı yüksek dirençli yoğun trombosit agregatlarını indükler. Burada, fotoaktivasyon için trombin ve ışığa duyarlı boyanın birlikte enjekte edilmesiyle modifiye edilmiş bir murin PTS modeli tanıtıldı. Trombin ile zenginleştirilmiş PTS modeli, karışık trombosit:fibrin pıhtıları üretir ve tPA-trombolizine karşı oldukça hassastır.

Özet

İdeal bir tromboembolik inme modeli, düşük mortaliteye sahip nispeten basit cerrahi prosedürler, tutarlı bir enfarktüs boyutu ve yeri, trombositin çökelmesi: hastalardakine benzer fibrin karışımlı kan pıhtıları ve fibrinolitik tedaviye yeterli duyarlılık gibi belirli özellikler gerektirir. Gül bengal (RB) boya bazlı fototrombotik inme modeli ilk iki gereksinimi karşılar, ancak muhtemelen trombosit açısından zengin, ancak fibrin açısından fakir pıhtı bileşimi nedeniyle tPA aracılı litik tedaviye oldukça dirençlidir. Orta serebral arterin (MCA) proksimal dalına yönelik fotoaktivasyon için RB boyası (50 mg/kg) ve subtrombotik trombin dozu (80 U/kg) kombinasyonunun fibrin ile zenginleştirilmiş ve tPA'ya duyarlı pıhtılar üretebileceğini düşünüyoruz. Gerçekten de, trombin ve RB (T + RB) kombine fototromboz modeli, immün boyama ve immünoblotlarla gösterildiği gibi karışık trombosit: fibrin kan pıhtılarını tetikledi ve tutarlı enfarktüs boyutları ve konumları ile düşük mortaliteyi korudu. Ayrıca, fotoaktivasyondan sonraki 2 saat içinde intravenöz tPA (Alteplaz, 10 mg/kg) enjeksiyonu, T+RB fototrombozunda enfarktüs boyutunu önemli ölçüde azalttı. Bu nedenle, trombin ile zenginleştirilmiş fototrombotik inme modeli, yeni trombolitik tedavileri test etmek için yararlı bir deneysel model olabilir.

Giriş

Endovasküler trombektomi ve tPA aracılı tromboliz, Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda ~ 700.000 hastayı etkileyen akut iskemik inmenin ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) onaylı iki tedavisidir¹. Trombektomi uygulaması büyük damar tıkanıklığı (LVO) ile sınırlı olduğundan, tPA-tromboliz küçük damar tıkanıklıklarını hafifletebildiğinden, her ikisi de akut iskemik inme için değerli tedavilerdir². Ayrıca, her iki tedavinin kombinasyonu (ör., inme başlangıcından sonraki 4.5 saat içinde tPA-trombolizin başlatılması, ardından trombektomi) reperfüzyonu ve fonksiyonel sonuçları iyileştirir³. Bu nedenle, trombolizi optimize etmek, trombektomi çağında bile inme araştırmaları için önemli bir hedef olmaya devam etmektedir.

Tromboembolik modeller, trombolitik tedavileri iyileştirmeyi amaçlayan klinik öncesi inme araştırmaları için önemli bir araçtır. Bunun nedeni, mekanik vasküler oklüzyon modellerinin (örneğin, intraluminal sütür MCA oklüzyonu) kan pıhtıları üretmemesi ve mekanik oklüzyonun çıkarılmasından sonra serebral kan akışının hızlı bir şekilde geri kazanılmasının aşırı derecede idealize edilmesidir ^4,5. Bugüne kadar, başlıca tromboembolik modeller arasında fototromboz ^6,7,8, topikal ferrik klorür (FeCl₃) uygulaması⁹, MCA dalına trombin mikroenjeksiyonu^10,11, MCA veya ortak karotis artere (CCA) ex vivo (mikro) emboli enjeksiyonu12,13,14 ve geçici hipoksi-iskemi (tHI)^{15,16, 17,18}. Bu inme modelleri, takip eden pıhtıların histolojik bileşimi ve tPA aracılı litik tedavilere duyarlılık açısından farklılık gösterir (Tablo 1). Ayrıca kraniotominin cerrahi gereksinimi (in situ trombin enjeksiyonu ve FeCl_3'ün topikal uygulaması için gereklidir), enfarktüs boyutunun ve yerinin tutarlılığı (ör., mikroembolinin CCA infüzyonu çok değişken sonuçlar verir) ve kardiyovasküler sistem üzerindeki küresel etkiler (örneğin, tHI, hipoksi kaynaklı periferik vazodilatasyonu telafi etmek için kalp atış hızını ve kalp debisini arttırır).

RB boya bazlı fototrombotik inme (PTS) modeli, basit kraniyotomi içermeyen cerrahi prosedürler, düşük mortalite (tipik olarak %5'<) ve öngörülebilir bir enfarktüs boyutu ve yeri (MCA sağlayan bölgede) dahil olmak üzere birçok çekici özelliğe sahiptir, ancak iki ana sınırlaması vardır. ⁸ İlk uyarı, aynı zamanda FeCl₃ modeli ^7,19,20'nin bir dezavantajı olan tPA aracılı trombolitik tedaviye zayıftan sıfıra yanıttır. PTS ve FeCl₃ inme modellerinin ikinci uyarısı, takip eden trombüslerin az miktarda fibrin içeren yoğun paketlenmiş trombosit agregatlarından oluşmasıdır, bu sadece tPA-litik tedaviye karşı direncine yol açmakla kalmaz, aynı zamanda akut iskemik inme hastalarında karıştırılmış trombosit:fibrin trombüs modelinden de sapar^21,22. Buna karşılık, in situ trombin-mikroenjeksiyon modeli esas olarak polimerize fibrin ve belirsiz bir trombosit içeriği^{içerir 10}.

Yukarıdaki mantık göz önüne alındığında, inceltilmiş kafatası yoluyla MCA hedefli fotoaktivasyon için RB ve sub-trombotik trombin dozunun karışımının, ortaya çıkan trombüsteki fibrin bileşenini artırabileceğini ve tPA aracılı litik tedaviye duyarlılığı artırabileceğini varsaydık. Bu hipotezi ^{doğruladık,23} ve burada modifiye (T+RB) fototrombotik inme modelinin ayrıntılı prosedürlerini açıklıyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu protokol, Virginia Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nu takip eder. Şekil 1A , bu protokolün cerrahi prosedürlerinin sırasını özetlemektedir.

1. Ameliyat kurulumu

1. Ameliyattan en az 15 dakika önce küçük hayvan adaptörünün üzerine 37 °C sıcaklık ayarlı bir ısıtma pedi yerleştirin. Hayvan kafasının dönmesine izin veren adaptör için bir burun klipsi rulosu hazırlayın. Anestezikleri hazırlayın Ketamin (60 mg / kg) / Ksilazin (10 mg / kg).
2. Makas, forseps, mikro iğne tutucular, kanama durdurucular, pamuklu çubuklar ve sütürler dahil olmak üzere cerrahi aletleri otoklavla sterilize edin (60 dakika boyunca 15 psi'de 121 °C). Doku tutkalı ve göz merhemi hazırlayın. Cerrahlar için 532 nm lazer koruma gözlüğünü hazırlayın.
   NOT: Bu protokol büyük bir sağkalım cerrahisi prosedürünü açıklar ve aseptik teknikler kullanılarak yapılmalıdır.
3. Aydınlatma sistemini 532 nm lazer kaynağıyla kurun. Bir diş matkabı hazırlayın.
4. Gül Bengal çözeltisini salin (10 mg / mL) içinde hazırlayın. Buz kovasına bir alikot sığır trombini (0.1 U / μL) yerleştirin.
5. Ketoprofen'i (4.0 mg / kg) ameliyattan 30 dakika önce analjezi olarak fareye deri altına enjekte edin veya yerel kurumsal kılavuzlar tarafından önerilen analjezik rejimi kullanın.

2. İpsilateral ortak karotis arterin bağlanması

1. 22 ila 30 g ağırlığındaki 10-14 haftalık erkek C57BL / 6NCrl farelerini kas içi Ketamin (60 mg / kg) ve Xylazine (10 mg / kg) enjeksiyonu ile uyuşturun.
   NOT: Serebral kan akışının izlenmesi yoluyla ipsilateral ortak karotis arterin bağlanmasını kapsayan tüm cerrahi prosedürün ~ 120 dakika sürmesi beklenmektedir. Anestezi rejimi tipik olarak tüm bu süre boyunca etkili olacaktır, ancak anestezik derinlik en az 15 dakikada bir yeniden değerlendirilmelidir. Bu prosedürleri öğrenirken anestezinin yeniden dozlanması gerekebilir.
2. Hayvanın tamamen uyuşturulduğundan emin olmak için ayak parmağınızı sıkıştırın. CCA ligasyonu için sol boyundaki kılları ve kafatası inceltme için baştaki tüyleri tüy dökücü kremle alın.
3. Fareyi sırtüstü pozisyonda küçük hayvan adaptörünün üzerine yerleştirin. Cildi üç alternatif povidon-iyot ve% 70 etanol ile silerek cerrahi alanı sterilize edin.
4. Fare kafasını kulak çubuklarını kullanarak sabitleyin. Diseksiyon mikroskobu altında, orta hattın yaklaşık 0,2 cm lateralinde bir çift mikro makas ve düz forseps kullanarak 0,5 cm'lik sol servikal insizyon yapın.
5. Sol ortak karotis arteri (LCCA) ortaya çıkarmak için yumuşak dokuyu ve fasyayı ayırmak için bir çift ince tırtıklı forseps kullanın. Bir çift ince düz forseps kullanarak sol CCA'yı vagal sinirden dikkatlice ayırın.
6. 20 mm'lik segmentler halinde kesilmiş 5-0 ipek sütür kullanarak LCCA'nın etrafına kalıcı bir çift düğümlü sütür yerleştirin ve ardından steril yara klipsleri kullanarak yarayı kapatın.

3. MCA dalının üzerinde kafatası incelmesi ve fotoaktivasyon

1. Fareyi küçük hayvan adaptörüne yüzüstü pozisyona çevirin. Burun klipsi rulosunu 15° döndürün. Cildi üç alternatif betadin ve% 70 etanol ile silerek cerrahi alanı sterilize edin.
2. Göz ile kulak arasında yer alan temporalis kasını ortaya çıkarmak için sol göz ve kulak boyunca bir çift mikro makas ve düz forseps kullanarak saçlı deride 0,8 cm'lik bir kesi yapın (Şekil 1B).
3. Diseksiyon mikroskobu altında, bir çift ince tırtıklı forseps ile sol parietal kemikte temporalis kasının kenarı boyunca 0.5 cm'lik bir kesi yapın. Mikro makasla temporalis kası üzerinde 0,3 cm'lik ikinci bir dikey kesi yapın. Parietal kemiğin ve skuamöz kemiğin kenarını ortaya çıkarmak için temporal kası geri çekin. Frontal ve parietal kemikler arasındaki koronal sütürün dönüm noktasını görselleştirdiğinizden emin olun (Şekil 1B,C).
4. Sol MCA'yı ortaya çıkarmak için steril salin uygulayarak kafatasını nemlendirin. Skuamöz kemikteki proksimal MCA dalını bir işaretleyici kalemle işaretleyin. Pnömatik diş matkabı ile işaretli alanı çevreleyen yaklaşık 1 mm çapında bir daire çizin (hız kontrol cihazının %50'sinde çapak hızı ayarı) ve ardından alt duraya dokunmadan kafatasını yaklaşık 0.2 mm derinliğinde inceltin. Çok ince bir kemik tabakası kalana kadar delmeyi durdurun.
5. Trombin (T, 0.1 U / μL, 80 U / kg) ve Gül bengal (RB, 10 mg / mL, 50 mg / kg) çözeltisini farenin vücut ağırlığına göre karıştırın. Örneğin, 25 g vücut ağırlığına sahip bir fare için 20 μL trombin (0.1 U / μL) ve 125 μL RB (10 mg / mL) karıştırın.
6. T + RB çözeltisini (25 g vücut ağırlığı başına 145 μL) bir insülin şırıngası (#31G iğnesi) ile retro-orbital sinüse yavaşça enjekte edin.
   NOT: Pilot deneylerde, standart RB boya dozu (50 mg / kg) ile karıştırılmış artan trombin dozlarının mortalite oranı fotoaktivasyon açısından incelenmiştir. Mortalite 80 U/kg trombin için %0 (n=13), 120 U/kg trombin için %43 (n=7) ve hem 160 U/kg (n=5) hem de 200 U/kg trombin (n=5) için %100 idi. Bu nedenle bu model için 80 U/kg'lık bir trombin dozu seçildi. Retro-orbital sinüs T+RB enjeksiyonundan sonra orbital boşluğun yakınında yaygın kan pıhtılaşması olasılığını dışlamak için lazer benek kasılma görüntüleme de kullanıldı (Ek Şekil 1) ve ayrıca lazer aydınlatmasına maruz kalmayan kontralateral hemisferde yaygın fibrin birikimi (Ek Şekil 2).
7. Kuruluğu önlemek için her iki göze de göz merhemi sürün.
8. Aydınlatıcıyı 532 nm lazer ışığıyla (0,5 mW enerji ile) delinmiş alana 2 inç mesafeyle 20 dakika boyunca uygulayın. MCA'nın proksimal dalındaki aydınlatmayı bir lazer koruma gözlüğü ile görselleştirin (Şekil 1C,D).
   NOT: 532 nm aydınlatmalı MCA, gözlüğün altında kırmızı floresan gösterir. Distal MCA, 10 dakikalık aydınlatmadan sonra kaybolacaktır. 20 dakikalık aydınlatmadan sonra distal MCA akışı hala mevcutsa hayvanı hariç tutun.
9. 20 dakika sonra lazer aydınlatmasını durdurun. Yarayı steril yara klipsleriyle kapatın.

4. İntravital görüntüleme (isteğe bağlı)

NOT: Trombüs oluşumunu in vivo olarak karakterize etmek için, fotoaktivasyon sistemi²³ ile bir spin-disk konfokal ile intraviral görüntüleme kullanın.

1. Kafatasının parietal kemiği üzerinde ~ 3 mm çapında bir kraniyal pencere yapın.
2. Kraniyal pencereye bir kapak camı yerleştirin ve distal MCA'yı (~ 50 μm çapında) 20x suya daldırma hedefinin altına yerleştirin.
3. Görüntülemeden 5 dakika önce DyLight488-konjuge anti-GPIbβ antikorunun (0.1 mg / kg) kuyruk damarı enjeksiyonu ile dolaşımdaki trombositi etiketleyin.
4. Trombin (80 U / kg) ve Rose bengal (50 mg / kg) karışım solüsyonunu görüntülemeden 5 dakika önce retro-orbital ile enjekte edin.
5. 10 μm çapında lazer ışını ile 561 nm lazer sistemi kullanarak MCA'yı fotoaktif hale getirin ve görüntüyü trombüs oluşana kadar kaydedin.

5. tPA yönetimi

1. Anestezi uygulanmış hayvanı 37 °C'lik ılık bir ped üzerine yerleştirin. Seçilen fotoaktivasyon sonrası zaman noktasında, bir gazlı bezi ~45 °C ılık suyla ıslatın ve 1 dakika boyunca kuyruğa sarın.
2. Rekombinant insan tPA'sını (10 mg / kg) infüzyon pompası ile 30 dakika boyunca% 50 bolus ve% 50 ile kuyruk damarından enjekte edin.
   NOT: Akut iskemik inme tedavisi için rekombinant insan tPA'sının klinik dozu 0.9 mg / kg olmasına rağmen, kemirgenlerde azalmış türler arası tPA reaktivitesini telafi etmek için daha yüksek bir doz (10 mg / kg) yaygın olarak kullanılır. Ayrıca, klinik öncesi inme modellerinde %50'sini bolus olarak ve %50'sini 30 dakika boyunca kuyruk damarından infüze ederek standart tPA uygulama protokolünü ^izledik.24

6. Serebral kan akışının izlenmesi (CBF)

NOT: tPA tedavisinden sonra CBF iyileşmesini doğrulamak için, iki boyutlu bir lazer benek kontrast görüntüleme sistemi¹⁵ kullanın ve fototrombozdan hemen sonra (adım 3.9) veya tPA tedavisinden 24 saat sonra kaydedin.

1. Anestezi uygulanmış hayvanı yüzüstü pozisyona getirin ve kafatası açıkta kalacak şekilde kafa derisinde orta hat kesisi yapın.
2. Kafatasını steril salinle nemlendirin ve ultrason jelini kafatasına nazikçe uygulayın. Jölede CBF sinyalini engelleyecek herhangi bir saç ve kabarcıktan kaçının.
3. CBF'yi her iki serebral hemisferde lazer benekli kontrast görüntüleyici altında 10 dakika boyunca izleyin.
4. CBF görüntüsünü kaydettikten sonra, kafa derisini doku yapıştırıcısı ile kapatın ve hayvanı kafese geri koyun.
5. Seçilen bölgelerde CBF'yi analiz edin ve kontralateral bölgeye kıyasla CBF iyileşme yüzdesini hesaplayın.
6. Ardından, hayvanı iyileşmesi için sıcak bir kafese geri koyun. Fareleri anesteziden kurtulana kadar 5-10 dakika izleyin. Islanan yiyecekleri kafese koyun ve hayvan bakım tesisine geri koyun.
   NOT: Yerel kurumsal kılavuzların önerdiği şekilde ameliyat sonrası analjezi sağlayın.

7. Trifenil tetrazolyum klorür (TTC) boyama ile enfarktüs hacmi ölçümü

1. Fototrombozdan yirmi dört saat sonra, hayatta kalmama cerrahisi için yerel kurumsal yönergelere göre hayvanı derinlemesine uyuşturun.
   NOT: Tribromoetanol (avertin) 250 mg/kg'ı intraperitoneal (IP) enjeksiyon yoluyla uyguluyoruz.
2. PBS ile transkardiyal perfüzyon gerçekleştirin, taze beyin toplayın ve% 3 agar jeli içine gömün.
3. Beyin dilimini 1 mm kalınlığında vibratom ile bölümlere ayırın ve% 2 TTC çözeltisinde 10 dakika inkübe edin.
4. ImageJ yazılımı ile 6 beyin diliminden toplam enfarktüs hacmini mutlak hacim olarak ölçün.
   NOT: Beyin ödemi iki nedenden dolayı sonuç ölçümü olarak kullanılmamıştır. İlk olarak, TTC boyası, ödemden daha ciddi bir sonuç olan doku canlılığını (mitokondriyal redüksiyon aktivitesi yoluyla) ölçer. İkincisi, enfarktüs ilerledikçe hem vazojenik hem de sitotoksik ödem oluşur ve standart beyin ödemi ölçüm yöntemleriyle kolayca ayırt edilemez. Bununla birlikte, kan-beyin bariyerinin (BBB) bütünlüğünü değerlendirmek için anti-immünoglobin (IgG) etiketlemesi kullandık ve hem RB hem de T + RB inme modellerinde fotoaktivasyondan 6 saat sonra karşılaştırılabilir IgG ekstravazasyonu bulduk (Ek Şekil 3).

8. Trombüs oluşumu ölçümü

NOT: Trombüs oluşumunu ölçmek için, immünokimya (IHC) ile MCA'da trombüs ölçümü için fototrombozdan 1 saat ve 2 saat sonra beyni toplayın ve immünoblot ile beyin hemisferinde fibrin ölçümü için sırasıyla.

1. Pıhtı kompozisyonunun karakterizasyonu için IHC'yi gerçekleştirin. Beyni gece boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve ardından OCT yerleştirme için beyni% 30 sükroz ile kurutun.
2. Beyni 20 μm kalınlığında sagital yönelimle bölümlere ayırın ve fibrinojen, trombosit (glikoprotein IIb), kırmızı kan hücresi (TER119) ve kan damarına (izolektin GS-IB4) karşı spesifik antikorlarla IHC'yi gerçekleştirin.
3. Fibrinojene karşı bir antikor ile immünoblot ile beyin yarımküresinde fibrin ölçümü yapın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

İlk olarak, RB ile T + RB fototrombozunun neden olduğu kan pıhtılarındaki fibrin içeriğini karşılaştırdık. Fareler, fotoaktivasyondan 2 saat sonra fiksatiflerin transkardiyal perfüzyonu ile sakrifiye edildi ve uzunlamasına ve enine düzlemlerde MCA dalının immünofloresan boyanması için beyinler çıkarıldı. RB fototrombozunda, MCA dalı yoğun olarak CD41⁺ trombositler ve az miktarda fibrin ile doluydu (Şekil 2A,C). Buna karşılık, T+RB fot...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

1985 yılında tanıtılan geleneksel RB fototrombotik inme, basit cerrahi prosedürler, düşük mortalite ve beyin enfarktüsünün yüksek tekrarlanabilirliği için çekici bir fokal serebral iskemi modelidir. ⁵ Bu modelde, fotodinamik boya RB, ışık uyarımı üzerine trombositleri hızla aktive eder ve kan damarını tıkayan yoğun agregalara yol açar ^5,8,23. Bununla birlikte, RB ile indüklenen...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma	T8877	infarct
4-0 Nylon monofilament suture	LOOK	766B	surgical supplies
5-0 silk suture	Harvard Apparatus	624143	surgical supplies
543nm laser beam	Melles Griot	25-LGP-193-249	photothrombosis
adult male mice	Charles River	C57BL/6	10~14 weeks old (22~30 g)
Anesthesia bar for mouse adaptor	machine shop, UVA		surgical setup
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)	Sigma	T48402	euthanasia
Dental drill	Dentamerica	Rotex 782	surgical setup
Digital microscope	Dino-Lite	AM2111	brain imaging
Dissecting microscope	Olympus	SZ40	surgical setup
Fine curved forceps (serrated)	FST	11370-31	surgical instrument
Fine curved forceps (smooth)	FST	11373-12	surgical instrument
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488	Invitrogen	A11008	Immunohistochemistry
Halsted-Mosquito hemostats	FST	13008-12	surgical instrument
Heat pump with warming pad	Gaymar	TP700	surgical setup
infusion pump	KD Scientific	200	thrombolytic treatment
Insulin syringe with 31G needle	BD	328291	photothrombosis
Ketamine	CCM, UVA		anesthesia
Laser protective google 532nm	Thorlabs	LG3	photothrombosis
Ketoprofen	CCM, UVA		NSAID analgesia
micro needle holders	FST	12060-01	surgical instrument
micro scissors	FST	15000-03	surgical instrument
MoorFLPI-2 blood flow imager	Moor	780-nm laser source	Laser Speckle Contrast Imaging
Mouse adaptor	RWD	68014	surgical setup
Puralube Vet ointment	Fisher	NC0138063	eye dryness prevention
Retractor tips	Kent Scientific	Surgi-5014-2	surgical setup
Rose Bengal	Sigma	198250	photothrombosis
Thrombin	Sigma	T7513	photothrombosis
Tissue glue	Abbott Laboratories	NC9855218	surgical supplies
tPA	Genetech	Cathflo activase 2mg	thrombolytic treatment
Vibratome	Stoelting	51425	TTC infacrt
Xylazine	CCM, UVA		anesthesia